趙保國，蔣蘇丹，汪長天，伍賢軍,2*，李萍萍,2*

1(南京林業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京，210037)2(南京林業(yè)大學(xué),江蘇省南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京，210037)

藻藍(lán)蛋白是存在于藻類中的捕光色素蛋白。從螺旋藻中獲取的C-藻藍(lán)蛋白(C-phycocyanin，C-PC)在醫(yī)療保健、食品添加劑、化妝品著色劑和熒光染料等方面有廣泛的應(yīng)用前景[1]，特別是其抗氧化、抗癌、抗炎和增強(qiáng)免疫力的功能引起廣泛的關(guān)注[2-4]。C-藻藍(lán)蛋白由α和β亞基組成，開鏈的四吡咯藻藍(lán)色素(phycocyanobilin，PCB)共價結(jié)合在蛋白質(zhì)保守性半胱氨酸結(jié)合位點上。由于從分子水平上對PCB生物合成過程的解析以及對藻藍(lán)蛋白裂合酶的鑒定，C-藻藍(lán)蛋白α和β亞基均可在大腸桿菌體內(nèi)重組產(chǎn)生。其中，β亞基脫輔基蛋白可在藻膽蛋白裂合酶(phycobiliprotein lyase，CpcS)的催化下結(jié)合PCB[5]。而PCB來源于對大腸桿菌血紅素底物的氧化還原反應(yīng)，即在血紅素氧化酶(heme oxidase-1，HO1)的作用下將血紅素轉(zhuǎn)化成膽綠素(biliverdin，BV)，在膽綠素還原酶(ferredoxin oxidoreductase，PcyA)的作用下最終合成PCB。研究表明，大腸桿菌重組藻藍(lán)蛋白β亞基(β-subunit of C-phycocyanin，CpcB)展現(xiàn)出顯著的抗氧化和自由基清除活性[6-8]。為獲取在大腸桿菌體內(nèi)重組的外源蛋白，通常需要破碎細(xì)胞，這經(jīng)常會導(dǎo)致熱原水平和樣品雜質(zhì)的增加以及蛋白質(zhì)活性的降低。特別地，當(dāng)目的蛋白在胞內(nèi)過量表達(dá)時，會形成包涵體。在重組藻藍(lán)蛋白的過程中，通常用降低表達(dá)溫度的方法減少包涵體的形成，使得色素蛋白能有效合成和正確折疊[9]。但是對于大量生產(chǎn)和工業(yè)發(fā)酵，這會降低產(chǎn)量和增加生產(chǎn)成本。為了克服這些缺陷，采用胞外分泌重組藻藍(lán)蛋白是有效的方法。為促進(jìn)重組蛋白的胞外分泌，各種策略被廣泛研究，如信號肽優(yōu)化[10]、細(xì)胞質(zhì)滲漏[11]、分子伴侶共表達(dá)[12]等。除此之外，還可以對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，如調(diào)整溫度，改變誘導(dǎo)劑以及使用影響細(xì)胞膜通透性的化學(xué)物，如甘氨酸、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)和Tween-80等[13-15]。通過這些方法可以顯著強(qiáng)化重組蛋白的分泌。目前，藻藍(lán)蛋白胞外分泌的特征及影響因素并不清楚，特別是藻藍(lán)蛋白的色素化增加了胞外分泌的復(fù)雜性。本研究通過改變溫度，利用乳糖作為誘導(dǎo)劑，利用培養(yǎng)基添加劑等方式促進(jìn)螺旋藻重組熒光藻藍(lán)蛋白CpcB的胞外分泌，并以藻藍(lán)蛋白熒光強(qiáng)度為表征[16]，探討影響藻藍(lán)蛋白胞外分泌的因素。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

含有表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-cpcB-cpcS∶∶ho1 ∶∶pcyA的重組E.coliBL21(DE3)菌株pBSA，由本實驗室構(gòu)建并保存[6]，其中表達(dá)載體pETDuet-1，購于Novagen公司，藻藍(lán)蛋白β亞基脫輔基蛋白編碼基因cpcB來自鹽澤螺旋藻SpirulinasubsalsaFACHB351，藻藍(lán)蛋白裂合酶編碼基因cpcS、血紅素氧化酶編碼基因ho1、膽綠素還原酶編碼基因pcyA，均來自于Nostocsp. PCC 7120。

蛋白胨、酵母粉，OXOID公司；甘油、氨芐西林，盛興生物科技有限公司；異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)，北京博奧拓達(dá)科技公司產(chǎn)品；乳糖，上海凜恩科技發(fā)展有限公司；甘氨酸和Triton X-100，廣州賽國生物科技有限責(zé)任公司；SDS，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；Tween-80，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Lambda 365紫外/可見分光光度計和LS 55熒光光譜儀, 美國Perkin Elmer公司；ZWY-240恒溫?fù)u床, 上海智誠分析儀器制造有限公司；MIKRO 200R高速離心機(jī), 德國Hettich公司；BG-verMIDI蛋白質(zhì)電泳儀，北京百晶生物技術(shù)有限公司；Sigma 3-18KS冷凍離心機(jī)，德國Sigma離心機(jī)有限公司；GenoSens1850凝膠成像儀, 上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)及重組蛋白表達(dá)

少量接種實驗室保存的重組菌株pBSA到5 mL含100 mg/L氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床中，37 ℃、150 r/min過夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接0.5 mL過夜培養(yǎng)的新鮮菌液到50 mL TB培養(yǎng)基中，在37 ℃、220 r/min的條件下繼續(xù)培養(yǎng)，直到OD600值為0.6，4 ℃保存。

為研究表達(dá)溫度對重組熒光藻藍(lán)蛋白胞外分泌的影響，按照上述方法培養(yǎng)3組50 mL菌液，添加或不添加1 mmol/L的IPTG的情況下，分別置于溫度為16、25、37 ℃的恒溫?fù)u床中200 r/min培養(yǎng)，每隔12 h取3 mL菌液，12 000 r/min離心10 min棄沉淀，取培養(yǎng)基上清液，檢測CpcB的熒光強(qiáng)度。實驗獨立重復(fù)3次，最終培養(yǎng)基中CpcB的熒光強(qiáng)度取3次平均值。

為研究誘導(dǎo)劑乳糖對CpcB胞外分泌的影響，分別轉(zhuǎn)接0.5 mL過夜培養(yǎng)的新鮮菌液到6組50 mL TB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)，直到OD600值為0.6，冰浴30 min。各組分別加入終質(zhì)量濃度為5、7.5、10、15、20 g/L的乳糖，并以未加乳糖的作為對照。置于搖床，200 r/min，25 ℃誘導(dǎo)表達(dá)24 h，取3 mL菌液12 000 r/min離心20 min棄沉淀，取培養(yǎng)基上清液檢測CpcB的熒光強(qiáng)度和OD600值。實驗獨立重復(fù)3次，最終數(shù)據(jù)取3次平均值。

為探索培養(yǎng)基添加劑(甘氨酸，Triton X-100，SDS，Tween-80)對CpcB胞外分泌的影響，按照上述方法培養(yǎng)若干50 mL的重組大腸桿菌菌液冰浴。菌液分成4大組，每1大組分成6小組，加1種添加劑。其中甘氨酸的終質(zhì)量濃度為15、20、25、30、35 g/L，Triton X-100的終體積分?jǐn)?shù)為0.1%、0.2%、0.5%、0.7%和1%，SDS的終質(zhì)量濃度為0.5、1、2、5、10 g/L，Tween-80的終體積分?jǐn)?shù)為1%、1.5%、2%、2.5%和5%，并以未加添加劑的菌液為對照，置于搖床中200 r/min培養(yǎng)24 h，取3 mL菌液12 000 r/min離心20 min棄沉淀，取培養(yǎng)基上清檢測CpcB熒光強(qiáng)度。實驗獨立重復(fù)3次，最終數(shù)據(jù)取3次平均值。

1.3.2 重組蛋白純化、聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)及鋅電泳

為確認(rèn)重組蛋白CpcB的光譜特征和分子質(zhì)量，用100 mL的TB培養(yǎng)基在200 r/min，25 ℃條件下表達(dá)重組菌株24 h，全部菌液12 000 r/min離心20 min棄沉淀，取上清對培養(yǎng)基中的CpcB進(jìn)行純化，并取少量的培養(yǎng)基制備電泳樣品，準(zhǔn)備SDS-PAGE電泳。由于表達(dá)載體pETDuet含有His標(biāo)簽，故可以利用鎳離子親和層析柱進(jìn)行蛋白質(zhì)的純化，并透析去除咪唑[8]。純化后的CpcB溶液可用于光譜分析；同時取少量CpcB溶液制備電泳樣品。制備好的蛋白質(zhì)樣品用12%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳完成后將蛋白質(zhì)膠用 1.5 mol/L 醋酸鋅溶液浸泡15 min染色，置于凝膠成像儀中用紫外光照射成像，凝膠再用考馬斯亮藍(lán)染色后成像。

1.3.3 熒光檢測和光譜分析

利用熒光光譜儀(Perkin Elmer LS 55，美國)檢測胞外培養(yǎng)基CpcB的熒光強(qiáng)度，所用激發(fā)波長為600 nm，收集的熒光發(fā)射波長為640 nm。由于重組熒光藻藍(lán)蛋白的熒光強(qiáng)度和表達(dá)量在一定范圍內(nèi)存在線性關(guān)系[16]。故可以通過熒光強(qiáng)度反映藻藍(lán)蛋白的產(chǎn)量，即可以通過培養(yǎng)基熒光CpcB的熒光強(qiáng)度大致反映胞外分泌的CpcB濃度。利用熒光光譜儀檢測胞外培養(yǎng)基CpcB的熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長為600 nm。光譜掃描范圍300～800 nm，光譜掃描速度1 200 nm/min，狹縫寬度10.0 nm。吸收光譜用紫外可見分光光度計檢測，光譜掃描范圍200～800 nm，掃描速度960 nm/min，狹縫寬度1.0 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對CpcB胞外分泌的影響

在大腸桿菌胞內(nèi)合成藻藍(lán)蛋白的過程中，最佳溫度常設(shè)定在18 ℃左右[9]。本研究中，首先參照胞內(nèi)合成的條件，在16 ℃的條件下加入1 mmol/L的IPTG表達(dá)CpcB直到60 h，如圖1-a所示，胞外培養(yǎng)基中沒有檢測到任何CpcB熒光；在沒有IPTG的條件下，如圖1-b所示，也沒有檢測到熒光。低溫下胞內(nèi)合成的藻藍(lán)蛋白不向胞外分泌，這可能與低溫抑制細(xì)胞的生長率和轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)有關(guān)[17]。而在37 ℃，無論是添加IPTG還是沒有添加IPTG，都不能檢測到培養(yǎng)基中CpcB的熒光。較高溫度下過表達(dá)的蛋白質(zhì)容易形成包涵體并在內(nèi)膜附近積累，阻斷蛋白質(zhì)的易位通道，減少分泌[18]。另外，藻藍(lán)蛋白的色素化也可能受阻。在25 ℃沒有IPTG存在的情況下，如圖1-b所示，表達(dá)24 h后培養(yǎng)基展現(xiàn)明顯的CpcB熒光，并且隨著表達(dá)時間的增加，熒光強(qiáng)度逐步升高。這些結(jié)果表明溫度是影響胞外分泌的關(guān)鍵因素，而25 ℃是促進(jìn)藻藍(lán)蛋白胞外分泌的較好溫度，這與先前研究的其他蛋白胞外分泌最佳溫度一致[13]，表達(dá)溫度應(yīng)該保持細(xì)胞生長和蛋白合成的平衡以促使胞外分泌。

a-不同溫度有IPTG誘導(dǎo)對培養(yǎng)基CpcB熒光強(qiáng)度的影響； b-不同溫度無IPTG誘導(dǎo)對培養(yǎng)基CpcB熒光強(qiáng)度的影響
圖1 溫度對胞外培養(yǎng)基CpcB熒光強(qiáng)度的影響
Fig.1 Effect of temperature on the fluorescence intensity of the extracellular CpcB in medium

本研究中，誘導(dǎo)劑IPTG的存在使得胞外CpcB產(chǎn)生受阻，這可能與IPTG抑制細(xì)菌生長及自身蛋白的表達(dá)，影響重組CpcB的分泌通道有關(guān)。不過先前的研究利用IPTG誘導(dǎo)外源蛋白在信號肽的作用下是可以分泌的[14]，有可能歸因于先前研究中信號肽的強(qiáng)化作用，但需要進(jìn)一步的證實。檢測胞外培養(yǎng)基熒光發(fā)射光譜，如圖2所示，在644 nm處展現(xiàn)最大熒光發(fā)射峰，這和先前CpcB的光譜特征一致[6]。

圖2 大腸桿菌25℃表達(dá)24 h后胞外培養(yǎng)基CpcB的 熒光發(fā)射光譜
Fig.2 Fluorescence emission spectrum of the extracellular CpcB expressed byE.colifor 24 h at 25℃

為進(jìn)一步鑒定培養(yǎng)基中的CpcB，25 ℃表達(dá)100 mL重組細(xì)胞，24 h后對培養(yǎng)基進(jìn)行純化，檢測純化后蛋白溶液的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。如圖3-a﹑圖3-b所示，純化后蛋白溶液展現(xiàn)出621 nm的最大吸收值和644 nm的最大熒光發(fā)射值，這與先前胞內(nèi)合成的CpcB光譜特征完全一致[6]。取純化前后的胞外培養(yǎng)基進(jìn)行SDS-PAGE電泳。如圖4所示，由于對培養(yǎng)基中CpcB的純化不佳，存在非特異性條帶，但純化前后培養(yǎng)基能看出在20 kDa左右有條帶。凝膠鋅離子染色后，純化前CpcB條帶有較弱的熒光，純化后CpcB條帶有較強(qiáng)的熒光。這些結(jié)果都表明分泌到胞外培養(yǎng)基中的CpcB的光譜特征和分子質(zhì)量與胞內(nèi)合成的一致[6]。

a-胞外培養(yǎng)基中CpcB純化后吸收光譜；b-胞外培養(yǎng)基中 CpcB純化后熒光發(fā)射光譜
圖3 純化胞外培養(yǎng)基CpcB的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜
Fig.3 Absorption spectrum and fluorescence emission spectrum of the purified extracellular CpcB in medium

1、 4-蛋白質(zhì)marker；2-培養(yǎng)基中CpcB純化前考馬斯亮藍(lán)染色； 3-培養(yǎng)基中CpcB純化后考馬斯亮藍(lán)染色；5-培養(yǎng)基中CpcB純化前 鋅離子染色；6-培養(yǎng)基中CpcB純化后鋅離子染色；箭頭指示CpcB位置
圖4 胞外培養(yǎng)基CpcB純化前后的SDS-PAGE和 鋅電泳分析
Fig.4 Analysis of the extracellular CpcB in medium before and after purification by gradient SDS-PAGE and chromoprotein Zn2+electrophoresis

2.2 乳糖作為誘導(dǎo)劑對CpcB胞外分泌的影響

基于T7為啟動子的表達(dá)系統(tǒng)除了可以用IPTG，還可以用乳糖誘導(dǎo)表達(dá)。為了驗證乳糖誘導(dǎo)重組藻藍(lán)蛋白的表達(dá)及胞外分泌情況，按照實驗方法1.3.1在25 ℃添加乳糖表達(dá)藻藍(lán)蛋白。結(jié)果如圖5-a所示，表達(dá)24 h后，與沒有添加乳糖相比，添加乳糖的重組體系培養(yǎng)基中CpcB的熒光強(qiáng)度顯著增加，當(dāng)乳糖的質(zhì)量濃度為10 g/L時，培養(yǎng)基CpcB的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值，是沒加乳糖時的5.1倍。10 g/L的乳糖是誘導(dǎo)CpcB胞外分泌的最佳濃度，這與先前的乳糖誘導(dǎo)胞外脫乙酰幾丁質(zhì)酶最佳濃度一致[14]。如圖5-b所示，添加乳糖后細(xì)胞OD600值也有少量增加，乳糖促進(jìn)細(xì)胞的生長。乳糖無毒廉價、不抑制細(xì)胞生長、不影響分泌通道的形成，甚至可以為細(xì)胞生長提供碳源，這有益于可溶性蛋白的表達(dá)。先前的研究也表明比起IPTG，乳糖是蛋白異源表達(dá)和胞外分泌更好的誘導(dǎo)劑[14, 19]。

a-乳糖對熒光強(qiáng)度的影響；b-乳糖對細(xì)胞生長的影響
圖5 乳糖誘導(dǎo)對胞外培養(yǎng)基CpcB熒光強(qiáng)度的影響
Fig.5 Effect of lactose on the fluorescence intensity of the extracellular CpcB in medium

2.3 培養(yǎng)基添加劑對CpcB胞外分泌的影響

通過補(bǔ)充培養(yǎng)基添加劑改變細(xì)胞膜通透性或增強(qiáng)周質(zhì)空間的滲透壓是增加外源蛋白胞外分泌的重要途徑[13]。為了解培養(yǎng)基添加劑對藻藍(lán)蛋白胞外分泌的影響，按照實驗方法1.3.1分別向培養(yǎng)基中添加不同濃度的甘氨酸、Triton X-100、SDS和Tween-80等化學(xué)物。當(dāng)添加甘氨酸時，結(jié)果如圖6-a所示，甘氨酸顯著增加胞外培養(yǎng)基CpcB的熒光強(qiáng)度。當(dāng)甘氨酸的終質(zhì)量濃度為25 g/L時，培養(yǎng)基熒光強(qiáng)度最高，是未加甘氨酸的5.1倍。甘氨酸作為增強(qiáng)重組蛋白胞外分泌的有效添加劑被廣泛研究，如ZOU等[19]通過加入10 g/L的甘氨酸將胞外支鏈淀粉酶的活性提高8.3倍；HUANG等[14]加入1%的甘氨酸使得胞外脫乙酰幾丁質(zhì)酶活性增加2.4倍；VON ROMAN等[20]用20 g/L的甘氨酸和180 mmol/L的Tris使得SpA產(chǎn)量增加40倍。其機(jī)制是重組蛋白胞內(nèi)合成后部分被遷移到周質(zhì)空間，細(xì)胞質(zhì)外膜為平衡壓力釋放少量的蛋白到培養(yǎng)基中，而甘氨酸插入肽聚糖、破壞細(xì)胞外膜的完整性，強(qiáng)化重組蛋白從周質(zhì)空間到培養(yǎng)基的分泌[21-22]。表面活性劑Triton X-100和SDS也被認(rèn)為是改善重組蛋白胞外分泌的有效添加劑[15, 23]。但在本研究中，添加Triton X-100和SDS到培養(yǎng)基中，結(jié)果如圖6-b、圖6-c所示，培養(yǎng)基CpcB的熒光強(qiáng)度并沒有明顯增強(qiáng)。Triton X-100對外膜的影響機(jī)制是破壞脂質(zhì)雙層膜[22,24]；而SDS抑制脂肪酸的合成，導(dǎo)致膜磷脂合成不足[23]。故Triton X-100和SDS對細(xì)胞膜的破壞比甘氨酸要強(qiáng)很多，這可能是造成它們不如甘氨酸有效的重要原因。另外，熒光藻藍(lán)蛋白的合成需要PCB和脫輔基蛋白CpcB的結(jié)合，推測Triton X-100和SDS有可能干擾CpcB和PCB的連接，但這需要進(jìn)一步的證實。少量的Tween也能增強(qiáng)膜的通透性。劉軍等[25]報道添加適量的Tween-80可提高胞外蛋白酶的酶活。本研究添加體積分?jǐn)?shù)為1.5%的Tween-80到培養(yǎng)基中，如圖6-d所示，培養(yǎng)基CpcB熒光強(qiáng)度增加2.5倍。重組藻藍(lán)蛋白胞外分泌不僅受到單個因素的影響，各因素之間也相互影響，特別是不同添加劑之間的協(xié)同效應(yīng)[15]。進(jìn)一步的研究可對表達(dá)溫度、乳糖、甘氨酸及Tween-80等因素進(jìn)行協(xié)同考慮，獲得最優(yōu)的表達(dá)條件，高效地提升藻藍(lán)蛋白的胞外分泌。

圖6 培養(yǎng)基添加劑對胞外CpcB熒光強(qiáng)度的影響
Fig.6 Effect of medium additives on the fluorescence intensity of the extracellular CpcB

3 結(jié)論

藻藍(lán)蛋白是被廣泛報道的生物活性物質(zhì)。為促使大腸桿菌重組藻藍(lán)蛋白β亞基CpcB分泌到胞外培養(yǎng)基中，對溫度、誘導(dǎo)劑和培養(yǎng)基添加劑等因素研究后發(fā)現(xiàn),25 ℃未加誘導(dǎo)劑的條件下，CpcB表達(dá)24 h胞外培養(yǎng)基展現(xiàn)CpcB的熒光，藻藍(lán)蛋白能分泌到培養(yǎng)基；加入IPTG誘導(dǎo)或者在16 ℃或37 ℃的條件下，胞外培養(yǎng)基沒有明顯的熒光；添加10 g/L的乳糖誘導(dǎo)表達(dá)，胞外培養(yǎng)基CpcB的熒光強(qiáng)度提高5.1倍；添加25 g/L的甘氨酸改變細(xì)胞膜的通透性可使胞外培養(yǎng)基CpcB的熒光強(qiáng)度提高6.3倍，添加體積分?jǐn)?shù)為1.5%的Tween-80胞外CpcB熒光強(qiáng)度也增加2.5倍，而Triton X-100和SDS并沒有改善熒光CpcB的胞外分泌。該研究為促進(jìn)重組藻藍(lán)蛋白胞外分泌，提高藻藍(lán)蛋白異源生產(chǎn)的效率提供參考。