劉伯玉，羅婉蓉*，陳 振，余冬陽，高 越， 朱 禹，洪 穎,2，楊 莉，柳 燕

斑點(diǎn)熱(spotted fever, SF)是由斑點(diǎn)熱群立克次體(spotted fever group rickettsiae, SFGR)引起的一組以急性發(fā)熱和皮疹為主要臨床癥狀的疾病的總稱，主要包括：落磯山斑點(diǎn)熱、日本斑點(diǎn)熱、北亞熱、昆士蘭熱等，是一種自然疫源性疾病，分布范圍廣且人群普遍易感[1-2]。近年來，隨著人們社會(huì)活動(dòng)的擴(kuò)大以及旅游業(yè)的蓬勃發(fā)展，SF在美洲、歐洲和亞洲等新發(fā)病例逐年增加。我國(guó)至今已在十幾個(gè)省、市、自治區(qū)證實(shí)有斑點(diǎn)熱立克次體感染，并在蜱、鼠等中檢測(cè)到斑點(diǎn)熱立克次體DNA[3-5]。

日本斑點(diǎn)熱歸屬于斑點(diǎn)熱群，其病原體為日本斑點(diǎn)熱立克次體，一種以蜱為主要傳播媒介的感染性疾病。1984年首次在日本一名患者血中分離得到[6]。目前，該疾病已在多個(gè)國(guó)家發(fā)現(xiàn)，包括中國(guó)、日本、韓國(guó)、菲律賓和泰國(guó)等[7-8]。2013 年，課題組在安徽省大別山區(qū)1例發(fā)熱患者血液標(biāo)本中分離到1株日本斑點(diǎn)熱立克次體近緣株安徽120株，簡(jiǎn)稱安徽120分離株；這是首次在我國(guó)發(fā)現(xiàn)并成功分離的人感染日本斑點(diǎn)熱立克次體[9]。

立克次體表面蛋白是存在于菌體表面的一大類蛋白，目前已知有20多種，包括OmpA(sca0)、OmpB(sca5)、GeneD (sca4)、β-peptide、Adr2、Sca1、Sca12、Sca13等多種蛋白[10]；不同種的立克次體表面蛋白種類也有差異，同種立克次體表面蛋白在核苷酸和氨基酸序列也可存在差異，從而決定了其致病性、免疫性也存在不同。研究[11]表明OmpB能通過其效應(yīng)結(jié)構(gòu)域促進(jìn)立克次體吸附到宿主細(xì)胞表面，并與其表面受體(Ku-70)特異性結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入宿主細(xì)胞；同時(shí)OmpB蛋白還可刺激宿主產(chǎn)生特異、保護(hù)性抗體，在恢復(fù)期通過體液免疫殺滅游離的病原體，也可對(duì)再次入侵的病原體起到殺滅作用[12]。因此，ompB基因及其編碼蛋白的研究對(duì)于深入理解立克次體的致病機(jī)制、臨床診斷試劑和亞單位疫苗研發(fā)等均有重要意義。

考慮到安徽120株的地區(qū)特異性，在遺傳進(jìn)化上可能不同于國(guó)外分離菌株。為更好地了解安徽120分離株的生物學(xué)特點(diǎn)，該研究擬采用生物信息學(xué)方法，綜合多種分析策略對(duì)其外膜蛋白基因ompB的結(jié)構(gòu)、編碼蛋白以及B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行探討，為研究日本斑點(diǎn)熱立克次體的致病機(jī)制與研發(fā)臨床診斷試劑和亞單位疫苗等提供理論支持，為日本斑點(diǎn)熱疾病的防制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 安徽120分離株ompB基因的克隆病原體的分離和鑒定ompB基因序列的PCR擴(kuò)增、克隆和測(cè)序，參照課題組先前發(fā)表的文章[9，13]。

1.2ompB基因序列的NCBI遞交所得的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行初步注釋后，將基因序列提交NCBI。并與NCBI數(shù)據(jù)庫上公布的日本斑點(diǎn)熱立克次體其他分離株的ompB序列做同源比對(duì)。

1.3ompB基因的生物信息學(xué)分析及B細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)參考已發(fā)表文獻(xiàn)[14]的方法，分析安徽120分離株的ompB基因序列及其編碼蛋白質(zhì)。過程如下：采用Bioedit V7.0和NCBI的BLAST程序分析ompB基因序列特征和組成。采用NCBI的ORF Finder在線工具、Bioedit和ExPASy的ProtParam tool在線工具軟件來預(yù)測(cè)ompB編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，如分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成、穩(wěn)定性和摩爾消光系數(shù)等；采用ExPASy服務(wù)器的ProtScale程序分析ompB編碼蛋白的疏水性；采用SignalP 5.0對(duì)ompB編碼蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；采用TMHMM在線工具預(yù)測(cè)ompB編碼蛋白跨膜區(qū)；采用SMART服務(wù)器對(duì)ompB編碼蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析；采用GOR4服務(wù)器和SSPro 4.0服務(wù)器對(duì)ompB編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；采用SWISS-MODEL同源模建ompB編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)；參考文獻(xiàn)[15-16]采用Lasergene軟件的Protean模塊并同時(shí)使用在線工具ABCpred Prediction Server預(yù)測(cè)ompB編碼蛋白的B細(xì)胞線性表位。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。構(gòu)成比的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 安徽120分離株ompB序列特征通過T-A克隆得到的ompB堿基序列后，利用Bioedit軟件對(duì)ompB基因序列的組分進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)ompB基因核酸序列總長(zhǎng)度為5 280堿基對(duì)；分子質(zhì)量為1 601.6 ku(單鏈狀態(tài))和3 198.3 ku(雙鏈狀態(tài))；GC含量是37.20%，AT的含量是62.80%。A、C、G和T核苷酸的摩爾分?jǐn)?shù)見圖1。同時(shí)，將所得的測(cè)序序列進(jìn)行注釋后，提交到NCBI，并與NCBI數(shù)據(jù)庫上公布的日本斑點(diǎn)熱立克次體其他分離株的ompB序列做同源比對(duì)，安徽120分離株的ompB基因(GenBank:KY364904.1)在3 297～3 311處與NCBI上的日本斑點(diǎn)熱立克次體(Sequence ID:AP017602.1)序列比較，兩序列的同源性為99%。安徽120株存在連續(xù)15堿基的缺失，除此之外，該分離株還有4個(gè)堿基突變，分別位于：T3204G、C 3170T、A414C和A292G。

圖1 日本斑點(diǎn)熱安徽120分離株ompB基因序列各核苷酸摩爾分?jǐn)?shù)分布

2.2ompB編碼蛋白氨基酸組成利用NCBI網(wǎng)站所提供的ORF Finder在線工具和Bioedit軟件，結(jié)合NCBI網(wǎng)站的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，預(yù)測(cè)了ompB基因編碼的氨基酸數(shù)目為 1 651 個(gè)，蛋白質(zhì)分子量為167.69 ku。所含的氨基酸含量較多的氨基酸是甘氨酸(Gly)(212個(gè)，12.84%)，其次為Ala和Asn(均為196個(gè)，11.87%)。其余氨基酸組成分別為： 半胱氨酸(Cys)(2個(gè)，0.12%)，Asp(75個(gè)，4.54%)，Glu(23個(gè)，1.39%)，Phe(70個(gè)，4.24%)， His(11個(gè)，0.67%)，Ile(119個(gè)，7.21%)，Lys(57個(gè)，3.45%)，Leu(108個(gè)，6.54%)，Met(15個(gè)，0.91%)，Pro (30個(gè)，1.82%)，Gln (62個(gè)，3.76%)，Arg (22個(gè)，1.33%)，Ser (91個(gè)，5.51%)，Thr (195個(gè)，11.81%)，Val (133個(gè)，8.06%)，色氨酸(Trp) (2個(gè)，0.12%)，Tyr (32個(gè)，1.94%)，見圖2。

2.3ompB編碼蛋白理化性質(zhì)分析利用Geneva大學(xué)的ExPASy服務(wù)器(https://web.expasy.org/protparam/)中的ProtParam tool對(duì)ompB編碼蛋白的理化參數(shù)進(jìn)行了預(yù)測(cè)。該蛋白的原子組成為C7312H11658N2056O2424S17，總原子數(shù)目為23 467個(gè)。理論等電點(diǎn)pI為5.15，在組成ompB編碼蛋白的20種氨基酸中，Gly所占的比例最高，達(dá)到12.84%，而Cys和Trp)的比例最低，均為0.12%。這些預(yù)測(cè)結(jié)果與Bioedit軟件分析結(jié)果相一致。此外，課題組還得到ompB編碼蛋白的消光系數(shù)為58 805(假設(shè)所有成對(duì)的半胱氨酸殘基形成胱氨酸)或58 680(假設(shè)所有的半胱氨酸殘基被還原)，且蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為7.15，脂肪指數(shù)為88.86，總平均親水性(grand average of hydropathicity，GRAVY)為0.06，根據(jù)Guruprased方法表明ompB編碼蛋白較為穩(wěn)定(蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)>40，表明蛋白質(zhì)在溶液中性質(zhì)不穩(wěn)定)，且有疏水性(GRAVY值在2與-2之間，正值說明蛋白為疏水蛋白，反之為親水蛋白)。

圖2 日本斑點(diǎn)熱安徽120分離株ompB編碼蛋白各氨基酸摩爾分?jǐn)?shù)分布

2.4ompB編碼蛋白疏水性分析組成ompB編碼蛋白質(zhì)的20種氨基酸各自帶有不同極性的側(cè)鏈基團(tuán)，其疏水的相互作用分析是進(jìn)行蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、功能域劃分等必要過程。本文采用ExPASy服務(wù)器的ProtScale程序(https://web.expasy.org/protscale/)分析ompB編碼蛋白氨基酸序列的疏水性。從結(jié)果中可得，多肽鏈第508位的Gly(G)具有最高的分值2.556，第 1 427 位的Tyr(Y)和 1 428 位的Lys(K)具有最低的分值-3.011?？傮w來看，疏水性氨基酸均勻分布在整個(gè)肽鏈中，且多于親水性氨基酸，因此整個(gè)多肽鏈表現(xiàn)為疏水性，無明顯的親水區(qū)域，可認(rèn)為ompB編碼蛋白是疏水性蛋白，見圖3。

2.5ompB編碼蛋白信號(hào)肽分析使用SignalP 5.0 server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)的結(jié)合了深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、條件隨機(jī)分類和遷移學(xué)習(xí)方法，能對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行更準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)。ompB編碼蛋白經(jīng)分析后，可以看出Signal peptide (Sec/SPI) Likelihood為0.567 7，存在信號(hào)肽序列，見圖4。

圖3 ProtScale程序分析ompB編碼蛋白的疏水性結(jié)果

2.6ompB編碼蛋白跨膜區(qū)分析ompB編碼蛋白為跨膜蛋白，是一類結(jié)構(gòu)獨(dú)特的蛋白質(zhì)，發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。使用TMHMM在線工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)ompB編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行確證，從圖5可以看出，蛋白在第12位到第34位氨基酸為跨膜區(qū)域。

2.7ompB編碼蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析使用SMART服務(wù)器(http://smart.embl.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)分析ompB編碼蛋白的結(jié)構(gòu)功能域。ompB編碼蛋白在第704位和第926位氨基酸之間存在一個(gè)Pfam區(qū)域，與細(xì)菌黏附宿主的功能相關(guān)。在第1 367位和第1 641位氨基酸之間有一自轉(zhuǎn)運(yùn)體區(qū)，與細(xì)菌的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。

圖4 SignalP 5.0 預(yù)測(cè)ompB編碼蛋白信號(hào)肽結(jié)果

2.8ompB編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析采用GOR4服務(wù)器(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)和SSPro 4.0服務(wù)器對(duì)ompB編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，均提示ompB編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中以無規(guī)卷曲為主，其次為β-折疊和α-螺旋，分別占到53.73%、30.83%和15.45%。無規(guī)則卷曲和β-折疊是ompB編碼蛋白最大的結(jié)構(gòu)元件，而α-螺旋則散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。

圖5 TMHMM在線工具分析 ompB編碼蛋白的跨膜區(qū)結(jié)果

2.9ompB編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析通過SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org)同源模建ompB編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，其序列中1 308～1 651氨基酸部分在蛋白表面形成桶狀結(jié)構(gòu)，可能具有絲氨酸蛋白酶的作用，見圖6。

2.10ompB編碼蛋白B細(xì)胞表位分析采用Lasergene軟件的Protean模塊并同時(shí)使用在線工具ABCpred Prediction Server(http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/)來預(yù)測(cè)ompB編碼蛋白的B細(xì)胞線性表位。結(jié)果表明，ompB編碼蛋白整個(gè)分子具有較強(qiáng)的抗原性，分子內(nèi)抗原表位較豐富(圖7)。按照ABCpred Prediction Server預(yù)測(cè)B細(xì)胞抗原表位得分順序(分?jǐn)?shù)越高，抗原表位可能性越大)，ompB編碼蛋白共有159個(gè)可能的抗原表位。其中預(yù)測(cè)分值最高的前5位分別是：PGVGQNVTTFVNATNT(第1 269～1 284位，Score:0.94)，TVSEDTTLGFINNAAN(第103～168位，Score:0.93)，AINIGDGQGFMFNTNA(第223～248位，Score:0.92)，VGNIGDSDTPVASVRF(第1 075～1 090位，Score:0.92)和TRTTNAAGQGKIIFNP(第665～680位，Score:0.91)。

圖6 通過SWISS-MODEL同源模建的ompB編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)圖(1 308～1 651氨基酸)

圖7 ompB編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原表位預(yù)測(cè)(Protean模塊)

a：α-Helix prediction (Gamier-Robson and Chou-Fasman)；b： Hydrophilicity prediction (Kyte-Doolittle)；c： Flexible regions prediction (Karplus-Schulz)； d： Surface probability prediction (Emini)；e： Antigenic prediction(Jameson-Wolf)

3 討論

本文所使用的ompB基因序列來自2003年本課題組在安徽省大別山區(qū)的患者急性期血液樣本中分離到的一株日本斑點(diǎn)熱立克次體近緣株，通過對(duì)其ompA、ompB、geneD、16SrRNA、17kD基因進(jìn)行PCR測(cè)序分析表明，該菌為一株新的日本斑點(diǎn)熱立克次體，相關(guān)研究[9]成果已在國(guó)際權(quán)威雜志發(fā)表。本文通過NCBI的BLAST程序?qū)mpB基因進(jìn)行了詳細(xì)分析，發(fā)現(xiàn)安徽120分離株的ompB基因在3 297～3 311處與NCBI上的日本斑點(diǎn)熱立克次體(Sequence ID:AP017602.1)序列比較，存在連續(xù)15堿基的缺失，除此之外，該分離株還有4個(gè)堿基突變，表明安徽120株不同于國(guó)外已經(jīng)報(bào)道的日本斑點(diǎn)熱立克次，有重要的研究?jī)r(jià)值，也提醒了國(guó)內(nèi)臨床醫(yī)生在診斷不明原因發(fā)熱疾病時(shí)，需留意日本斑點(diǎn)熱立克次體的感染可能。

本研究運(yùn)用了Bioedit、ORF finder、ProtParam tool、ProScale、SignalP、TMHMM等對(duì)ompB編碼蛋白的氨基酸組成、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、疏水性、信號(hào)肽、蛋白跨膜區(qū)、功能結(jié)構(gòu)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了分析。綜合來看，ompB編碼基因的氨基酸數(shù)目為1 651個(gè)，蛋白質(zhì)分子量為167.69 ku，共用20種氨基酸組成，其中含量較多的氨基酸是Gly，其次為Ala和Asn。該蛋白的原子組成為C7312H11658N2056O2424S17，總原子數(shù)目為23 467個(gè)。理論等電點(diǎn)pI為5.15，消光系數(shù)為58 805或58 680，蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為7.15，脂肪指數(shù)為88.86，總平均親水性(GRAVY)為0.06，為疏水性蛋白；Signal peptide (Sec/SPI) Likelihood為0.567 7，存在信號(hào)肽序列；蛋白在第704位和第926位氨基酸之間存在一個(gè)Pfam區(qū)域，與細(xì)菌黏附宿主的功能相關(guān)；在第 1 367 位和第 1 641 位氨基酸之間有一自轉(zhuǎn)運(yùn)體區(qū)，與細(xì)菌的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)；蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中以無規(guī)卷曲為主，其次為β-折疊和α-螺旋，分別占到53.73%、30.83%和15.45%。無規(guī)則卷曲和β-折疊是ompB編碼蛋白最大的結(jié)構(gòu)元件，而α-螺旋則散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中；同源模建蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)中，第1 308～1 651氨基酸部分在蛋白表面形成桶狀結(jié)構(gòu)，可能具有絲氨酸蛋白酶的作用。

此外，本研究采用了Protean模塊和ABCpred Prediction Server預(yù)測(cè)了ompB編碼蛋白的B細(xì)胞線性表位。從該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、表面可及性、柔韌性及抗原指數(shù)5個(gè)方面進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。從結(jié)果可以看出，ompB編碼蛋白具有較強(qiáng)的抗原性，分子內(nèi)抗原表位較豐富，共有159個(gè)可能的抗原表位，預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)最高(0.94)的為1 269～1 284位序列，其次為103～168位的序列(Score:0.93)；這些結(jié)果表明ompB編碼蛋白B表面抗原的多肽較多，在制備亞單位疫苗時(shí)，應(yīng)當(dāng)選擇蛋白的柔韌性區(qū)域，因?yàn)樵搮^(qū)域易發(fā)生折疊和扭曲的幾率高，形成表位的可能性較大，易與抗體進(jìn)行結(jié)合[15]；當(dāng)然除了結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果外，選擇的抗原表位肽段制備的疫苗效果如何，需要臨床試驗(yàn)來證實(shí)。