譚志濱 徐俊鴻 鄧卓燕 藍(lán) 海

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院， 廣東 佛山528300）

補(bǔ)腎解毒顆粒是根據(jù)廣東省名中醫(yī)陳志雄教授驗(yàn)方補(bǔ)腎解毒方制成的制劑，包含熟地黃、山萸肉、山藥、補(bǔ)骨脂、莪術(shù)、石上柏等藥材，用于治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤，尤其對(duì)多發(fā)性骨髓瘤治療有良效［1-6］。方中主藥山萸肉所含以莫諾苷和馬錢苷為主的環(huán)烯醚萜類成分具有抗炎止痛、免疫抑制等活性［7-8］；補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素為另一主藥補(bǔ)骨脂的主要有效成分，對(duì)肉瘤和艾氏腹瘤等有著明顯的抑制作用［9-11］。本實(shí)驗(yàn)通過HPLC 法測(cè)定補(bǔ)腎解毒顆粒中莫諾苷、馬錢苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素含有量，并建立其特征圖譜，以期為該制劑質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

熟地黃（批號(hào)181201，產(chǎn)地河南）、山藥（批號(hào)190101，產(chǎn)地河南）、鹽山茱萸（肉）（批號(hào)181201，產(chǎn)地浙江）、莪術(shù)（批號(hào)181201，產(chǎn)地廣西）、石上柏（批號(hào)180901，產(chǎn)地廣東）、補(bǔ)骨脂（批號(hào)181201，產(chǎn)地河南） 均購自廣東天泰藥業(yè)有限公司中藥飲片廠，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院徐俊鴻主任藥師鑒定為正品，憑證標(biāo)本保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院制劑中心。

莫諾苷（批號(hào)111998-201703，純度97.4%）、馬錢苷（批號(hào)111640-201808，純度99.0%）、補(bǔ)骨脂素（批號(hào)110739-201617，純度99.7%）、異補(bǔ)骨脂素（批號(hào)110738-201715，純度99.5%） 對(duì)照品均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

Thermo U3000 高效液相色譜儀，配置TCC-3000SD柱溫箱、LPG-3400SDN 泵、VWD-3100檢測(cè)器、手動(dòng)進(jìn)樣器（美國 Thermo 公司）；ESJ200-4A 電子天平（十萬分之一，沈陽神宇龍騰天平有限公司）；FA2004 分析天平（常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎解毒顆粒制備 稱取熟地飲片500 g、山藥飲片250 g、山萸肉飲片250 g、莪術(shù)飲片250 g、石上柏飲片250 g、補(bǔ)骨脂飲片250 g，置于提取容器中，加入12 倍量水煎煮2 h，濾過，收集濾液，濾渣加入10 倍量水提取1 h，收集合并濾液，濾液濃縮至相對(duì)密度1.25（55～60℃）。濃縮后，加入無水乙醇至含醇量50%～55%，靜置12 h 以上，醇沉，濾過，收集濾液，濃縮至相對(duì) 密度1.10（55～60℃），浸膏、糊精、糖粉以1∶4∶1 比例添加糊精、糖粉等輔料，制 粒，干 燥，即 得（1 000 g）。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取各對(duì)照品適量，置于10 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，制成每1 mL 分別含1.0 mg 上述成分的貯備液，精密量取適量，置于同一25 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，制成每1 mL 含莫諾苷120 μg、馬錢苷120 μg、補(bǔ)骨脂素50 μg、異補(bǔ)骨脂素80 μg 的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 取顆粒適量研細(xì)，精密稱取1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 50%甲醇，超聲（功率300 W、頻率40 Hz） 處理30 min后取出，放冷至室溫，50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按顆粒處方和工藝，制備缺山萸肉、缺補(bǔ)骨脂的陰性樣品，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.5 色譜條件 Thermo Acclaim TM 120 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.1% 磷酸，梯度洗脫（0～3 min，12% 乙腈；3～15 min，12%～18%乙腈；15～20 min，18%～25%乙腈；20～25 min，25%～38%乙腈；25～28 min，38%～40%乙腈；28～36 min，40% 乙 腈；36～40 min，40%～100%乙腈；40～50 min，100%～12%乙腈）；體積流量1.0 mL／min；檢測(cè)波長240 nm（0～25 min）、246 nm（25～50 min）；柱溫35℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00 mL 至5 mL量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，在“2.5” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.6.2 專屬性考察 精密吸取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液各20 μL，在“2.5” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，供試品、對(duì)照品溶液均在相同保留時(shí)間出現(xiàn)吸收峰，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.6.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液20 μL，在“2.5” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得莫諾苷、馬錢苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素峰面積RSD分別為0.80%、0.42%、0.82%、0.75%，表明儀器精密度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液，于0、1、2、4、6、8、24 h 在“2.5” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得莫諾苷、馬錢苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素峰面積RSD 分別為0.80%、0.61%、0.58%、0.59%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品（批號(hào)190304） 6 份，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得莫諾苷、馬錢苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素含有量RSD分別為1.24%、1.00%、2.38%、1.58%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含有量已知的顆粒6 份，每份0.5 g，按100%水平加入各對(duì)照品溶液，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

2.6.7 樣品含有量測(cè)定 取15 批顆粒，每批平行2 份，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含有量，結(jié)果見表3。

2.7 HPLC 特征圖譜建立

2.7.1 專屬性考察 同“2.6.2” 項(xiàng)。

2.7.2 整體性考察 精密吸取供試品溶液20 μL，在“2.5” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，并以最終梯度延長1 倍的時(shí)間進(jìn)行洗脫，結(jié)果見圖2。由此可知，在50 min 后無其他干擾峰，表明該方法整體性良好。

2.7.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液20 μL，在“2.5” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，以補(bǔ)骨脂素為參照峰（S），測(cè)得各特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0～0.23%，相對(duì)峰面積RSD 為0～1.42%，表明儀器精密度良好。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

表3 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg／g， n＝2）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg／g， n＝2）

圖2 各成分整體性色譜圖Fig.2 Integrality chromatogram of various constituents

2.7.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液，于0、1、2、4、6、8、24 h 在“2.5” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以補(bǔ)骨脂素為參照峰（S），測(cè)得各特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0～0.22%，相對(duì)峰面積RSD 為0～1.35%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.5 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批顆粒（批號(hào)190304） 6 份，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以補(bǔ)骨脂素為參照峰（S），測(cè)得各特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0～0.20%，相對(duì)峰面積RSD 為0～2.71%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.6 圖譜確定 取15 批顆粒，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以補(bǔ)骨脂素為參照峰（S），測(cè)定各特征峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積，建立特征圖譜和對(duì)照?qǐng)D譜，結(jié)果見圖3～4、表4。

圖3 15 批樣品HPLC 特征圖譜Fig.3 Characteristic HPLC chromatograms of fifteen batches of samples

圖4 各成分對(duì)照?qǐng)D譜Fig.4 Reference chromatogram of various constituents

表4 各特征峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積Tab.4 Relative retention time and relative peak areas of various characteristic peaks

2.7.7 計(jì)量學(xué)分析

2.7.7.1 相似度分析 利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件（2012 年版），以液相圖譜共有模式為參照?qǐng)D譜，將數(shù)據(jù)進(jìn)行特征峰匹配，夾角余弦法計(jì)算相似度，結(jié)果見表5。由此可知，各批樣品之間的差異較小，表明制備工藝穩(wěn)定，重復(fù)性良好。

表5 15 批樣品相似度Tab.5 Similarities of fifteen batches of samples

2.7.7.2 主成分分析 通過SPSS Statistics 19.0 軟件進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見表6～7。由此可知，前2個(gè)主成分累積方差貢獻(xiàn)率為87%，基本可以客觀反映樣品信息；補(bǔ)骨脂素、馬錢苷對(duì)主成分1 的貢獻(xiàn)度最大，而莫諾苷、馬錢苷對(duì)主成分2 的最大。

2.7.7.3 聚類分析 通過SPSS Statistics 19.0 軟件，以組間聯(lián)接法、平方Euclidean 距離為測(cè)度，對(duì)15 批樣品進(jìn)行聚類分析，見圖5。由此可知，當(dāng)0＜閾值＜5 時(shí)，除批號(hào)181213 外其他樣品聚為一類，批號(hào)181213 樣品由于4 種成分含有量的差異而單獨(dú)聚為另一類，結(jié)果與表5 一致，表明提取濃縮工藝穩(wěn)定。

表6 主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率Tab.6 Principal component eigenvalues and variance contribution rates

表7 主成分分析結(jié)果Tab.7 Results of principal component analysis

3 討論

3.1 色譜條件選擇 本實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)洗脫50 min 內(nèi)時(shí)4 種成分分離效果良好，峰型對(duì)稱，符合含有量測(cè)定要求。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)合VWD 紫外檢測(cè)器參數(shù)考察所測(cè)成分紫外吸收，發(fā)現(xiàn)莫諾苷、馬錢苷最大吸收波長均為240 nm［12-14］，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素均為246 nm［15-16］，為達(dá)到特征圖譜信息量最大化和測(cè)定要求，檢測(cè)波長選取240 nm（0～25 min）、246 nm（25～50 min）。流動(dòng)相比較了乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸，發(fā)現(xiàn)以后者洗脫時(shí)各成分均實(shí)現(xiàn)基線分離，可達(dá)到定量分析要求。再進(jìn)行體積流量、柱溫等耐用性考察，發(fā)現(xiàn)分別在（1.0±0.1） mL／min、（35.0±1.0）℃范圍均可重現(xiàn)，方法耐用性良好。

圖5 15 批樣品聚類分析Fig.5 Cluster analysis of fifteen batches of samples

3.2 提取條件優(yōu)化 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，供試品中莫諾苷色譜峰峰型對(duì)溶劑要求較高，容易出現(xiàn)裂峰、峰型不對(duì)稱，故選擇2015 年版 《中國藥典》 中的提取溶劑，即50%甲醇［17］。再對(duì)不同提取方式（超聲、加熱回流）、提取時(shí)間（20、30、40 min）、提取溶劑用量（50、25、10 mL） 進(jìn)行考察，最終確定取樣后精密加入50% 甲醇50 mL，超聲（功率300 W、頻率40 Hz） 處理30 min 作為最優(yōu)提取條件。

3.3 HPLC 特征圖譜分析 共指認(rèn)了6個(gè)共有特征峰，其中峰1、2、S、6 分別為莫諾苷、馬錢苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素，即為補(bǔ)腎解毒顆粒特征成分。再通過化學(xué)計(jì)量學(xué)評(píng)價(jià)各批樣品相似度，發(fā)現(xiàn)不同批次之間差異較小，而且均采用同批藥材，不存在原料差異，表明生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，各成分提取完全。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定補(bǔ)腎解毒顆粒中莫諾苷、馬錢苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的含有量，并建立其HPLC特征圖譜，再通過聚類分析和主成分分析對(duì)15 批樣品進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該方法簡(jiǎn)便可靠，穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，可用于評(píng)價(jià)該制劑質(zhì)量。