呂圣蘭, 王有兵, 谷少華, 梁 沛, 張 雷, 高希武

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲學(xué)系, 北京 100193)

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda屬鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)，是美洲最重要的夜蛾科害蟲之一，危害玉米、高梁、水稻等作物(Luginbill, 1928; Vickery, 1929; Ashleyetal., 1989; Pogue, 2002; Augustoetal., 2010; Murúaetal., 2015)，也是世界性的農(nóng)業(yè)重要遷飛害蟲(Luginbill, 1928)。在美國(guó)和巴西，當(dāng)?shù)刂饕峭ㄟ^(guò)噴灑化學(xué)農(nóng)藥以及種植Bt玉米控制草地貪夜蛾的危害。與其他防治方法相比，化學(xué)防治具有成本低、效果快、效果好、使用方法簡(jiǎn)便以及防治對(duì)象廣等優(yōu)勢(shì)，是世界各國(guó)防治草地貪夜蛾的主要手段。自從2019年1月份草地貪夜蛾入侵我國(guó)云南地區(qū)后，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部推薦了12種化學(xué)殺蟲劑單劑，主要包括靶標(biāo)為門控氯離子通道的甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(甲維鹽)、門控鈉離子通道的茚蟲威和各種菊酯類藥劑(高效氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氟氯氰菊酯和甲氰菊酯)、魚尼丁受體的氯蟲苯甲酰胺和四氯蟲酰胺、乙酰膽堿酯酶的乙酰甲胺磷、昆蟲表皮的虱螨脲、煙堿型乙酰膽堿受體的乙基多殺菌素和線粒體的蟲螨腈(http:∥www.gov.cn/xinwen/2019-06/10/content_5398774.htm)。明確我國(guó)常用殺蟲劑對(duì)草地貪夜蛾的防治效果是進(jìn)行田間防治的基礎(chǔ)，室內(nèi)生物測(cè)定是我們快速而準(zhǔn)確地測(cè)定某種殺蟲劑對(duì)昆蟲毒力大小的手段，不合適的生物測(cè)定方法會(huì)導(dǎo)致生物測(cè)定實(shí)驗(yàn)的誤差。但到目前為止，關(guān)于每種殺蟲劑對(duì)草地貪夜蛾最適用的室內(nèi)生物測(cè)定方法還未確定。

對(duì)草地貪夜蛾的室內(nèi)生物測(cè)定方法，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的主要包括點(diǎn)滴法、飼料混藥法、飼料藥膜法、葉片藥膜法和浸蟲法等(Yu and McCord, 2007; Hardkeetal., 2011; Ríos-Díez and Saldamando-Benjumea, 2011; Bolzanetal., 2019; 趙勝園等, 2019)。Yu和McCord(2007)在測(cè)定美國(guó)不同地區(qū)草地貪夜蛾幼蟲對(duì)西維因、甲基對(duì)硫磷和二氯苯醚菊酯的抗性時(shí)，應(yīng)用了點(diǎn)滴法；Hardke等(2011)利用飼料混藥法測(cè)定氯蟲苯甲酰胺、溴氰蟲酰胺、高效氯氟氰菊酯和乙基多殺菌素等藥劑對(duì)草地貪夜蛾幼蟲的毒力大小；Bolzan等(2019)在監(jiān)測(cè)不同種群的草地貪夜蛾幼蟲對(duì)于氯蟲苯甲酰胺的抗性時(shí)使用了飼料藥膜法；趙勝園等(2019)利用葉片藥膜法確定了常用的21種農(nóng)藥對(duì)草地貪夜蛾幼蟲的防治效果；Ríos-Díez和Saldamando-Benjumea(2011)在測(cè)定氯氟氰菊酯和滅多威對(duì)不同地區(qū)的草地貪夜蛾幼蟲的殺蟲活性時(shí)利用了浸蟲法。

不同的化學(xué)殺蟲劑對(duì)草地貪夜蛾的作用方式不同，最適合的生物測(cè)定方法也不同，篩選針對(duì)每種殺蟲劑最合適的生物測(cè)定方法，對(duì)于草地貪夜蛾的防治至關(guān)重要。本研究運(yùn)用點(diǎn)滴法、飼料混藥法和葉片藥膜法測(cè)定了不同類型化學(xué)殺蟲劑對(duì)草地貪夜蛾的毒力，期望通過(guò)對(duì)生物測(cè)定結(jié)果的比較，篩選出針對(duì)這些藥劑最適用的室內(nèi)生物測(cè)定方法，為草地貪夜蛾的抗性監(jiān)測(cè)以及篩選合理有效的殺蟲藥劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

供試草地貪夜蛾于2019年5月30日采自廣西壯族自治區(qū)欽州市(21.94°N, 108.65°E)夏玉米田。將采集到的幼蟲在室內(nèi)用人工飼料(玉米面300 g、黃豆面100 g、酵母粉100 g、VC10 g、山梨酸2.5 g、檸檬酸2.5 g、紅霉素半片、丙酸5 mL、瓊脂25 g和水1 300 mL)飼養(yǎng)繁殖，以F1-F4代卵塊孵化后飼養(yǎng)的3齡幼蟲(每頭幼蟲體重約0.005 g)作為試驗(yàn)蟲源。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(26±1)℃，相對(duì)濕度75%±5%，光周期16L∶8D。

1.2 供試農(nóng)藥

95%氯蟲苯甲酰胺，購(gòu)自美國(guó)杜邦(上海)公司；92%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽，購(gòu)自河北沃德豐藥業(yè)有限公司；98%虱螨脲，由北京藥檢所提供(先正達(dá)公司生產(chǎn))；96%蟲螨腈，購(gòu)自江蘇維尤納特精細(xì)化工有限公司；93%高效氯氟氰菊酯，購(gòu)自江蘇農(nóng)藥研究所；90%乙酰甲胺磷，購(gòu)自徐州市利群化工有限公司；100%乙基多殺菌素，購(gòu)自美國(guó)陶氏益農(nóng)公司；Triton X-100購(gòu)自Amresco公司；丙酮和N,N-二甲基甲酰胺購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 母液配制

準(zhǔn)確稱取一定量的供試殺蟲劑原藥倒入20 mL的藥瓶中，用丙酮溶解甲維鹽、乙酰甲胺磷、蟲螨腈、高效氯氟氰菊酯、乙基多殺菌素和虱螨脲原藥，用N,N-二甲基甲酰胺溶解氯蟲苯甲酰胺原藥，溶解完全后，作為母液備用。

1.4 生物測(cè)定

1.4.1點(diǎn)滴法：用丙酮將母液稀釋成6～7個(gè)系列梯度。取直徑9 cm的培養(yǎng)皿放入足量的飼料，然后在每個(gè)培養(yǎng)皿中接入10頭3齡幼蟲(每頭幼蟲體重約0.005 g)，用10 μL的微量點(diǎn)滴器將藥劑滴在幼蟲的前胸背板上，每頭幼蟲接受的殺蟲劑體積為0.2 μL，每處理10頭蟲，重復(fù)3次，以丙酮作為對(duì)照，24 h后檢查結(jié)果。由于點(diǎn)滴過(guò)虱螨脲的幼蟲需要觀察72 h，長(zhǎng)大的草地貪夜蛾會(huì)自相殘殺，為防止影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們需要將點(diǎn)滴過(guò)此藥劑的幼蟲轉(zhuǎn)移到24孔板中，每孔接入1頭蟲，每處理8頭蟲，重復(fù)3次，以丙酮為對(duì)照，72 h后檢查結(jié)果。用毛筆輕觸幼蟲無(wú)反應(yīng)或者有明顯的中毒癥狀(畸形、顫搐、停止進(jìn)食等)則視為死亡。

1.4.2飼料混藥法：為了藥液在飼料中更均勻地分布，我們參照Hardke等(2011)方法并將其稍作改進(jìn)，首先用丙酮將母液稀釋成6～7個(gè)系列梯度，然后稱取7～8份20 g已完全凝固的飼料于自封袋中，然后分別取1 mL不同濃度的藥劑滴于飼料上，以丙酮為對(duì)照，通過(guò)不斷地揉捏、混勻，使藥劑均勻地分散在飼料中，然后將每份飼料分別放入3個(gè)培養(yǎng)皿中，在每個(gè)培養(yǎng)皿中接入10頭經(jīng)饑餓處理4 h的3齡幼蟲，重復(fù)3次，24 h后檢查結(jié)果。同上，混入虱螨脲的飼料放在24孔板中，每孔接入1頭經(jīng)饑餓處理4 h的幼蟲，每處理8頭蟲，重復(fù)3次，72 h后檢查結(jié)果。用毛筆輕觸幼蟲無(wú)反應(yīng)或者有明顯的中毒癥狀(畸形、顫搐、停止進(jìn)食等)則視為死亡。

1.4.3葉片藥膜法：用0.5% Triton X-100將藥劑按等比方法稀釋成6～7個(gè)濃度，采摘拔節(jié)期(有4～5片葉)未用藥且不含抗蟲基因的玉米葉片，洗凈晾干，剪成長(zhǎng)度為5 cm的長(zhǎng)方形，分別在藥液中浸泡20 s，取出后在吸水紙上晾干，然后放入培養(yǎng)皿中，每個(gè)皿中放入5～6個(gè)葉片，并接入10頭經(jīng)饑餓處理4 h的3齡幼蟲，每處理重復(fù)3次，以0.5% Triton X-100為對(duì)照，24 h后檢查結(jié)果。同上，浸泡過(guò)虱螨脲的葉片放在24孔板中，每孔接入1頭經(jīng)饑餓處理4 h的3齡幼蟲，每處理8頭蟲，重復(fù)3次，72 h后檢查結(jié)果。用毛筆輕觸幼蟲無(wú)反應(yīng)或者有明顯的中毒癥狀(畸形、顫搐、停止進(jìn)食等)則視為死亡。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)用POLO軟件(LeOra Software Inc., California, 美國(guó))計(jì)算毒力回歸方程的斜率值(b±SE)、LD50/LC50及其95%置信限及卡方值(χ2)等。

2 結(jié)果

2.1 不同生物生測(cè)方法測(cè)定的7種殺蟲劑對(duì)草地貪夜蛾3齡幼蟲的毒力

應(yīng)用點(diǎn)滴法、飼料混藥法和葉片藥膜法測(cè)定不同類型的7種殺蟲劑對(duì)草地貪夜蛾3齡幼蟲的毒力，結(jié)果見表1。

以點(diǎn)滴法進(jìn)行測(cè)定，甲維鹽對(duì)草地貪夜蛾3齡幼蟲的毒力最高，24 h的致死中量(LD50)最小(0.375 μg/g)；其次毒力由大到小依次為乙基多殺菌素、氯蟲苯甲酰胺、蟲螨腈、高效氯氟氰菊酯和乙酰甲胺磷，24 h的LD50值分別為1.840, 2.377, 15.882, 24.120和108.776 μg/g；而虱螨脲對(duì)3齡幼蟲的毒力最小，72 h的LD50值為261.107 μg/g(表1)。

以飼料混藥法進(jìn)行測(cè)定，乙基多殺菌素對(duì)草地貪夜蛾3齡幼蟲的毒力最高，24 h時(shí)的致死中濃度(LC50)最低(0.061 μg/g)；其次LC50值由低到高依次是虱螨脲、氯蟲苯甲酰胺、甲維鹽、蟲螨腈和高效氯氟氰菊酯，分別為2.400, 15.686, 26.512, 31.996和201.027 μg/g；而乙酰甲胺磷對(duì)3齡幼蟲的毒力最低，24 h的LC50值為9 426.217 μg/g(表1)。

表1 7種殺蟲劑對(duì)草地貪夜蛾3齡幼蟲的室內(nèi)生測(cè)結(jié)果Table 1 Laboratory bioassay results of seven insecticides against the 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperda

點(diǎn)滴法中藥劑單位μg/g，表示每g蟲重接受的殺蟲劑含量；飼料混藥法中藥劑單位μg/g，表示人工飼料中的殺蟲劑濃度；葉片藥膜法中藥劑單位mg/L，表示浸泡玉米葉片的殺蟲劑溶液的濃度。除虱螨脲處理72 h后統(tǒng)計(jì)幼蟲死亡率，其余6種藥劑處理均在24 h后統(tǒng)計(jì)幼蟲死亡率。The unit of pesticide in topical application method is μg/g, meaning the pesticide content per g of insect weight; the unit of pesticide in diet incorporation method is μg/g, meaning the concentration of the pesticides in feed; the unit of pesticide in leaf dipping method is mg/L, meaning the concentration of the pesticide solution soaking corn leaves. The mortality rates of larvae were counted at 24 h after exposure to the other six pesticides except for lufenuron, for which the mortality rate of larvae was counted at 72 h after exposure.

以葉片藥膜法進(jìn)行測(cè)定，甲維鹽對(duì)草地貪夜蛾3齡幼蟲的毒力最高，24 h的LC50值最低(0.062 mg/L)；其次LC50值由低到高依次是虱螨脲、乙基多殺菌素、蟲螨腈、氯蟲苯甲酰胺和乙酰甲胺磷，分別為0.062, 0.206, 0.379, 1.943, 2.174和345.534 mg/L；而高效氯氟氰菊酯對(duì)3齡幼蟲的毒力最低, 24 h的LC50值為471.343 mg/L(表1)。

2.2 不同生物測(cè)定方法測(cè)定的草地貪夜蛾種群在遺傳學(xué)上純度的比較

b值是毒力回歸曲線的斜率，代表所測(cè)試?yán)ハx種群中不同個(gè)體對(duì)藥劑敏感度的差異程度，數(shù)值越大，說(shuō)明種群整體在遺傳學(xué)上純度越高。在3種生物測(cè)定方法中，b值的范圍集中在1.0～4.0之間，點(diǎn)滴法在1.0～2.8之間，葉片藥膜法在1.5～3.6之間，而飼料混藥法的斜率值在1.1～6.4之間，點(diǎn)滴法和葉片藥膜法更準(zhǔn)確地反映了草地貪夜蛾種群在遺傳學(xué)上的純度(圖1)。

2.3 不同生物測(cè)定方法中草地貪夜蛾生物測(cè)定數(shù)據(jù)離散程度的比較

χ2值表示生測(cè)數(shù)據(jù)的離散程度，數(shù)值越小，說(shuō)明生測(cè)數(shù)據(jù)和理論值之間的差異越小，即方程的擬合程度越好。P值是對(duì)χ2的測(cè)驗(yàn)，應(yīng)大于0.05，即表明生測(cè)數(shù)據(jù)與理論數(shù)值之間的差異不顯著。3種生物測(cè)定方法中，點(diǎn)滴法的χ2值在1.6～7.7之間，平均值為4.04；P值在0.86～0.99之間，平均值為0.95。飼料混藥法的χ2值在4.1～11.2之間，平均值為7.58；P值在0.50～0.94之間，平均值為0.72。葉片藥膜法的χ2值在1.6～11.3之間，平均值為8.10；P值在0.39～0.90之間，平均值為0.68(表1)。即在離散程度上，點(diǎn)滴法的χ2最小，P值最大(圖2)。

圖1 不同生物測(cè)定方法測(cè)定草地貪夜蛾種群在遺傳學(xué)上純度的比較Fig. 1 Comparison of genetic purity of Spodopterafrugiperda populations in different bioassays1: 甲維鹽Emamectin benzoate; 2: 氯蟲苯甲酰胺Chlorantraniliprole; 3: 乙酰甲胺磷Acephate; 4: 蟲螨腈Chlorfenapyr; 5: 高效氯氟氰菊酯Lambda-Cyhalothrin; 6: 乙基多殺菌素Spinetoram; 7: 虱螨脲Lufenuron.

圖2 不同生物測(cè)定方法中草地貪夜蛾生物測(cè)定數(shù)據(jù)離散程度的比較Fig. 2 Comparison of discreteness of biometric data of Spodoptera frugiperda in different bioassaysA: 不同生物測(cè)定方法中的χ2值的大小Chi-square values in different bioassays; B: 不同生物測(cè)定方法中的P值的大小P-values in different bioassays. 1: 甲維鹽Emamectin benzoate; 2: 氯蟲苯甲酰胺Chlorantraniliprole; 3: 乙酰甲胺磷Acephate; 4: 蟲螨腈Chlorfenapyr; 5: 高效氯氟氰菊酯Lambda-Cyhalothrin; 6: 乙基多殺菌素Spinetoram; 7: 虱螨脲Lufenuron.

3 討論

草地貪夜蛾作為一種鱗翅目害蟲，對(duì)作物的危害期主要是在幼蟲時(shí)期，3齡幼蟲后對(duì)殺蟲劑的耐藥性顯著增強(qiáng)，因此我們選擇草地貪夜蛾的3齡幼蟲作為生物測(cè)定的對(duì)象。在查閱草地貪夜蛾幼蟲的生物測(cè)定方法時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)目前對(duì)于草地貪夜蛾幼蟲的生物測(cè)定方法多種多樣，我們收集并整理了國(guó)內(nèi)外關(guān)于草地貪夜蛾幼蟲的生物測(cè)定的文獻(xiàn)，其中11篇文獻(xiàn)中有6篇使用點(diǎn)滴法測(cè)定了甲維鹽、氯蟲苯甲酰胺和乙基多殺菌素等17種殺蟲劑對(duì)草地貪夜蛾幼蟲的毒力(Yuetal., 2003; Al-Sararetal., 2006; Yu and McCord, 2007; Carvalhoetal., 2013; Zhuetal., 2015; Gutiérrez-Morenoetal., 2018)，有2篇文獻(xiàn)使用飼料藥膜法測(cè)定了氯蟲苯甲酰胺、氟蟲雙酰胺和溴蟲腈等7種藥劑對(duì)草地貪夜蛾幼蟲的毒力(Boaventuraetal., 2019; Bolzanetal., 2019)，1篇使用飼料混藥法測(cè)定了氯蟲苯甲酰胺、高效氯氟氰菊酯和茚蟲威等8種藥劑對(duì)草地貪夜蛾的毒力(Hardkeetal., 2011)，1篇使用葉片藥膜法測(cè)定我國(guó)常用的21種殺蟲劑對(duì)草地貪夜蛾幼蟲的防治效果(趙勝園等, 2019)，1篇使用浸蟲法測(cè)定氯氟氰菊酯和滅多威對(duì)美國(guó)和阿根廷地區(qū)的草地貪夜蛾種群中幼蟲的毒力大小(Ríos-Díez and Saldamando-Benjumea, 2011)，說(shuō)明點(diǎn)滴法在國(guó)外被更廣泛地用于各種類型殺蟲劑對(duì)草地貪夜蛾幼蟲的室內(nèi)生物測(cè)定中。此外，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)于草地貪夜蛾3齡幼蟲，點(diǎn)滴法操作簡(jiǎn)便，精確度高，每頭試蟲的受藥量一致，受藥部位一致；而飼料混藥法和葉片藥膜法無(wú)法確定草地貪夜蛾幼蟲的取食量，即無(wú)法確定每頭幼蟲接受殺蟲劑的量，在室內(nèi)生物測(cè)定中，接受藥劑量的差異可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，這是點(diǎn)滴法相對(duì)于飼料混藥法和葉片藥膜法所具有的優(yōu)勢(shì)。

本研究分別用點(diǎn)滴法、飼料混藥法和葉片藥膜法測(cè)定了不同類型的7種殺蟲劑(氯蟲苯甲酰胺、甲維鹽、乙酰甲胺磷、高效氯氟氰菊酯、蟲螨腈、乙基多殺菌素和虱螨脲)對(duì)草地貪夜蛾3齡幼蟲的毒力大小，通過(guò)對(duì)比3種生物測(cè)定方法的斜率值(b值)，我們發(fā)現(xiàn)點(diǎn)滴法和葉片藥膜法的數(shù)值區(qū)間為1.0～3.6，遠(yuǎn)小于飼料混藥法的b值區(qū)間，與所有生物測(cè)定求得的b值區(qū)間重合度高(圖1)，說(shuō)明這兩種方法測(cè)出的遺傳一致性更加符合廣西種群的草地貪夜蛾情況。進(jìn)一步通過(guò)比較3種不同生物測(cè)定方法在不同類型殺蟲劑生物測(cè)定結(jié)果中的離散程度，結(jié)果顯示點(diǎn)滴法在所有殺蟲劑的生物測(cè)定結(jié)果中是重復(fù)性最好的，每個(gè)藥劑的離散程度(χ2值)和對(duì)離散程度的測(cè)試(P值)是最好的(圖2)。從點(diǎn)滴法、飼料混藥法和葉片藥膜法中不同藥劑的致死中量/濃度(表1)可以看出，除虱螨脲之外，不同的生物測(cè)定方法中幾種常用殺蟲劑對(duì)草地貪夜蛾幼蟲的毒力大小的趨勢(shì)基本是一致的(甲維鹽和乙基多殺菌素在3種方法中的殺蟲活性都較高，乙酰甲胺磷和高效氯氟氰菊酯對(duì)草地貪夜蛾幼蟲的殺蟲活性在3種方法中都較低),在虱螨脲對(duì)草地貪夜蛾幼蟲的毒力測(cè)定中，點(diǎn)滴法中虱螨脲的毒力顯著低于其他兩種方法。姚永生等(2008)通過(guò)對(duì)棉鈴蟲的毒力測(cè)定發(fā)現(xiàn),虱螨脲濃度在低于10 mg/kg時(shí)，對(duì)棉鈴蟲的主要作用方式是胃毒作用，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。因此，對(duì)于甲維鹽、氯蟲苯甲酰胺、乙酰甲胺磷、高效氯氟氰菊酯、蟲螨腈和乙基多殺菌素，3種生物測(cè)定的方法都可用，點(diǎn)滴法是最適合的生物測(cè)定方法，而對(duì)虱螨脲，比較適合的生物測(cè)定方法是飼料混藥法和葉片藥膜法。這與幾種殺蟲劑的作用方式有關(guān)，甲維鹽、氯蟲苯甲酰胺、乙酰甲胺磷、蟲螨腈、高效氯氟氰菊酯和乙基多殺菌素，因?yàn)閷?duì)草地貪夜蛾幼蟲有良好的胃毒和觸殺作用，所以可以選擇不同的生物測(cè)定方法，我們推薦使用點(diǎn)滴法。而虱螨脲因?yàn)樵诘蜐舛葧r(shí)基本無(wú)觸殺作用，因此在室內(nèi)測(cè)定不同類型的殺蟲劑對(duì)于草地貪夜蛾防效時(shí)，建議使用一些以胃毒方式為主的生測(cè)方法，例如飼料混藥法或者葉片藥膜法。本研究為選擇草地貪夜蛾對(duì)不同類型殺蟲劑室內(nèi)生物測(cè)定方法提供了依據(jù)，為我國(guó)草地貪夜蛾對(duì)不同類型殺蟲劑的抗性監(jiān)測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。