馮瀟，包璇，向沙沙，沈宇標(biāo)，應(yīng)軒宇，應(yīng)劍，紀(jì)偉，朱炫*

1(浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州，310000)2(浙江清華長(zhǎng)三角研究院，浙江 嘉興，314000) 3(中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司，北京，100000)

鈷卟啉(又稱鈷胺素、VB12)是唯一一種含有金屬元素的維生素。鈷卟啉的核心為中心咕啉環(huán)(圖1)，由4個(gè)相連的吡咯和螯合在中心的3價(jià)鈷離子構(gòu)成。環(huán)上方的Coβ配基不同則會(huì)形成不同形式的鈷卟啉，例如,和鈷離子相連的是—CN，則稱為氰鈷胺，—CH3則為甲鈷胺。

圖1 鈷卟啉的結(jié)構(gòu)圖
Fig.1 The structure of vitamin B12

鈷卟啉是唯一一種需要腸道分泌物(內(nèi)源因子)幫助才能被吸收的維生素。因此腸道健康對(duì)鈷卟啉的代謝利用非常重要。氰鈷胺是鈷卟啉中口服吸收最快的化合物，但不能被機(jī)體直接利用，需要在體內(nèi)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化生成甲鈷胺和腺苷鈷胺后方可起效。與氰鈷胺相比，甲鈷胺能夠較好地分布到神經(jīng)組織，因此在治療周?chē)窠?jīng)病變方面，甲鈷胺臨床應(yīng)用的安全性及療效均優(yōu)于氰鈷胺；而氰鈷胺的主要適應(yīng)癥為巨幼紅細(xì)胞性貧血。

許多研究認(rèn)為，鈷卟啉之所以能調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，是因?yàn)殁掃策窃松锖驮孱惿L(zhǎng)的限制性因子[1]。大多數(shù)微生物體內(nèi)存在不可替代的鈷卟啉依賴通路，卻缺乏合成鈷卟啉的基因。由于外界環(huán)境中可獲得的鈷卟啉水平有限，因此鈷卟啉的攝入影響腸道菌群的生長(zhǎng)及代謝。在腸道細(xì)菌從環(huán)境中獲得鈷卟啉的過(guò)程中，Btu家族蛋白具有核心作用[2]，其不同的家族成員負(fù)責(zé)不同結(jié)構(gòu)鈷卟啉的轉(zhuǎn)運(yùn)[3]。BERTRAND等[4]發(fā)現(xiàn)在低VB12的環(huán)境中，VB12轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)量會(huì)上升以便攝取更多VB12。由于不同腸道菌群之間對(duì)VB12存在競(jìng)爭(zhēng)，很可能改變菌群的組成和功能表達(dá)的變化[5]。例如，鈷卟啉刺激腸出血性大腸桿菌的Stx2基因表達(dá)，從而促進(jìn)志賀毒素的產(chǎn)生[6]。

體外模擬結(jié)腸發(fā)酵模型是一種體外微生物培養(yǎng)體系，可以模擬人體腸道菌群的生長(zhǎng)和代謝，適用于研究人體腸道微生態(tài)和食品微生物消化。該模型尤其適用于考察食品中的營(yíng)養(yǎng)素與腸道微環(huán)境的相互作用。ALEXANDRA等[7]在體外單相連續(xù)發(fā)酵模型中接種固定化的兒童糞便菌群，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鐵缺乏會(huì)削弱微生物群的屏障作用，對(duì)腸道健康產(chǎn)生負(fù)面影響。BOTHE等[8]利用計(jì)算機(jī)控制的大腸近端模型TIM-2系統(tǒng)評(píng)估了不同劑量乳果糖的益生作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每天攝入5 g乳果糖，連續(xù)5 d后，能提高腸道中雙歧桿菌屬和乳酸菌豐度，增加丁酸和乳酸的含量。

本研究的目的，是在現(xiàn)有體外結(jié)腸發(fā)酵模型的基礎(chǔ)上，優(yōu)化培養(yǎng)基和發(fā)酵氣體環(huán)境；開(kāi)發(fā)電子鼻快速檢測(cè)方法判定腸道菌群的穩(wěn)定性，從而建立可用于體外快速評(píng)價(jià)的多相連續(xù)結(jié)腸發(fā)酵模型。利用優(yōu)化的系統(tǒng)，探討甲鈷胺和氰鈷胺這2種不同結(jié)構(gòu)的鈷卟啉對(duì)腸道微生態(tài)的調(diào)控作用，考察對(duì)腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的影響，為開(kāi)發(fā)預(yù)防腸道疾病和治療腸病的藥物及功能性食品提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PBS緩沖液、蛋白胨、酵母提取物、胰蛋白胨、L-半胱氨酸鹽酸、豬膽鹽、3號(hào)膽鹽、血紅素、果膠、淀粉、葡萄糖、黏液素、NaCl、KCl、NaHCO3、K2HPO4、KH2PO4、MgCl2·6H2O、CaCl2·6H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、MnCl2·4H2O、七水硫酸鈷、ZnSO4·7H2O、六水氯化鎳、CuSO4·5H2O、N2(純度≥99.999%)、 CO2(純度≥99.999%)、甲鈷胺、氰鈷胺、DP320 TIANGEN細(xì)菌基因組提取試劑盒，TIANGEN公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CP413電子精密天平,上海奧豪斯儀器有限公司；AW400SG/TG厭氧工作站,英國(guó)Electrotek公司；TGL-16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；CHA-S恒溫振蕩培養(yǎng)箱，常州國(guó)華電器有限公司；NanoDrop ND2000超微量分光光度計(jì),Gene Company Limited；合作設(shè)計(jì)四聯(lián)玻璃發(fā)酵罐上海百倫生物科技有限公司；DK.8D恒溫水浴鍋,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電子鼻由實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵裝置的優(yōu)化

1.3.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與樣品采集

選擇5名健康青年的糞便5 g，混合后在厭氧工作站中將糞便溶解于200 mL的PBS緩沖液， 600 r/min離心1 min，得到糞便細(xì)菌提取液。

1.3.1.2 正交實(shí)驗(yàn)探究靜態(tài)發(fā)酵最佳培養(yǎng)基成分

對(duì)無(wú)機(jī)鹽、膽鹽、果膠、淀粉、葡萄糖、胰酶、黏液素這7個(gè)因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，共得到8種培養(yǎng)基，如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experimental design

其中，簡(jiǎn)單無(wú)機(jī)鹽配方(g/L)：NaCl 0.1、K2HPO40.04、KH2PO40.04、MgSO4·7H2O 0.01、CaCl2·6H2O 0.01、NaHCO32.0;復(fù)雜無(wú)機(jī)鹽配方(g/L)：NaCl 4.5、KCl 2.5、KH2PO40.4、MgCl2·6H2O 4.5、CaCl2·6H2O 0.2、MgSO4·7H2O 3.0、FeSO4·7H2O 0.1、CaCl2·2H2O 0.1、MnCl2·4H2O 0.32、七水硫酸鈷0.18、CuSO4·5H2O 0.01、ZnSO4·7H2O 0.18、六水氯化鎳0.092;不變的基礎(chǔ)成分(g/L)：蛋白胨 3.0、酵母提取物4.5、胰蛋白胨3.0、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.8、膽鹽0.4、血紅素0.05。

配制8種培養(yǎng)基各200 mL，接種10 mL的糞便菌，通N25 min后密封， 37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，每24 h取樣并測(cè)定OD600吸光值。取發(fā)酵樣液后用DP320 TIANGEN細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌DNA并送至聯(lián)川生物公司進(jìn)行16S rRNA測(cè)序分析[9]。

1.3.1.3 體外發(fā)酵氣體環(huán)境

搭建5組體外模擬單相發(fā)酵系統(tǒng)，初始培養(yǎng)基為300 mL，接種15 mL的糞便菌懸液后，先進(jìn)行24 h的靜態(tài)發(fā)酵以穩(wěn)定菌群。24 h后設(shè)置流速為12.5 mL/h，37 ℃、pH 6.8恒溫發(fā)酵7 d。5個(gè)發(fā)酵罐內(nèi)分別通100%N2(純度≥99.999%)、80% N2和20% CO2(純度≥99.999%)混合氣、50%N2和50% CO2混合氣、20%N2和80% CO2混合氣、100% CO2以保持發(fā)酵罐內(nèi)的厭氧環(huán)境。每天收集發(fā)酵液樣品提取DNA和做16S rRNA測(cè)序分析[9]。

取發(fā)酵液樣品15 mL裝于250 mL的錐形瓶中，保鮮膜封口，40 ℃水浴5 min。電子鼻實(shí)驗(yàn)參數(shù)：清洗時(shí)間120 s，測(cè)定時(shí)間75 s，洗滌氣體為標(biāo)準(zhǔn)空氣。由SmartNose軟件每秒采樣10次，測(cè)量結(jié)束后保存各個(gè)傳感器的數(shù)據(jù)。

1.3.2 基于優(yōu)化的模型探究?jī)煞N鈷卟啉對(duì)腸道菌群的調(diào)控作用

1.3.2.1 體外模擬發(fā)酵過(guò)程

搭建3組單相發(fā)酵系統(tǒng)，培養(yǎng)基900 mL接種90 mL的糞便菌。通過(guò)每日電子鼻測(cè)定，判斷發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定期后，將大發(fā)酵罐中900 mL發(fā)酵液均勻分裝到a、b、c 3個(gè)小發(fā)酵罐中，在b和c中分別添加甲鈷胺和氰鈷胺使質(zhì)量濃度達(dá)到1.25 mg/L。a、b、c分別為對(duì)照組(CON)、甲鈷胺組(MECBL)和氰鈷胺組(CNCBL)，進(jìn)行7 d的連續(xù)發(fā)酵。攪拌轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速為120 r/min，溫度37 ℃， pH 6.8，每日早、中、晚對(duì)每個(gè)發(fā)酵罐通5 min N2保持厭氧。每天收集發(fā)酵液樣品，提取DNA和16S rRNA測(cè)序分析[9]。

1.3.2.2 氣質(zhì)聯(lián)用測(cè)定短鏈脂肪酸

取一定量的發(fā)酵液樣品8 000 r/min離心2min，取上清液再經(jīng)0.45 μm的濾膜過(guò)濾。預(yù)處理和色譜條件參照文獻(xiàn)[10]，其中檢測(cè)器為電噴霧離子源,離子源溫度350 ℃。

1.3.2.3 酶活力的測(cè)定

取一定量的樣品搖床120 r/min振搖30 min，4 000 r/min 離心5 min，收集上清液即為酶液[11]。采用DNS比色法測(cè)定纖維素酶活力[12]，采用福林-酚試劑法測(cè)蛋白酶活力，碘-淀粉比色法測(cè)淀粉酶活力[13]。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

將16S rRNA測(cè)序后得到的數(shù)據(jù)，利用SPSS Statistics 20軟件對(duì)16S rDNA測(cè)序結(jié)果所有類群的相對(duì)豐度和多樣性指數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)前處理。將菌屬、菌門(mén)豐度表用SPSS計(jì)算出Z值，并導(dǎo)入MeV4.9.0創(chuàng)建熱圖。用SPSS計(jì)算出菌屬之間的Spearman相關(guān)性，后導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖。將菌屬豐度表和短鏈脂肪酸(short chain fatty acid, SCFA)質(zhì)量濃度表導(dǎo)入Canoco_2249軟件進(jìn)行典型相關(guān)分析并繪圖。利用Origin 8.5將菌屬和菌門(mén)豐度表繪制成柱狀圖。選擇Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)導(dǎo)入Origin 8.5繪制箱線圖表現(xiàn)α-多樣性。利用Galaxy網(wǎng)站在線對(duì)OTU表的基因功能進(jìn)行PICRUSt預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵裝置的優(yōu)化

2.1.1 最優(yōu)靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基

結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)48 h發(fā)酵后，7號(hào)培養(yǎng)基的菌門(mén)結(jié)構(gòu)與糞便原樣最為相近，變形菌門(mén)(Proteobacteria)相對(duì)豐度很大，其他菌門(mén)豐度很小(圖2)。

m1～m8-1號(hào)～8號(hào)培養(yǎng)基的菌門(mén)結(jié)構(gòu)；feces-糞便 原樣的菌門(mén)結(jié)構(gòu)
圖2 菌門(mén)層面熱圖和聚類分析
Fig.2 Heatmap and Hierarchical clustering

在菌屬層面經(jīng)過(guò)熱圖聚類發(fā)現(xiàn)(圖3)，菌屬結(jié)構(gòu)與糞便原樣最為接近的是4號(hào)培養(yǎng)基，兩者的菌群結(jié)構(gòu)中，埃希氏屬(Escherichia)所占的豐度最高，乳桿菌屬(Lactobacillus)次之。7號(hào)和4號(hào)培養(yǎng)基的具體組成成分見(jiàn)方法1.3.1.2。

m1～m8-1號(hào)～8號(hào)培養(yǎng)基的菌屬結(jié)構(gòu)；feces-糞便 原樣的菌屬結(jié)構(gòu)
圖3 菌屬層面熱圖和聚類分析
Fig.3 Heatmap and Hierarchical clustering

此外，根據(jù)在OD600下測(cè)得的吸光度值，細(xì)菌生長(zhǎng)速度最快且沒(méi)有出現(xiàn)衰退的培養(yǎng)基是8號(hào)培養(yǎng)基(圖4)。

圖4 各組在發(fā)酵24 h和48 h的菌群相對(duì)生長(zhǎng)速度
Fig.4 The relative growth rate of bacteria after 24 h and 48 h fermentation in each group

2.1.2 最優(yōu)發(fā)酵氣體環(huán)境

對(duì)5組不同氣體環(huán)境的發(fā)酵樣品的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行熱圖聚類分析(圖5)。C20、C50、C80組都聚為一類， C100和N100聚為一類，但組間代表菌豐度的色塊相差不大?？傮w上，氣體環(huán)境對(duì)模擬系統(tǒng)內(nèi)的菌群影響很小。

C100、C80、C50、C20分別表示CO2體積分?jǐn)?shù)為100%、80%、 50%、20%，剩余體積分?jǐn)?shù)為N2的實(shí)驗(yàn)組，N100表示 100%N2的對(duì)照組
圖5 菌屬層面的熱圖和聚類分析
Fig.5 Heatmap and hierarchical clustering

2.1.3 微生物檢測(cè)方法的優(yōu)化

將電子鼻各個(gè)傳感器數(shù)據(jù)與16S rRNA測(cè)序的菌門(mén)豐度數(shù)據(jù)分別進(jìn)行熱圖聚類分析，再將這2種方法的聚類結(jié)果進(jìn)行比較。由附件1(kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20200317.2015.011.html)可知，2種方法的聚類結(jié)果基本一致。

在電子鼻和菌門(mén)數(shù)據(jù)之間建立矩陣，在所有樣品數(shù)據(jù)中隨機(jī)選擇40組導(dǎo)入，以傳感器1為例，建立回歸模型為y=5.047Firmicutes-0.057Bacteroidetes-0.066Actino-bacteria+0.043Fusobacteria+61.727+0.183Bacteria(R2=0.836)，該回歸模型預(yù)測(cè)率高達(dá)70.0%。由于電子鼻具有準(zhǔn)確的定性與定量能力，且測(cè)定速度快，操作方便經(jīng)濟(jì)，因此將其作為快速判定不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵罐內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)是否相似的標(biāo)志，即發(fā)酵罐是否進(jìn)入穩(wěn)定期的標(biāo)志。

2.2 鈷卟啉對(duì)菌群結(jié)構(gòu)和代謝的影響

2.2.1 菌群結(jié)構(gòu)差異和Alpha多樣性

選取對(duì)照組、氰鈷胺組、甲鈷胺組第4天、第7天的樣品16S rRNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行微生物譜圖分析，16S rRNA測(cè)序結(jié)果為352 403 reads，平均樣本深度為19 577.9 reads，標(biāo)準(zhǔn)差為9 002.1 reads。經(jīng)97%的相似度聚類，共得到了2 422個(gè)OTU。

如圖6所示，在體外模擬結(jié)腸發(fā)酵體系中加入甲鈷胺后，微生物的物種多樣性較其他2組都顯著下降。在物種均勻性方面，甲鈷胺和氰鈷胺Shannon指數(shù)都顯著下降，說(shuō)明結(jié)腸不同種類的微生物均勻性下降。這些結(jié)果表明鈷卟啉對(duì)腸道菌群具有選擇性作用。血紅素含有1個(gè)卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)，具有同樣的效果[14]。

a-3組微生物多樣性指標(biāo)Chao1值;b-3組微生物多樣性 指標(biāo)Shannon值
圖6 對(duì)照組、甲鈷胺組和氰鈷胺組的alpha多樣性指數(shù)
Fig.6 Alpha diversity of CON, MECBL and CNCBL
注：*代表P<0.05，**代表P<0.001，***代表P<0.000 1

當(dāng)持續(xù)7 d分別加入2種鈷卟啉后，不動(dòng)桿菌屬占比都顯著上升，而擬桿菌屬、腸桿菌科某屬、瘤胃球菌科某屬等占比均有顯著下降(圖7)，梭菌屬(ClostridiumXIVa)、大腸埃希氏菌(Escherichia)占比發(fā)生了相對(duì)較小的下降。大腸埃希氏菌的減少可能是因?yàn)樵阝掃策邼舛惹闆r下，其btuB的VB12核糖體開(kāi)關(guān)與VB12的結(jié)合呈關(guān)閉狀態(tài)，從而截?cái)嘞掠位虮磉_(dá)[15]。

由LEfSe分析發(fā)現(xiàn)氰鈷胺提高了梭菌科(Fusobacteriaceae)、瘤胃球菌、Brevundimonas等細(xì)菌的相對(duì)豐度，而甲鈷胺促進(jìn)了Clostridiumsensustricto、Clostridiaceae1、Clostridiale-IncertaeSedisⅪ等細(xì)菌的相對(duì)豐度(附件2， kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20200317.2015.011.html)。梭菌科、瘤胃球菌、Brevundimonas等與炎癥和癌癥相關(guān)，可見(jiàn)補(bǔ)充氰鈷胺存在引發(fā)腸道炎癥的風(fēng)險(xiǎn)，并且會(huì)加重炎癥性腸道疾病(inflammatorybowl disease，IBD)患者的炎癥[16]。甲鈷胺促進(jìn)了產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌的相對(duì)豐度，而丁酸鹽具有包括抗炎、抗腫瘤活性、增強(qiáng)結(jié)腸屏障的作用[17]。此外，許多研究表明，缺少鈷卟啉與IBD有關(guān)[18-20]，因此及時(shí)補(bǔ)充鈷卟啉很有必要。而比起氰鈷胺，甲鈷胺是更好的選擇，能在補(bǔ)充鈷卟啉的同時(shí)減輕腸道炎癥。

a-對(duì)照組；b-甲鈷胺組；c-氰鈷胺組
圖7 發(fā)酵7 d后對(duì)照組、甲鈷胺組和氰鈷胺組的菌屬分布柱狀圖
Fig.7 Bacterial genus histogram after 7 days fermentation of CON, MECBL and CNCBL

2.2.2 短鏈脂肪酸和酶活變化

在甲鈷胺組中，丁酸含量在第1天遠(yuǎn)高于其他2組，隨后下降；丙酸和異戊酸隨時(shí)間增多(圖8)。丙酸可以抑制膽固醇的合成，通過(guò)平衡乙酸與丙酸的比例可以降低心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[21]。因此攝入甲鈷胺有益于脂代謝健康。丁酸在甲鈷胺組發(fā)酵第1天的占比最高，可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵過(guò)程中，Roseburia、Blautia以及Lachnospira的豐度在減少，這幾種菌主要參與丁酸的產(chǎn)生。由此可見(jiàn)，攝入甲鈷胺還有利于人體對(duì)蛋白質(zhì)的吸收利用。

由圖9可知，甲鈷胺組的蛋白酶活力第2天迅速上升隨后又迅速下降(P<0．05)。除此以外，鈷卟啉組和對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異。氰鈷胺組的淀粉酶活性在第2、3、5天顯著高于對(duì)照組，而甲鈷胺組第2、3、4、7天顯著低于對(duì)照組 (P<0．05)。對(duì)照組與鈷卟啉組的羧甲基纖維素酶活性沒(méi)有顯著性差異。其中，甲鈷胺組的蛋白酶活力迅速上升又迅速下降，可能與甲鈷胺組丁酸占比下降有關(guān)。結(jié)合有機(jī)酸結(jié)果，甲鈷胺組異戊酸日益增加，而蛋白質(zhì)發(fā)酵主要產(chǎn)生支鏈脂肪酸[22]，蛋白酶的結(jié)果驗(yàn)證了這一點(diǎn)。

a-對(duì)照組短鏈脂肪酸占比;b-甲鈷胺組短鏈脂肪酸占比; c-氰鈷胺組短鏈脂肪酸占比
圖8 對(duì)照組、甲鈷胺組和氰鈷胺組短鏈脂肪酸的占比
Fig.8 SCFA composition ratio in CON, MECBL and CNCBL

a-蛋白酶活力變化;b-淀粉酶活力變化;c-羧甲基纖維素酶活力變化
圖9 蛋白酶、淀粉酶和羧甲基纖維素酶活力隨發(fā)酵時(shí)間的變化
Fig.9 The change of protease, amylase and cellulose activity with fermentation time

2.2.3 典型關(guān)聯(lián)分析

由圖10可知，甲鈷胺和假單胞菌(Pseudomonas)、丙酸、丁酸皆呈正相關(guān),說(shuō)明加入一定量的甲鈷胺可以提高假單胞菌的相對(duì)豐度，促進(jìn)丙酸和丁酸的產(chǎn)生。不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、腸桿菌屬(Enterobacteriaceae)以及埃希氏桿菌屬(Escheriehia)與異戊酸和異丁酸含量呈正相關(guān)，其原因可能是甲鈷胺和氰鈷胺大大增加了不動(dòng)桿菌屬的豐度，相比之下腸桿菌屬和埃希氏桿菌屬的減少并不重要。甲鈷胺組的異戊酸和異丁酸含量在增加，氰鈷胺組不變，可能還存在其他影響因素。脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)等與乙酸正相關(guān)，甲鈷胺組的發(fā)酵過(guò)程中乙酸含量日益減少，這表明甲鈷胺族脫硫弧菌屬的豐度可能在減少。

圖10 三組菌群典型關(guān)聯(lián)分析
Fig.10 Canonical correspondence analysis of microbiota in three groups

2.2.4 腸道菌群功能分析

通過(guò)PICRUSt預(yù)測(cè)得到24個(gè)二級(jí)代謝通路，262個(gè)三級(jí)代謝通路。由圖11可知，大多數(shù)二級(jí)代謝沒(méi)有受到鈷卟啉的影響。鈷卟啉能促進(jìn)腸道菌的脂質(zhì)代謝、萜類化合物和聚酮類的代謝、外源性物質(zhì)降解代謝，抑制轉(zhuǎn)錄和其他次生代謝產(chǎn)物的合成。選取三級(jí)代謝中鈷卟啉組與對(duì)照組有顯著性差異的前10個(gè)代謝途徑作圖，如圖12所示。

圖11 菌群主要二級(jí)代謝通路的比較
Fig.11 Comparisons of the predominant secondary metabolism pathways of the microbiota

圖12 菌群主要三級(jí)代謝通路的比較
Fig.12 Comparisons of the predominant third-level metabolism pathways of the microbiota

在三級(jí)代謝層面，與對(duì)照組相比，在卟啉組中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ko02010)通路、DNA修復(fù)和重組蛋白(ko03400)通路、氮代謝 (ko00910)、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(ko02060)表達(dá)量均顯著下降，氰鈷胺組比甲鈷胺組的代謝通路表達(dá)量更低。

3 結(jié)論

本研究首先對(duì)體外腸道模擬體系進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得到與糞便菌群菌門(mén)、菌屬相似度最高的培養(yǎng)基以及菌生長(zhǎng)最快的培養(yǎng)基。氣體環(huán)境對(duì)模擬系統(tǒng)內(nèi)菌群的影響較小。針對(duì)目前微生物檢測(cè)方式耗時(shí)長(zhǎng)的局限性，本研究提出可利用電子鼻快速評(píng)估腸道菌落的方法。該方法具有較好的定性能力，定量檢測(cè)準(zhǔn)確度為70%，可用于判定菌群結(jié)構(gòu)是否進(jìn)入穩(wěn)定期。

本研究考察了不同鈷卟啉對(duì)腸道菌群的調(diào)控作用。結(jié)果表明，甲鈷胺和氰鈷胺都降低了腸道菌群α-多樣性。在菌屬的相對(duì)豐度層面，加入2種鈷卟啉后不動(dòng)桿菌屬占比都顯著上升，而擬桿菌屬、腸桿菌科某屬、瘤胃球菌、大腸埃希氏菌都下降。氰鈷胺提高了梭菌科(Fusobacteriaceae)、瘤胃球菌、Brevundimonas等與炎癥和癌癥相關(guān)細(xì)菌的相對(duì)豐度；而甲鈷胺促進(jìn)了Clostridiumsensustricto、Clostridiaceae1、Clostridiale-IncertaeSedisⅪ等產(chǎn)丁酸細(xì)菌鹽的相對(duì)豐度，從而具有抗炎、抗腫瘤、增強(qiáng)結(jié)腸屏障等作用。在消化酶方面，氰鈷胺促進(jìn)淀粉消化，甲鈷胺抑制淀粉消化，2種鈷卟啉對(duì)蛋白質(zhì)、纖維素的消化無(wú)顯著影響。通過(guò)對(duì)代謝通路的預(yù)測(cè)，2種鈷卟啉都促進(jìn)脂質(zhì)代謝、萜類和聚酮類代謝、外源性物質(zhì)降解，同時(shí)抑制轉(zhuǎn)錄因子等次生代謝產(chǎn)物的合成、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、DNA修復(fù)和重組蛋白代謝、氮代謝以及磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)代謝，且氰鈷胺組抑制作用比甲鈷胺組更強(qiáng)。鑒于本課題的研究結(jié)果，建議在將鈷卟啉作為膳食補(bǔ)充劑時(shí)，將甲鈷胺代替常用的氰鈷胺作為首選，這有利于人體腸道菌群產(chǎn)生更有益的代謝產(chǎn)物，使宿主更健康。