于巧紅 郭 曉 王 萌 王泰一 任曉亮

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院， 天津300073； 2.現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程研究中心，天津300193）

自上個世紀(jì)90 年代以來，各國學(xué)者發(fā)現(xiàn)馬兜鈴科植物（如關(guān)木通、廣防己、青木香等） 能導(dǎo)致嚴(yán)重腎毒性［1-3］，關(guān)木通中馬兜鈴酸導(dǎo)致馬兜鈴酸腎病正引起美、英、中等多國學(xué)者的關(guān)注［4］。研究表明，關(guān)木通主要毒性成分為馬兜鈴酸類和馬兜鈴內(nèi)酰胺類，以馬兜鈴酸A 腎毒性作用最為顯著，其作用機(jī)制［5］為誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞系LLC-PK1凋亡，腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生或活性增高，產(chǎn)生馬兜鈴酸DNA 加成物，造成腎小管壁缺血。目前，各國紛紛取消或禁止含有馬兜鈴酸類中草藥的使用和流通［6］，我國也于2003 年取消關(guān)木通（馬兜鈴科） 藥用標(biāo)準(zhǔn)，以木通代替關(guān)木通使用。

傳統(tǒng)中藥細(xì)辛、馬兜鈴等也含有馬兜鈴酸，但因其獨(dú)特的臨床優(yōu)勢、相對安全的長期應(yīng)用歷史而至今仍被臨床采用。目前，收載于《中國藥典》、部頒標(biāo)準(zhǔn)、地方藥材標(biāo)準(zhǔn)的馬兜鈴科植物有24 種，可在國家藥監(jiān)總局政府網(wǎng)站查詢到含馬兜鈴屬植物的中成藥口服制劑有47 種，其中龍膽瀉肝丸、川芎茶調(diào)散、人參再造丸等經(jīng)方制劑臨床使用廣泛，未見明顯不良反應(yīng)報道。2017 年10 月，Science Translational Medicine 《科學(xué)—轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)》 封面文章［7］再次關(guān)注馬兜鈴酸毒性問題，認(rèn)為該成分誘導(dǎo)的基因突變與肝癌發(fā)生有關(guān)，而且使用相關(guān)草藥是亞洲地區(qū)肝癌高發(fā)的重要誘因之一，通過外顯子測序發(fā)現(xiàn)患者肝癌組織中基因突變頻度較高，但兩者之間相關(guān)性尚缺乏直接證據(jù)。迄今為止，科學(xué)界及社會各界對含有馬兜鈴酸A 的藥物是否應(yīng)全部停止使用的爭議仍不絕于耳。

生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)在1995 年由Amidon 教授等［8］提出，它根據(jù)藥物的體外溶解性、腸滲透性高低將藥物分類，形成了一種通過體外相關(guān)數(shù)據(jù)預(yù)測口服藥物體內(nèi)的生物利用度的科學(xué)框架方法，在2000 年被FDA 采用，2010 年又在原有基礎(chǔ)上頒發(fā)修正版［9］，F(xiàn)DA 藥物目錄中已有382個藥物通過該項(xiàng)研究［10］，2016 年國家食品藥品監(jiān)督管理總局也接受了該方法，并提出類似指導(dǎo)原則［11］。但現(xiàn)有相關(guān)研究主要針對單一成分的化學(xué)藥物，對成分復(fù)雜的中藥制劑較少涉及［12］。本實(shí)驗(yàn)以含馬兜鈴酸A 的17 種市售中成藥為研究對象，對其進(jìn)行生物藥劑分類學(xué)研究，分別通過實(shí)驗(yàn)、計算模擬軟件進(jìn)行藥物制劑滲透性和溶解度評價，在此基礎(chǔ)上預(yù)測其可能的口服吸收程度，并且初步考察2 種方法之間的差異，為進(jìn)一步判斷機(jī)體對相關(guān)中藥制劑的利用程度奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 H class 超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；CH-4123 溶出儀（瑞士Sotax 公司）；Milli-Q 超純水儀、Millicell-ERS 跨膜電阻儀（美 國Millipore 公 司）；H1650-W 離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；TK-20B型透皮擴(kuò)散儀（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司）；BP110S 電子分析天平（萬分之一）、BP121S 電子分析天平（十萬分之一）（德國Sartorius 公司）；SB-3200D 數(shù)控超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；STIK 氣套式二氧化碳培養(yǎng)箱［施都凱儀器設(shè)備（上海） 有限公司］；Ti-M 熒光倒置顯微鏡［尼康儀器（上海） 有限公司］；Transwell嵌套十二孔板（美國Corning 公司）；SW-CJ-1FD超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；TDGA 冰箱（青島海爾股份有限公司）；D37520 Osterode 離心機(jī)（美國Thermo Fisher 公司）。

1.2 試劑與藥物 馬兜鈴酸A 對照品（天津中新藥業(yè)股份有限公司，批號W13-0-7）。乙腈、甲醇為色譜純（美國Sigma 公司）；甲酸為色譜純（天津市大茂化學(xué)試劑廠）。

1.3 動物 健康雄性SD 大鼠，SPF 級，體質(zhì)量（200±20） g，購于中國軍事科學(xué)院，動物生產(chǎn)許可證號SCXK-（軍）2012-0004，天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院動物倫理委員會對本研究方案審核批準(zhǔn)，并監(jiān)督實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，動物倫理審查批準(zhǔn)號TJAB-TJU20160039。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取馬兜鈴酸A 對照品3.44 mg于10 mL 量瓶中，甲醇定容，即得。

2.1.2 Krebs-Ringer’s 腸營養(yǎng)液 稱取NaCl 8.00 g、KCl 0.20 g、MgSO40.26 g、NaH2PO40.07 g、NaHCO31.00 g，加水溶解，臨用前加入CaCl20.20 g，邊加邊持續(xù)攪拌，臨用前加入葡萄糖1.00 g，超純水定容至1 L，即得。

2.1.3 供試品溶液 精密稱取馬兜鈴酸A 對照品3.44 mg于100 mL 量瓶中，Krebs-Ringer’s 腸營養(yǎng)液充分溶解并定容，即得（34.40 μg／mL）。

2.2 色譜條件 參考文獻(xiàn)［13］報道。Waters BEH RP C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相乙腈-0.1%甲酸（35∶65）；體積流量0.20 mL／min；柱溫35℃；檢測波長250 nm。

2.3 溶解度測定 取過量馬兜鈴酸A 對照品于250 mL 超純水中，在37℃水浴、60 r／min 磁力攪拌下平衡24 h，使該成分在超純水中充分溶解至飽和，取500 μL 飽和溶液，12 000 r／min 離心5 min，超純水稀釋至一定濃度，UPLC法測定馬兜鈴酸A 在純水中的平衡溶解度，計算劑量數(shù)D0，公式為D0＝，其中D為藥物單次最大口服劑量（0.60 mg），根據(jù)2015 年版《中國藥典》［14］規(guī)定藥材中馬兜鈴酸A 含有量不得超過0.01%計算得到；Cs為藥物溶解度（0.05 mg／mL）；V0為溶解藥物所需體液體積，F(xiàn)DA 規(guī)定為250 mL。

2.4 腸滲透性實(shí)驗(yàn) 大鼠禁食不禁水12 h 后乙醚麻醉，脫頸椎處死，打開腹部，取出十二指腸、空腸、回腸，立即放入37℃生理鹽水沖凈，翻轉(zhuǎn)腸囊，將后端用細(xì)線扎緊，另一端插入細(xì)玻璃管并固定。向腸囊內(nèi)注滿K-R 腸營養(yǎng)液，平衡5 min，將腸囊置于37℃恒溫的50 mL 藥液中，恒流泵通空氣以保持離體腸囊活性，于15、30、60、90、120 min 吸取藥液適量作為樣品，同時補(bǔ)充等體積空白K-R腸營養(yǎng)液，最后一次取樣后測量腸段長度和內(nèi)徑，計算離體腸囊面積。樣品在12 000 r／min 下離心5 min，取上清液，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測定取樣終點(diǎn)（120 min） 累積吸收量Qn、滲透系數(shù)Papp，公式分別為Qn＝，其中Ci為各取樣點(diǎn)質(zhì)量濃度；V為腸段體積（腸段中K-R 腸營養(yǎng)液的量）；Vi為取樣體積（0.20 mL）；A為離體腸囊面積，為腸囊長度和周長的乘積；t為取樣終點(diǎn)時間；C為樣品初始質(zhì)量濃度，計算吸收率P（取樣終點(diǎn)樣品質(zhì)量濃度與初始質(zhì)量濃度比值）。

2.5 生物藥劑分類學(xué)研究 通過Pipeline Pilot 8.5 軟件中的多元線性回歸方程進(jìn)行計算，預(yù)測化合物在25℃水中的溶解度，即馬兜鈴酸A 摩爾溶解度。參考基團(tuán)貢獻(xiàn)方法，預(yù)測馬兜鈴酸A 的ALogP、LogD以評估其滲透性，LogP是ALogP基于原子對疏水性貢獻(xiàn)的原理估算得到，由CLogP和電離常數(shù)pKa 計算而得，而CLogP值是應(yīng)用ChemDraw 7.0 軟件，由LogP基于化合物結(jié)構(gòu)中官能團(tuán)和化學(xué)鍵的貢獻(xiàn)原理計算得到。

3 結(jié)果

3.1 馬兜鈴酸A 平衡溶解度 在37℃、pH ＝6.8 的條件下，測得馬兜鈴酸 A 在純水中的平衡溶解度為0.05 mg／mL，結(jié)合藥物使用說明中臨床口服給藥實(shí)際情況，測得17 種市售中成藥中該成分實(shí)際劑量數(shù)D0，見表1。

3.2 馬兜鈴酸A 腸滲透性（實(shí)驗(yàn)法） 通過大鼠腸外翻實(shí)驗(yàn)，測得取樣終點(diǎn)累積吸收量Q為（0.20±0.04） μg／cm2，滲透系數(shù)Papp為（0.51±0.11） ×10-6cm／s，吸收 率P為（2.12±0.22）%。

3.3 馬兜鈴酸A 平衡溶解度、腸滲透性（計算機(jī)法）通過計算機(jī)模擬軟件，測得分子溶解性LogCs為-3.91，溶解度Cs為0.04 mg／mL，透過性預(yù)測結(jié)果LogD為1.56，ALogP為2.92，CLogP為4.11，由此測得17 種市售中成藥中馬兜鈴酸A 預(yù)測劑量數(shù)D0，結(jié)果見表1。

3.4 生物藥劑分類學(xué)評價 根據(jù)FDA 對藥物溶解度的規(guī)定，在37℃、pH 值1～7.5 的范圍內(nèi)，劑量、溶解度比值（D／Cs） 與250 mL 比較（即劑量數(shù)D0），D0≤1，藥物為高溶解性；D0＞1，藥物為低溶解性。外翻腸囊試驗(yàn)中，以Papp≥8.4×10-5cm／s 為高滲透性藥物，反之則為低滲透性［29］。結(jié)果見表2。

3.5 馬兜鈴酸A 生物藥劑分類學(xué) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)所測定的溶解性、滲透性數(shù)據(jù)，基于生物藥劑分類學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)17 種市售中成藥中馬兜鈴酸A 均表現(xiàn)出Ⅲ類藥物的特點(diǎn)，即高溶解性、低滲透性。

根據(jù)計算機(jī)模擬預(yù)測結(jié)果及生物藥劑分類學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)17 種市售中成藥中馬兜鈴酸A 均表現(xiàn)出Ⅰ類藥物的特點(diǎn)，即高溶解性、高滲透性，表 明Pipeline Pilot 8.5、ChemDraw 7.0 軟件基于LogCs計算D0時，馬兜鈴酸A 為高溶解性，與實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果一致，準(zhǔn)確度較高；但基于ALogP、LogD分析滲透性時，與實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果相反，準(zhǔn)確率較低，這主要是因?yàn)锳LogP是基于官能團(tuán)和分子片段貢獻(xiàn)計算得到，與分子內(nèi)不同的電子和立體結(jié)構(gòu)效應(yīng)、氫鍵相互作用等都有關(guān)系，故其預(yù)測準(zhǔn)確性受到多方面因素的影響。

表1 馬兜鈴酸A 在17 種市售中成藥中的含有量及D0

表2 生物藥劑分類學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)

4 討論

外翻腸囊法最早用于研究葡萄糖和氨基酸在腸道的代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)［30］，具有藥物累積速度快、用藥量少、重復(fù)性好、操作簡單、實(shí)驗(yàn)條件易控制、經(jīng)濟(jì)適用等特點(diǎn)，成為目前研究體外腸道吸收常用的生物模型［31］。Pipeline Pilot 8.5 軟件預(yù)測溶解性是基于Tetko 等［32］發(fā)表的電性拓?fù)錉顟B(tài)指數(shù)多元線性回歸方程計算，預(yù)測化合物在25℃水中的溶解 性；Pipeline Pilot 8.5 軟件參考Ghose 等［33］發(fā)表的Ghose／Crippen 基團(tuán)貢獻(xiàn)方法，預(yù)測馬兜鈴酸A 的ALogP、LogD以評估其滲透性。藥物在被動擴(kuò)散中，主要由LogP（油水分配系數(shù)）、LogD（pH 依賴性分配系數(shù)） 表示，前者是ALogP基于原子對疏水性貢獻(xiàn)的原理估算得到，而后者是化合物在所有存在形式（解離和非解離） 下在不同pH 正辛醇、水中總濃度的比值，由CLogP和電離常數(shù)pKa計算而得，而CLogP是應(yīng)用ChemDraw 7.0 軟件由LogP基于化合物結(jié)構(gòu)中官能團(tuán)和化學(xué)鍵的貢獻(xiàn)原理計算得到。

本實(shí)驗(yàn)通過生物藥劑分類學(xué)系統(tǒng)對馬兜鈴酸A 進(jìn)行體外生物利用度評價，通過對其溶解度測定和滲透性研究，以其劑量和滲透系數(shù)為指標(biāo)，確定在17 種中成藥中馬兜鈴酸A 均表現(xiàn)出生物藥劑分類學(xué)Ⅲ類藥物的特點(diǎn)，即高溶解性、低滲透性，并對不同方法所得數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性評價及分類研究。再考察實(shí)驗(yàn)方法、計算機(jī)模擬方法對中藥成分的適用性，為其安全性評價提供新的思路和方法。

馬兜鈴酸A 進(jìn)入體內(nèi)后會被迅速吸收和分布，而且其分布具有器官特異性，可能在肝臟進(jìn)行部分代謝；該成分腎臟組織分布多，其消除與給藥劑量有很大關(guān)系，高劑量口服給藥時消除緩慢，與臨床實(shí)際中毒情況相符［34］；它在大鼠體內(nèi)的消除過程呈現(xiàn)非線性動力學(xué)特征，可能導(dǎo)致藥物在體內(nèi)蓄積，對腎臟和其他臟器產(chǎn)生腎毒性［35］。腎臟是馬兜鈴酸代謝產(chǎn)物的最主要排泄器官，故腎功能損害時馬兜鈴酸A 易在腎臟內(nèi)蓄積而加重病情，并且已經(jīng)在本實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)［36］。

對整體實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析后發(fā)現(xiàn)，17 種市售中成藥中馬兜鈴酸A 溶解性好，腸透過性是其口服吸收的限速因素，考慮到實(shí)際使用情況下的制劑環(huán)境，在符合快速溶出的條件下其生物利用度較高，有可能經(jīng)口服吸收進(jìn)入體內(nèi)，再經(jīng)腎臟累積排泄發(fā)揮腎臟損傷作用。因此，在臨床使用過程中應(yīng)嚴(yán)格控制該成分劑量。