智慧芳，李春鳳，賈玉霞，趙九娥，倪君君

北京和合醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)股份有限公司中心實(shí)驗(yàn)室，北京100011

近年來早期診斷和外科手術(shù)技術(shù)的發(fā)展，為癌癥患者帶來了希望。然而，胃癌作為中國發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤之一，復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率也較高，所以術(shù)后輔助化療仍然是胃癌綜合治療的重要組成部分[1-2]。由于腫瘤的異質(zhì)性，即使同一化療方案，不同患者產(chǎn)生的療效也差異顯著，因此，選擇適合個(gè)體的化療藥物，既可提高療效避免不必要的不良反應(yīng)，同時(shí)也可減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。膠滴腫瘤藥敏檢測(cè)技術(shù)（collagen gel droplet embedded culture drug sensitivity test，CD-DST）是利用膠原凝膠在37℃時(shí)形成三維立體結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，將腫瘤細(xì)胞包埋于膠滴中，模擬體內(nèi)實(shí)體腫瘤細(xì)胞生長的微環(huán)境，從而在相似的生長環(huán)境中評(píng)價(jià)化療藥物的有效率。CD-DST具有原代細(xì)胞培養(yǎng)成功率高、所需細(xì)胞量少、檢測(cè)藥物種類多等優(yōu)點(diǎn)，使腫瘤個(gè)體化治療成為可能[4-5]。該技術(shù)在腫瘤體外藥敏檢測(cè)中的應(yīng)用研究已有十余年的歷史?？ㄅ嗨麨I（capecitabine，CAP）作為5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）的前體藥物，也是胃癌輔助化療的常用藥，由于其不良反應(yīng)小，療效顯著，已被廣泛應(yīng)用于臨床。相較于其他抗腫瘤藥物，CAP具有更好的安全性和有效性[6]。但截至目前未有研究報(bào)道在胃癌輔助化療中CAP的CD-DST培養(yǎng)條件，故本研究對(duì)CAP的CD-DST檢測(cè)條件進(jìn)行探索，對(duì)胃癌患者術(shù)后采用CD-DST法進(jìn)行CAP體外藥敏實(shí)驗(yàn)進(jìn)而指導(dǎo)臨床CAP用藥具有重要意義?？诜o藥后，CAP首先被肝臟中羧酸酯酶代謝為5'-脫氧-5-氟胞苷（5'-deoxy-5-fluorocytidine，5'-DFCR），然后通過肝臟和腫瘤組織中的胞苷脫氨酶將其轉(zhuǎn)化為5'-脫氧-5-氟尿苷（5'-deoxy-5-fluorouridine，5'-DFUR），最后在肝臟和腫瘤組織中胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TP）的作用下，將5'-DFUR進(jìn)一步代謝為5-FU發(fā)揮抗腫瘤作用[7]。研究證實(shí)，TP是一種與腫瘤相關(guān)的血管生成因子，在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)高于正常細(xì)胞，這可能是一些研究者報(bào)道的惡性腫瘤優(yōu)先將5'-DFUR轉(zhuǎn)化為5-FU的重要原因之一。TP的活性決定了CAP的抗腫瘤效力[8-9]。由于CAP代謝過程復(fù)雜不僅需要多種酶同時(shí)參與，并且需要肝臟起始代謝，體外代謝比較受限，無法實(shí)現(xiàn)CAP的體外CD-DST檢測(cè)及評(píng)價(jià)，而5'-DFUR僅需在腫瘤細(xì)胞中經(jīng)TP關(guān)鍵酶的一步代謝就可轉(zhuǎn)化為發(fā)揮抗腫瘤作用的5-FU，故本研究選擇CAP的代謝產(chǎn)物5'-DFUR進(jìn)行CAP的CD-DST檢測(cè)條件探索。本研究選取65例新鮮胃癌組織標(biāo)本，體外通過對(duì)不同藥物濃度的5'-DFUR進(jìn)行CD-DST檢測(cè)及評(píng)價(jià)，并分析5'-DFUR在胃癌術(shù)后輔助化療中的敏感性與臨床有效率的一致性，進(jìn)而確定CD-DST法評(píng)價(jià)CAP進(jìn)行藥敏檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)條件。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年5月至2017年9月北京多家綜合性三級(jí)甲等醫(yī)院的65例胃癌患者的新鮮腫瘤組織標(biāo)本。患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前經(jīng)胃鏡活檢病理診斷為胃癌；②無嚴(yán)重全身系統(tǒng)性疾??；③無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前采用化療或放療；②合并其他腫瘤；③有其他臟器切除。65例患者年齡38～87歲，性別、分型均隨機(jī)選取。將65例新鮮胃癌組織標(biāo)本根據(jù)入組時(shí)間順序分為實(shí)驗(yàn)組31例和驗(yàn)證組34例。

1.2 主要試劑與儀器

DME/F-12 1∶1培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；胎牛血清購自美國Thermo Fisher公司；乙二醇二乙醚二胺四乙酸（ethylene glycol diethyl ether diamine tetraacetic acid，EGTA）、伊立替康（irinotecan，CPT-11）購自美國Sigma公司；5'-DFUR購自日本TCI公司；奧沙利鉑（oxaliplatin，L-OHP）購自比利時(shí)CENEXI-Laboratoires THISSEN S.A.公司；膠滴藥敏檢測(cè)試劑盒Primaster?購自日本Kurabo公司。倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；Primage圖像分析系統(tǒng)購自日本Kurabo公司。

1.3 CD-DST法[10-11]

1.3.1 原代腫瘤細(xì)胞分離與培養(yǎng)首先用生理鹽水洗滌腫瘤組織標(biāo)本5次，然后用眼科剪將腫瘤組織標(biāo)本剪成小塊，同時(shí)盡量去除如脂肪、黏膜、結(jié)締組織、壞死組織等非腫瘤細(xì)胞組織，再用刀片將組織切碎成泥狀，EZ酶消化1～2 h，1300 r/min離心3 min，收集消化后的腫瘤細(xì)胞團(tuán)塊，將其接種于CG培養(yǎng)瓶中，用PCM-1培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h，獲得原代胃癌細(xì)胞。

1.3.2 膠原凝膠滴培養(yǎng)培養(yǎng)24 h后，收集預(yù)培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞，與試劑盒中膠原混合液（A∶B∶C=8∶1∶1）混合均勻，按照每膠滴30 μl，每孔3個(gè)膠滴，將細(xì)胞懸液接種于6孔板中，2 h后待膠滴凝固加入3 ml含10%胎牛血清的DME/F-12 1∶1培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

1.3.3 抗腫瘤藥物接觸與清洗培養(yǎng)24 h后加入抗腫瘤藥物，藥物測(cè)試條件根據(jù)藥物服用特點(diǎn)、以往的研究結(jié)果及參考文獻(xiàn)[2,12-15（]表1），分別設(shè)未用藥物的陰性對(duì)照孔（Control）以及L-OHP和CPT-11（臨床胃癌常用藥）處理的陽性對(duì)照孔，同時(shí)將0-time組（加藥起點(diǎn)的未處理組）進(jìn)行染色固定。培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后，用DME/F-12 1∶1培養(yǎng)基清洗2次，每次15 min，然后用無血清培養(yǎng)基PCM-2繼續(xù)培養(yǎng)5天，其中第3天更換一次培養(yǎng)基。

表1 抗腫瘤藥物接觸條件表

1.3.4 染色固定與掃描第9天進(jìn)行染色固定，使用終濃度為50 μg/ml的中性紅染色2 h，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗細(xì)胞 3次，每次5 min，中性福爾馬林固定45 min，蒸餾水清洗15 min，通風(fēng)干燥，分析具有活性的腫瘤細(xì)胞。（圖 1）

圖1 染色固定干燥后的胃癌細(xì)胞（中性紅染色，×40）

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Primage圖像分析系統(tǒng)對(duì)膠滴進(jìn)行分析。Control組吸光度（optical density，OD）值與0-time組OD值的比值表示生長率，若生長率小于0.8，則判定為檢測(cè)沒有意義[16]。

藥物敏感度通過加藥組OD值/Control組OD值（T/C）表示，若T/C＜50%，說明個(gè)體腫瘤細(xì)胞對(duì)相應(yīng)藥物敏感度較高（高敏感）；T/C為50%～60%，說明個(gè)體腫瘤細(xì)胞對(duì)相應(yīng)藥物敏感度處于高敏感與低敏感的臨界范圍（臨界）；T/C＞60%，說明個(gè)體腫瘤細(xì)胞對(duì)相應(yīng)藥物敏感度較低（耐藥）。

2 結(jié)果

2.1 Primage圖像分析結(jié)果

采用Primage圖像分析系統(tǒng)對(duì)膠滴圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行讀取，原代腫瘤細(xì)胞團(tuán)在膠滴內(nèi)呈三維立體式增殖生長，與腫瘤細(xì)胞在人體內(nèi)的生長環(huán)境相似。與加藥組相比，Control組腫瘤細(xì)胞活性好，增殖較快；加藥組呈現(xiàn)出不同程度的細(xì)胞凋亡，主要表現(xiàn)為細(xì)胞團(tuán)變小且數(shù)量減少。（圖2）

圖2 編號(hào)20170523-709標(biāo)本的Primage圖像分析結(jié)果（×40）

2.2 實(shí)驗(yàn)組抗腫瘤藥物的CD-DST檢測(cè)結(jié)果

31例新鮮胃癌組織標(biāo)本中，26例可評(píng)價(jià)，檢測(cè)成功率為84%（26/31），5例檢測(cè)失敗原因?yàn)槟[瘤細(xì)胞含量低，生長率低于0.8。檢測(cè)成功的26例中，隨著5'-DFUR濃度（3、5、10 μg/ml）的增加，體外有效率（in vitro sensitivity，IVS）也呈增長趨勢(shì)，高敏感IVS分別為23%、31%和46%（表2），由于已報(bào)道CAP單藥的胃癌臨床有效率約為30%[17-18]，因此，本研究結(jié)果表明，胃癌體外藥敏實(shí)驗(yàn)中，5 μg/ml的5'-DFUR為CAP體外藥敏檢測(cè)CD-DST法的最適實(shí)驗(yàn)條件。

表2 實(shí)驗(yàn)組抗腫瘤藥物的CD-DST檢測(cè)結(jié)果（n=26）

2.3 驗(yàn)證組 5'-DFUR的CD-DST檢測(cè)結(jié)果

由于實(shí)驗(yàn)過程中的胃癌標(biāo)本有限，為了進(jìn)一步驗(yàn)證胃癌中5'-DFUR的IVS與CAP臨床有效率的一致性，采用5 μg/ml的5'-DFUR對(duì)另外34例胃癌標(biāo)本進(jìn)行了CD-DST法評(píng)價(jià)，其中1例檢測(cè)失敗，是由于腫瘤細(xì)胞量較少不足以檢測(cè)；33例可評(píng)價(jià)，檢測(cè)成功率為97%（33/34）。其中，高敏感IVS為30%（10/33），與實(shí)驗(yàn)組結(jié)果一致，即 5 μg/ml的5'-DFUR的IVS與CAP臨床有效率一致。

3 討論

盡管臨床診斷和治療技術(shù)在不斷提高，但胃癌由于其高度異質(zhì)性、術(shù)后易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，仍然是全球第三大癌癥死亡原因[19]。術(shù)后輔助化療是胃癌治療中的重要組成部分，目前一般采用經(jīng)驗(yàn)性用藥，但是由于腫瘤的異質(zhì)性和患者的個(gè)體差異，導(dǎo)致療效差異顯著。隨著腫瘤個(gè)體化治療思想的提出，研究者建立了ATP生物熒光腫瘤體外藥敏檢測(cè)技術(shù)（ATP-tumor chemosensitivity assay，ATP-TCA）、MTT等體外藥敏檢測(cè)技術(shù)，但都存在一定的局限性。相較于上述方法，Kobayashi[11]提出的CD-DST法具有原代細(xì)胞培養(yǎng)成功率高、需要的腫瘤細(xì)胞量少、臨床相關(guān)性高、操作簡單、培養(yǎng)時(shí)間短以及避免成纖維細(xì)胞干擾等優(yōu)點(diǎn)。研究表明，CD-DST法對(duì)胃癌原代細(xì)胞在化療藥物敏感性檢測(cè)中取得了較理想的結(jié)果[20]。

CAP、5'-DFUR以及5-FU是臨床上胃癌、結(jié)直腸癌輔助化療的常用藥，CAP與5'-DFUR以及5-FU相比，具有更好的安全性和有效性[6]。但作為口服抗癌前體分子的CAP在腫瘤組織細(xì)胞內(nèi)選擇性地被TP代謝為5-FU，其療效已經(jīng)在多個(gè)臨床試驗(yàn)中確定，而且毒性小于5-FU，口服比持續(xù)靜脈注射更易被患者接受，因此，CAP可能是替代靜脈注射5-FU的理想選擇[21]。在進(jìn)展期胃癌的化療中，CAP具有較高的抗癌活性，由于CAP的體外代謝受限，而5'-DFUR作為CAP重要的代謝產(chǎn)物，只需在腫瘤組織細(xì)胞中TP的作用下一步代謝即可轉(zhuǎn)化為發(fā)揮抗腫瘤作用的5-FU。為了胃癌患者術(shù)后采用CD-DST法進(jìn)行CAP體外藥敏實(shí)驗(yàn)，本研究選擇CAP的代謝產(chǎn)物5'-DFUR進(jìn)行CAP的CD-DST藥敏檢測(cè)實(shí)驗(yàn)條件探索。研究結(jié)果顯示，CD-DST法評(píng)價(jià)胃癌原代細(xì)胞對(duì)CAP的藥敏條件檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，胃癌原代細(xì)胞對(duì)不同濃度5'-DFUR的敏感度差異明顯，5 μg/ml的5'-DFUR在體外藥敏實(shí)驗(yàn)條件檢測(cè)中對(duì)胃癌的高敏感率為30%左右，這與文獻(xiàn)報(bào)道的臨床CAP單藥一線治療晚期胃癌的有效率一致[22-23]。同時(shí)本研究結(jié)果顯示抗腫瘤藥物L(fēng)-OHP和CPT-11的單藥敏感率檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際臨床單藥治療有效率相符[24-25]。綜上結(jié)果表明，采用CDDST法評(píng)價(jià)分析CAP在胃癌術(shù)后輔助化療中的藥敏檢測(cè)條件對(duì)胃癌患者術(shù)后進(jìn)行體外藥敏實(shí)驗(yàn)及臨床化療藥物的選擇指導(dǎo)具有重要意義。

另有研究表明，CAP與第三代鉑類抗腫瘤藥物L(fēng)-OHP聯(lián)合用藥對(duì)晚期胃癌療效顯著，且不良反應(yīng)小[26]，而CD-DST技術(shù)作為臨床指導(dǎo)用藥的重要參考，本實(shí)驗(yàn)室利用CD-DST法對(duì)CAP與L-OHP聯(lián)合用藥對(duì)腸癌原代細(xì)胞進(jìn)行了體外藥敏檢測(cè)實(shí)驗(yàn)條件探索，初步結(jié)果顯示，在腸癌中有效率約為55%，與文獻(xiàn)報(bào)道的年齡較小患者臨床有效率為58%和年齡較大患者臨床有效率為52%一致性較高[27]。而CAP與L-OHP聯(lián)合用藥對(duì)胃癌的IVS及其藥敏檢測(cè)實(shí)驗(yàn)條件正在進(jìn)一步研究中。針對(duì)聯(lián)合用藥方案的CD-DST藥敏檢測(cè)實(shí)驗(yàn)條件及藥敏實(shí)驗(yàn)是今后研究的方向，旨在為腫瘤患者術(shù)后進(jìn)行體外藥敏實(shí)驗(yàn)及臨床化療藥物的選擇指導(dǎo)提供重要參考。