吳 鑫左雯雯金立陽李存玉*彭國平

（1.江蘇護理職業(yè)學(xué)院， 江蘇 淮安223001； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 江蘇 南京210023）

中藥生產(chǎn)過程中有效成分的提取、精制是影響產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而成分之間的相互作用將直接影響生產(chǎn)過程中的質(zhì)量傳遞［1-2］，特別是富含酸堿類成分的中藥復(fù)方［3］。目前研究認(rèn)為，中藥酸堿復(fù)合物反應(yīng)成鹽引起的分子量變大、溶解度降低等現(xiàn)象會在濃縮、醇沉等制藥環(huán)節(jié)造成成分的損失［4-6］。但酸堿化合物存在酸堿性強弱的區(qū)別，其成分存在復(fù)合成鹽反應(yīng)的同時，也會生成一種介于游離態(tài)與復(fù)鹽態(tài)之間的存在狀態(tài)，即官能團之間以較弱分子間作用力結(jié)合的締合態(tài)［7］，但迄今為止有關(guān)研究相對薄弱。

紫外分光光度法是一種根據(jù)吸收光譜來研究物質(zhì)結(jié)構(gòu)及其相互作用的有效手段［8］，每種物質(zhì)均具有不同的空間結(jié)構(gòu)，吸收光能量情況也存在差異，具有獨特的光吸收譜線，因此可借助該方法判斷酸堿復(fù)合物配伍前后官能團變化情況，同時通過核磁共振氫譜綜合判斷酸堿類成分在溶液中的存在狀態(tài)。由于存在狀態(tài)的改變會影響分子大小與荷電特征，故本實驗采用以分子篩分、道南效應(yīng)為主要分離原理的超濾和納濾分離技術(shù)，對中藥代表性酚酸成分沒食子酸與堿性呈梯度變化的生物堿進行配伍，分析膜分離行為，研究該類成分在溶液中的存在狀態(tài)，以期為中藥復(fù)方的精制分離提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 儀器 NF-1812-S2型膜分離實驗裝置（海安宏麥機械有限公司）；聚醚砜超濾膜［截留分子量10 kDa，星達(dá)（泰州） 膜科技有限公司］；聚酰胺納濾膜（截留分子量600～800 Da，南京拓鉒醫(yī)藥科技有限公司）；FA-1004型電子天平（萬分之一）、FA-2204型電子天平（十萬分之一）（上海安亭電子儀器廠）；KH-250B型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；Avance 400型核磁共振儀（德國Bruker 公司）；T6 新世紀(jì)紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試劑與藥物 沒食子酸（批號FY180106，純度≥98%）、苦參堿（批號FY180120，純度≥98%）、苦參素（批號FY180130，純度≥98%）、槐定堿（批號FY170911，純度≥98%）、漢防己甲素（批號FY171203，純度≥98%）、金雀花堿（批號FY170325，純度≥98%）、秋水仙堿（批號FY171206，純度≥98%） 原料藥均購于鄭州豐耀農(nóng)業(yè)科技有限公司；沒食子酸對照品（批號110831-201204） 購于中國食品藥品檢定研究院。氘代二甲基亞砜（DMSO-d6，純度99.9%） 購于美國CIL 公司；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸對照品適量，置于10 mL 量瓶中，流動相溶解并定容至刻度，即得（質(zhì)量濃度為0.125 mg／mL）。

2.2 膜分離原液制備

2.2.1 單一供試品溶液 稱取沒食子酸原料藥適量，純化水制成質(zhì)量濃度為0.15 mg／mL 的藥液，超聲處理15 min，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2.2 混合供試品溶液 以1∶1、1∶3、1∶6 比例稱取沒食子酸、生物堿適量，純化水制成沒食子酸質(zhì)量濃度為0.15 mg／mL 的混合溶液，超聲處理15 min，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3 分光光度法待測溶液 按“2.2” 項下方法制備，沒食子酸與生物堿比例為1∶3。

2.4 核磁樣品

2.4.1 單一供試品溶液 稱取沒食子酸、苦參堿、苦參素、金雀花堿、槐定堿原料藥適量，加入0.6 mL氘代水，振蕩溶解，8 000 r／min 離心5 min，轉(zhuǎn)移到5 mm 外徑核磁管中，即得。

私權(quán)觀念和科學(xué)態(tài)度是知識產(chǎn)權(quán)戰(zhàn)略的根本保障——紀(jì)念《國家知識產(chǎn)權(quán)戰(zhàn)略綱要》頒布實施十年............................................................................................劉春田 06.03

2.4.2 混合供試品溶液 稱取沒食子酸適量，與生物堿以1∶3 比例混合，加入0.6 mL 氘代水溶解，8 000 r／min 離心5 min，轉(zhuǎn)移到5 mm 外徑核磁管中，即得。

2.5 色譜條件 參考文獻(xiàn)［9］。采用Hedera ODS-2 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相甲醇-0.1% 三氟乙酸（20∶ 80）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30℃；檢測波長270 nm；進樣量10 μL。

2.6 膜分離實驗 選取已用純化水清洗至中性條件下的超濾膜，組裝超濾系統(tǒng)。采用1 kD 超濾膜進行超濾（操作溫度25℃，操作壓力13.79 kPa），將超濾系統(tǒng)的進液端、超濾端、截流端放入裝有“2.2.1” 項下供試品溶液的容器內(nèi)進行循環(huán)，待吸附-解吸附達(dá)到平衡時將容器內(nèi)溶液攪拌均勻，作為平衡液，將超濾端取出進行濾液收集，待超濾完全后混勻，取出超濾液，計算透過率（T），公式為T＝（C超濾／C平衡） ×100%，其中C超濾是超濾液中溶質(zhì)質(zhì)量濃度，單位mg／mL；C平衡是平衡液中溶質(zhì)質(zhì)量濃度，單位mg／mL。納濾操作步驟同超濾。

2.7 紫外可見分光光度實驗 將待測空白水溶液及樣品置于同一石英比色皿中，室溫下進行全波長掃描（190～600 nm），每1 nm 采集一次數(shù)據(jù)，掃描速度10 nm／s。

2.8 高場核磁實驗 NMR 數(shù)據(jù)的1H 圖譜由Bruker Avance 400 核磁共振波譜儀在恒溫（25℃）下采集得到，采用zg30 脈沖序列，具體參數(shù)為譜寬（SWH） 8 223；采樣點數(shù)（TD） 65 K；采樣時間（AQ） 3.98 s；弛豫延遲時間（D1） 1 s；采樣次數(shù)（NS） 16 次；增益次數(shù)（RG） 124。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)合物膜分離情況 沒食子酸為酸性化合物，當(dāng)與不同堿性的生物堿配伍時可起到調(diào)節(jié)溶液酸堿性的作用，使其呈分子態(tài)或離子態(tài)。當(dāng)溶液pH ＝pKa-2 時，該成分主要以游離態(tài)形式存在；當(dāng)溶液pH ＝pKa＋2 時，該成分主要以離子態(tài)形式存在。

選取pKa 值不一樣的5 種生物堿（槐定堿、金雀花堿、苦參堿、苦參素、秋水仙堿） 與沒食子酸進行配伍，其中槐定堿分子量、pKa 分別為248 Da、8.97［10］，金雀花堿分別為234 Da、8.1，苦參堿分別為248 Da、7.7，苦參素分別為264 Da、5.8［11］，秋水仙堿分別為399 Da、1.84，沒食子酸與不同生物堿配伍的透過率見表1。由此可知，兩者以1∶1 比例配伍時超濾透過率無明顯變化，而在納濾條件下略微下降；隨著配伍比例升高（1∶3、1∶6），透過率均呈顯著下降趨勢，并且在生物堿堿性增強時更為明顯，表明沒食子酸透過率與酸堿pKa 差值呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。

表1 沒食子酸-生物堿配伍透過率測定結(jié)果Tab.1 Results of transmittance determination of gallic acid-alkaloids compatibility

在超濾、納濾條件下，單一沒食子酸提取液中的透過率相似，均在81% 左右；復(fù)合溶液中沒食子酸與堿性較強的生物堿（槐定堿、金雀花堿、苦參堿） 配伍后，納濾透過率下降程度大于超濾，約在10%左右，而與堿性較弱的生物堿（苦參素、秋水仙堿） 配伍后，2 種膜分離差異不明顯。

沒食子酸透過率的變化是因為該成分與生物堿形成酸堿混合物，并且由于堿性強弱其存在狀態(tài)也不盡相同。以沒食子酸、金雀花堿為例，兩者在1∶3 配伍比例下的超濾透過率較未配伍下降36.88%，而納濾透過率下降47.59%。超濾分離是基于孔徑篩分原理［12］，沒食子酸與生物堿配伍后有一部分形成特殊混合物，分子量升高，透過率下降，并以復(fù)合態(tài)或締合態(tài)的形式存在。根據(jù)納濾膜分離的電荷效應(yīng)［13］，推斷沒食子酸與金雀花堿以1∶3 比例配伍時，所形成的混合物中締合態(tài)與復(fù)合態(tài)共存，并且有10%以小分子離子態(tài)形式存在；苦參素、秋水仙堿堿性較弱，故與沒食子酸配伍時大多形成分子間作用力較弱的締合態(tài)。

3.2 紫外吸收光譜考察 圖1（金雀花堿本身紫外吸收譜圖復(fù)雜，故未納入研究）、表2 顯示，沒食子酸具有明顯的苯環(huán)吸收帶特征，譜帶1 為B吸收帶（λmax＝269 nm），譜帶2 為K 吸收帶（λmax＝219 nm）。沒食子酸與堿性較強的苦參堿、槐定堿配伍時，譜帶1 的λmax發(fā)生不同程度的藍(lán)移，而譜帶2 的λmax出現(xiàn)紅移，2 條譜帶λmax所對應(yīng)的吸光度有所下降；與苦參素配伍時，譜帶1、2 的λmax與對應(yīng)吸光度的變化不明顯；與秋水仙堿配伍時，因為它是酰胺堿而不與酸反應(yīng)，故基本沒有變化。由此可知，酸堿類成分配伍時由于存在狀態(tài)不同，導(dǎo)致混合物的光化學(xué)行為不一樣。

酸堿類成分配伍時，生物堿上氨基首先與沒食子酸苯環(huán)上羧基部分結(jié)合，由于堿性基團的存在使得羰基吸電子能力增強，苯環(huán)的π→π*躍遷能量增高，故譜帶1 的λmax出現(xiàn)藍(lán)移。堿性較強的苦參堿與槐定堿進一步與苯環(huán)上羥基結(jié)合而形成羧基陰離子，使得p-π 共軛增強，故譜帶2 的λmax出現(xiàn)紅移。

表2 沒食子酸-生物堿配伍最大吸收波長（λmax）、吸光度測定結(jié)果Tab.2 Results of maximum absorption wavelength（λmax） and absorbance determination of gallic acid-alkaloids compatibility

另外，秋水仙堿的堿性極弱，故在水溶液中不與沒食子酸發(fā)生作用；其他生物堿除了形成締合物外，還能進一步與沒食子酸發(fā)生反應(yīng)而形成酸堿復(fù)鹽。

3.3 沒食子酸復(fù)合物高場核磁結(jié)構(gòu)解析 通過膜分離技術(shù)和紫外全掃描可知，不同堿性的生物堿與沒食子酸配伍后，由于復(fù)合物存在狀態(tài)不同導(dǎo)致其透過率、λmax存在差異。

1H-NMR 被廣泛用于化合物結(jié)構(gòu)解析，故本實驗采用該技術(shù)進一步分析復(fù)合物不同官能團結(jié)合的區(qū)別。將沒食子酸與生物堿配伍后的復(fù)合物溶于D2O 中，發(fā)現(xiàn)其氫譜化學(xué)位移（400 MHz，D2O ＝90∶10）δ為6.91（2H，s，2，6-H），8.82（1H，s，4-OH），9.17（2H，s，3，5-OH），12.22（1H，s，1-OH）。沒食子酸與金雀花堿、槐定堿、苦參堿、苦參素配伍后，1-OH、3，5-OH、4-OH 的氫化學(xué)位移消失，而與秋水仙堿配伍后其變化不明顯，這是由于堿性較強的金雀花堿、槐定堿、苦參堿與羧基、酚羥基均能結(jié)合，使氫核外電子云密度降低，氫化學(xué)位移向低場移動；苦參素因其中1個N 形成N-O 原子，故只有1個N 結(jié)合；秋水仙堿是酰胺堿，堿性極弱，與沒食子酸不成鹽，故化學(xué)位移無明顯變化。

復(fù)合鹽中主要存在離子作用力，而締合物則主要通過氫鍵作用相互連接而成，由于離子鍵作用力一般強于氫鍵，故在碳譜中的化學(xué)位移也存在明顯區(qū)別，將沒食子酸分別與生物堿及NaOH 配伍，用D2O 溶解后進行核磁碳譜檢測，結(jié)果見表3。由此可知，加入金雀花堿、槐定堿、苦參堿、苦參素后沒食子酸δC＝O、δ1-C值向低場位移，與秋水仙堿配伍后變化不明顯；沒食子酸與NaOH 配伍成鹽后，化學(xué)位移變化明顯，其中C ＝O、1-C 變化較大，并且兩者位移差值大于與生物堿配伍后，間接表明沒食子酸與生物堿并未以較強的離子作用力結(jié)合，推測兩者可能主要以氫鍵形式結(jié)合形成締合物，有一部分形成復(fù)鹽。生物堿上氨基與沒食子酸上羰基、酚羥基形成氫鍵后，吸電子效應(yīng)使得相應(yīng)官能團碳核外圍電子云密度降低，故δ值向低場位移，但由于生物堿堿性不同，故氨基與酚羥基結(jié)合情況也有所差異。

表3 沒食子酸-生物堿配伍的13C-NMR 化學(xué)位移Tab.3 13C-NMR chemical shifts of gallic acid-alkaloids compatibility

4 討論

本實驗以沒食子酸為研究對象，采用膜分離技術(shù)比較配伍前后存在狀態(tài)不同時透過率的變化情況，并結(jié)合紫外分光光度法和核磁技術(shù)探究酸堿復(fù)合物官能團的結(jié)構(gòu)特征。選擇堿性呈梯度變化的生物堿與沒食子酸反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)后者與pKa 差值不同的生物堿所生成的混合物在透過率下降程度、紫外最大吸收波長、氫化學(xué)位移方面存在差異，這主要是由于混合物存在狀態(tài)不同所致，沒食子酸與堿性較強的生物堿配伍形成的混合物中，締合物與復(fù)合鹽共存，而與堿性較弱的生物堿配伍后一般只生成締合物。

中藥復(fù)方配伍后不同成分之間發(fā)生相互作用，對中藥制劑過程中有效成分的提取、分離、精制均會產(chǎn)生影響，尤其是酸堿類成分配伍，更易產(chǎn)生反應(yīng)。由于很多影響藥品質(zhì)量的關(guān)鍵工藝與溶液中分子存在狀態(tài)有關(guān)，故明確酸堿類成分反應(yīng)的內(nèi)在機理、反應(yīng)物不同狀態(tài)的組成比例，以及復(fù)合物的結(jié)構(gòu)變化，對中藥復(fù)方湯劑臨床合煎、另煎及相關(guān)制劑生產(chǎn)工藝的制定具有重要意義。