藏磊,馬紀(jì)兵,韓玲,余群力*,宋仁德,石紅梅,孔祥穎

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)2(青海省玉樹(shù)州畜牧獸醫(yī)工作站，青海 玉樹(shù)，815000) 3(甘肅省甘南州畜牧獸醫(yī)工作站，甘肅 甘南，747000)4(青海省海北州畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，青海 海北，812200)

動(dòng)物宰后，血液所攜帶的氧氣供應(yīng)停止，氧化還原電位下降，細(xì)胞色素系統(tǒng)無(wú)法運(yùn)轉(zhuǎn)[1]，機(jī)體喪失了通過(guò)電子傳遞鏈產(chǎn)生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的能力。糖酵解成為唯一的能量代謝途徑。這一過(guò)程與活體肌肉暫時(shí)性缺氧條件下發(fā)生的反應(yīng)相似，但宰后這種變化一直延續(xù)到肌糖原耗盡或參與糖酵解的酶系失活。糖酵解過(guò)程產(chǎn)生的乳酸不會(huì)像活體動(dòng)物那樣被轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟中再合成肝糖原或通過(guò)血液循環(huán)被排除，而是在肌肉細(xì)胞內(nèi)蓄積起來(lái)，導(dǎo)致肌肉pH值下降[2]。而pH值的變化速度與幅度會(huì)影響肌肉的色澤、嫩度、系水力、蒸煮損失等肉品質(zhì)指標(biāo)[3-4]。

腺苷一磷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)是一種重要的 “能量調(diào)節(jié)器”，由一個(gè)催化亞基(α)和2個(gè)調(diào)節(jié)亞基(β和γ亞基)組成的異源三聚體，屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它廣泛存在于真核細(xì)胞生物中[5]?；罨腁MPK通過(guò)關(guān)閉合成代謝途徑以減少能量消耗，同時(shí)開(kāi)啟分解代謝途徑增加能量產(chǎn)生以維持ATP水平[6-7]。AMPK活性調(diào)控信號(hào)通路如圖1所示，其中一種激活途徑是通過(guò)其上游的蛋白激酶發(fā)生磷酸化，進(jìn)而直接啟動(dòng)AMPK α 亞單位的蘇氨酸172位，激活細(xì)胞中AMPK活性[8]。目前發(fā)現(xiàn)2種AMPK上游激酶，即鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶激酶β(calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase Beta，CaMKKβ)和肝臟激酶B1(liver kinase B1，LKB1)[9-10]。CaMKKβ對(duì)蘇氨酸(Thr)172位的磷酸化不依賴于AMP濃度的升高，而是通過(guò)增高Ca2+濃度從而激活A(yù)MPK，其調(diào)節(jié)是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高而啟動(dòng)[11-12]。低水平的胞內(nèi)活性氧(reative oxygen species，ROS)現(xiàn)在被認(rèn)為是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和正常生理功能的關(guān)鍵信號(hào)[13]，有研究報(bào)道，活性氧升高后可通過(guò)激活鈣釋放激活鈣通道 (Ca2+release-activated Ca2+channel, CRAC)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+離子增多并活化CaMKKβ[14]。

然而牦牛肉宰后成熟過(guò)程中，活性氧對(duì)CaMKKβ-AMPK信號(hào)通路，糖酵解以及肉品質(zhì)影響的研究報(bào)道較少。因此，本文通過(guò)H2O2、活性氧清除劑N-乙?；?L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)以及H2O2+ Compound C(AMPK抑制劑)處理牦牛肉作為研究對(duì)象，測(cè)定牦牛肉成熟過(guò)程中AMPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)、糖酵解關(guān)鍵酶活力、糖酵解產(chǎn)物等指標(biāo)，初步探索活性氧對(duì)牦牛肉宰后成熟過(guò)程中AMPK的激活作用以及對(duì)宰后肌肉糖酵解及肉品質(zhì)的影響。

圖1 AMPK活性調(diào)控信號(hào)通路
Fig.1 The signaling pathway of AMPK activity regulation

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

在甘肅甘南牧區(qū)，隨機(jī)選取健康無(wú)病，生長(zhǎng)發(fā)育正常，平均年齡3～4歲，體質(zhì)量(350 ± 20) kg的牦牛6頭，公母各3頭，宰前禁食16～18 h，禁水2 h。屠宰后立即取牦牛胴體中部背最長(zhǎng)肌肉樣，置于4 ℃條件下成熟。

牛磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒、牛鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶激酶β酶聯(lián)免疫分析試劑盒，上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；丙酮酸激酶測(cè)定試劑盒、肌/肝糖原測(cè)定試劑盒、乳酸測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所。Compound C(AMPK抑制劑)、D-甘露糖醇(D-mannitol)、Tris-base、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸[ethylenebis(oxyethylenenitri)tetraacetic acid]，美國(guó)Amresco公司；乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA),二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT), 2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)，美國(guó)Sigma公司；H2O2、NAC、NaCl、濃H2SO4，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004B 型電子天平，上海佑科儀器有限公司；TGL-16M 型離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；TU-1810 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LRH-250型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；XHF-DY型高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司；HI99163型便攜式pH計(jì)，意大利哈納儀器公司；C-LM4 型數(shù)顯式肌肉嫩度儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司；RF 5301-PC熒光分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集與處理

屠宰后立即取胴體中部背最長(zhǎng)肌，剔除脂肪、筋腱及結(jié)締組織后，分割為每塊50 g的肉樣，隨機(jī)分為4組，第1組注射5 mmol/L H2O2溶液作為產(chǎn)生活性氧組，第2組注射20 mmol/L NAC溶液作為清除活性氧組，第3組注射0.9% NaCl溶液作為對(duì)照組，第4組注射5 mmol/L H2O2+ 40 μmol/L Compound C溶液作為抑制AMPK活性組，每組注射量均為肉質(zhì)量的10%，采用真空包裝，在4 ℃條件下進(jìn)行宰后成熟。對(duì)于0 h的肉樣立即用錫箔紙包裹后，放入液氮中冷凍待測(cè)。其余肉樣在成熟時(shí)間點(diǎn)6、12、24、48、72、120 h分別進(jìn)行取樣，并測(cè)定AMPK活力等指標(biāo)，對(duì)于不便立即測(cè)定的指標(biāo)，用錫箔紙包裹，液氮迅速冷凍后置于-80 ℃凍藏待測(cè)。

1.3.2 ROS水平的測(cè)定

參照張玉林[15]和王琳琳[16]的方法并略作修改，將0.5 g肌肉組織放入4.5 mL的Tri-HCl緩沖液(10 mmol/L Tri-HCl，8 g/L NaCl，0.1 mmol/L EDTA-2Na，10 mmol/L 蔗糖，pH 7.4)中剪碎，冰浴勻漿1 min， 3 000×g冷凍離心15 min收集上清，并測(cè)定上清蛋白濃度。將上清液與反應(yīng)緩沖液(10 mmol/L Tri-HCl，8 g/L NaCl，0.1 mmol/L EDTA-2Na，10 mmol/L 蔗糖，10 μmol/L DCFH-DA，pH 7.4)混合，快速放入水浴鍋37 ℃孵育15 min(注意避光操作)，最后用熒光分光光度計(jì)立即測(cè)定熒光強(qiáng)度值(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm)。

1.3.3 胞漿中Ca2+水平的測(cè)定

參考辛國(guó)榮等[17]的方法并略作修改，取組織塊于10 mL燒杯中，加入預(yù)冷的勻漿介質(zhì)[pH 7.4, 0.1 mol/L Tris-HCl，1 mmol/L KCl，1 mmol/L EDTA-2Na，0.25 mol/L(蔗糖去離子水配制)],固液比為1∶9(g∶mL),使用高速分散器冰浴、10 000 r/min的條件下制成100 g/L的組織勻漿。

取100 g/L的組織勻漿，在4 ℃、2 000 r/min條件下離心10 min，棄沉淀，取上清液以4 ℃、18 000 r/min離心15 min，沉淀物為線粒體，分離線粒體后的上清液即為胞漿。

采用火焰原子吸收法，取1.5 mL待測(cè)液于加蓋試管中加入濃HNO35 mL，置于陰暗處硝化1周，然后用烘箱加熱使HNO3盡量分解蒸發(fā)，留存即為樣品。加入10 g/L的氯化鑭至10 mL，混勻待測(cè)。

1.3.4 AMPK、CaMKKβ活力的測(cè)定

參照楊雅媛等[18]的方法并作修改，取冷凍的組織肉樣約0.5 g剁碎置于離心管中，加入預(yù)冷的勻漿液(pH 7.4，0.05 mol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L DTT，50 mmol/L NaF，5 mmol/L焦磷酸鈉，0.25 mol/LD-mannitol)冰浴勻漿(每15 s勻漿1次，間隙20 s，重復(fù)3次)。然后在4 ℃、10 000 r/min的條件下冷凍離心5 min，取上清液用于AMPK、CaMKKβ活力的測(cè)定。測(cè)定方法以及標(biāo)準(zhǔn)曲線制作參照酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行。

1.3.5 糖酵解指標(biāo)的測(cè)定

肌糖原、乳酸、丙酮酸激酶等指標(biāo)通過(guò)南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行測(cè)定，具體操作步驟和結(jié)果計(jì)算參照各試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.6 pH值的測(cè)定

將便攜式pH計(jì)的探針插入肉樣中，使pH計(jì)的電極與肌肉組織充分接觸，讀數(shù)穩(wěn)定后記錄，每個(gè)肉樣重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

1.3.7 肉品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定

蒸煮損失：參考馬秀麗等[19]的方法，將長(zhǎng)×寬×高不少于 6 cm × 3 cm × 3 cm 的肉樣，修整去除肉塊表面的脂肪和結(jié)締組織，稱重記為Ma，80 ℃恒溫水浴加熱，用數(shù)顯溫度計(jì)記錄加熱過(guò)程中肉塊的中心溫度。當(dāng)中心溫度達(dá)到75 ℃時(shí)，恒溫保持5 min后取出冷卻至室溫，再次稱重記為Mb，蒸煮損失計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

剪切力：將測(cè)定完蒸煮損失的肉樣沿肌纖維方向取3個(gè)直徑為1.27 cm肉柱，用C-LM4 型數(shù)顯式肌肉嫩度儀垂直肌纖維方向剪切肉柱，每組重復(fù)3次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)平行測(cè)定3次，所有數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(多重比較分析采用 Duncan 法，P<0.05)，使用Excel 2016軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ROS對(duì)宰后牦牛肉CaMKKβ-AMPK通路的影響

ROS和Ca2+是公認(rèn)的細(xì)胞重要信使。如圖2所示，宰后H2O2組活性氧水平呈上升趨勢(shì)，對(duì)照組與NAC組ROS水平呈先下降后上升趨勢(shì)，對(duì)照組在12 h達(dá)到最小值，NAC組在24 h到達(dá)最小值；H2O2組活性氧水平在宰后0～12 h顯著高于其他2組，NAC組顯著低于其他2組(P<0.05)。說(shuō)明H2O2處理提高了宰后肉ROS水平，NAC能夠抑制ROS的產(chǎn)生。3組Ca2+濃度均逐漸升高， H2O2組顯著(P<0.05)高于NAC組，這說(shuō)明清除活性氧能夠降低胞漿中Ca2+濃度。王琳琳[16]研究的Ca2+介導(dǎo)宰后牦牛肉線粒體凋亡途徑激活機(jī)制中也指出，宰后成熟過(guò)程中，確實(shí)存在Ca2+超載現(xiàn)象。在12 h時(shí)，H2O2組Ca2+濃度顯著(P<0.05)高于對(duì)照組14.61%，對(duì)照組顯著(P<0.05)高于NAC組11.81%，隨后均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。綜上所述，H2O2處理能夠激活鈣釋放激活鈣通道致使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+大量釋放至胞漿中。

a-ROS水平；b-Ca2+質(zhì)量濃度
圖2 宰后背最長(zhǎng)肌成熟過(guò)程中ROS水平 及胞漿Ca2+質(zhì)量濃度的變化
Fig.2 Changes of ROS levels and Ca2+concentrations in cytoplasm oflongissimusdorsimuscle during postmortem aging
注：小寫(xiě)字母不同表示同一時(shí)間點(diǎn)不同處理方式間差異顯著 (P<0.05)，小寫(xiě)字母相同表示同一時(shí)間點(diǎn)不同處理方式間 差異不顯著(P>0.05)；不同時(shí)間點(diǎn)間差異顯著性未標(biāo)出(下同)

CaMKKβ作為唯一不依賴于AMP濃度的升高而激活A(yù)MPK的蛋白激酶，在AMPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的地位舉足輕重。如圖3所示，在宰后牦牛肉成熟過(guò)程中CaMKKβ活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在6 h達(dá)到最大值，且3組間差異顯著(P<0.05)，其中，H2O2組為122.43 IU/L，對(duì)照組為112.15 IU/L，NAC組為84.39 IU/L。這可能是由于胞漿中Ca2+濃度的升高，從而起到了激活CaMKKβ的作用。廖海含[20]的研究也發(fā)現(xiàn)前體脂肪細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+激活CaMKKβ-AMPK信號(hào)通路以維持前體脂肪細(xì)胞因子-1。在成熟6～24 h，3組牦牛肉樣CaMKKβ活力均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這可能是由于肉成熟過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)環(huán)境變化導(dǎo)致酶空間結(jié)構(gòu)破壞從而酶活力快速下降。綜上，H2O2顯著提高CaMKKβ酶活力，可能對(duì)宰后牦牛肉AMPK活性及糖酵解產(chǎn)生影響。

圖3 宰后背最長(zhǎng)肌成熟過(guò)程中CaMKKβ活力的變化
Fig.3 Changes of CaMKKβ activity oflongissimusdorsimuscle during postmortem aging

AMPK是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)高度保守的蛋白激酶下游組件，作為細(xì)胞內(nèi)能量穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵感受器和調(diào)節(jié)器[21-22]，與能量代謝有著密切關(guān)聯(lián)。宰后牦牛肉成熟過(guò)程中AMPK活力變化如圖4所示，成熟0～120 h，3組牦牛肉樣AMPK活力整體呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，H2O2組與對(duì)照組有所升高，且在12 h時(shí)達(dá)到最大值，其中，NAC組顯著(P<0.05)低于對(duì)照組13.02%，顯著(P<0.05)低于H2O2組16.73%。在12～48 h，處理組與對(duì)照組間均顯著(P<0.05)高于NAC組。這說(shuō)明宰后牦牛肉成熟過(guò)程中ROS誘導(dǎo)CaMKKβ的激活，對(duì)其下游激酶AMPK具有活化作用。廖海含[20]研究CaMKKβ在心肌纖維化的作用時(shí)也指出在小鼠心肌組織中，CaMKKβ缺失后AMPK磷酸化水平顯著降低。H2O2組與對(duì)照組牦牛肉在12 h均達(dá)到成熟期間最大值，這與楊雅媛等[18]的研究結(jié)果相類似。SCHEFFLER等[23]的研究也表明，骨骼肌中AMPK被激活來(lái)維持細(xì)胞能量的供應(yīng)。綜上，宰后牦牛肉成熟過(guò)程中在活性氧誘導(dǎo)下，上游激酶CaMKKβ通過(guò)Ca2+的活化，從而激活下游蛋白激酶AMPK。

圖4 宰后背最長(zhǎng)肌成熟過(guò)程中AMPK活力的變化
Fig.4 Changes of AMPK activity oflongissimusdorsimuscle during postmortem aging

2.2 ROS對(duì)宰后牦牛肉糖酵解的影響

糖酵解是葡萄糖被分解生成丙酮酸的過(guò)程，在缺氧的條件下丙酮酸進(jìn)一步被還原為乳酸。丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)是該過(guò)程的限速酶之一，宰后牦牛肉成熟過(guò)程中變化如圖5所示。隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，4組牦牛肉樣PK活力表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，在成熟12～48 h，H2O2處理組PK活力顯著(P<0.05)高于其他3組，加入抑制劑Compound C組則顯著(P<0.05)低于其他3組。這說(shuō)明AMPK能夠?qū)K起到激活作用，加入AMPK抑制劑組能夠明顯抑制PK活力。張一敏等[24]在研究不同部位肉中AMPK差異表達(dá)時(shí)也發(fā)現(xiàn)，AMPK能夠通過(guò)磷酸化激活PK。DING等[25]在研究牦牛對(duì)海拔高度適應(yīng)性時(shí)指出糖酵解酶活力與高海拔呈正比，這可能與低氧適應(yīng)下牦牛肉中AMPK活力更強(qiáng)[18， 26]有關(guān)。

圖5 宰后背最長(zhǎng)肌成熟過(guò)程中丙酮酸激酶活性的變化
Fig.5 Changes of PK activity oflongissimusdorsimuscle during postmortem aging

圖6 宰后背最長(zhǎng)肌成熟過(guò)程中肌糖原的變化
Fig.6 Changes of muscle glycogen oflongissimusdorsimuscle during postmortem aging

肌糖原作為肌肉中重要的儲(chǔ)能物質(zhì)，在宰后牦牛肉成熟過(guò)程中，變化規(guī)律如圖6所示，隨著成熟地進(jìn)行，肌糖原含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，在成熟24～48 h，H2O2組顯著(P<0.05)低于NAC組18.89%，34.46%；而清除了活性氧的NAC組和抑制AMPK活性的Compound C組則顯著(P<0.05)高于對(duì)照組與H2O2組。這表明在宰后活化的AMPK可以通過(guò)加速肌糖原的分解來(lái)影響糖酵解，活性氧誘導(dǎo)的CaMKKβ-AMPK通路在這一過(guò)程中起到了重要作用。與此相似的是，李澤[27]在研究AMPK對(duì)羊肉能量代謝和肉質(zhì)的影響及其機(jī)理時(shí)也指出,羊肉AMPK活力高的部位肌糖原代謝速率更快。

乳酸是無(wú)氧糖酵解的最終產(chǎn)物，其含量會(huì)直接影響到宰后肉的pH變化[28]，繼而對(duì)系水力、嫩度等品質(zhì)產(chǎn)生影響。如圖7所示，宰后0～72 h，4組牦牛肉樣均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，且在72 h達(dá)到最大值，但4組間差異不顯著(P>0.05)。在6～48 h，H2O2組乳酸含量顯著(P<0.05)高于AMPK抑制劑組。這說(shuō)明成熟期間AMPK活力的升高，能夠提高宰后牦牛肉糖酵解能力。楊雅媛等[18]的研究認(rèn)為，當(dāng)糖酵解底物充足時(shí)，糖原的分解不是影響乳酸含量進(jìn)而改變?nèi)赓|(zhì)的關(guān)鍵因素，從而解釋了不同肉品質(zhì)差異。

圖7 宰后背最長(zhǎng)肌成熟過(guò)程中乳酸的變化
Fig.7 Changes of lactic acid oflongissimusdorsimuscle during postmortem aging

pH值是乳酸含量的直觀反映，乳酸含量越高，pH值越低，如圖8所示，宰后成熟期間，牦牛肉4組肉樣pH值均表現(xiàn)出先降低后有所緩慢升高的現(xiàn)象，H2O2組與其他3組相比，在6～12 h下降更快且在第12 h顯著(P<0.05)低于其他3組；在成熟6～48 h AMPK抑制劑組pH值高于其他3組但差異不顯著(P>0.05)。

圖8 宰后背最長(zhǎng)肌成熟過(guò)程中pH值的變化
Fig.8 Changes of pH oflongissimusdorsimuscle during postmortem aging

2.3 ROS對(duì)宰后牦牛肉品質(zhì)的影響

剪切力能夠直接反應(yīng)肉的嫩度，剪切力越大，肌肉嫩度越小。如圖9所示，4組肉樣均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，H2O2組在第24 h達(dá)到最大值8.54 kgf隨后顯著(P<0.05)降低，而其他3組則在第72 h達(dá)到最大值。這表明活性氧加快了肌肉的成熟時(shí)間，顯著提高了肉的嫩度。張玉林[15]在研究ROS對(duì)宰后鵝肉品質(zhì)的影響時(shí)也指出活性氧能夠改善肉的嫩度。張小濤[29]、WANG等[30]認(rèn)為ROS通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)降解肌原纖維蛋白從而改善肌肉嫩度，而細(xì)胞凋亡途徑中的Bcl-2蛋白家族是通過(guò)AMPK磷酸化激活的[22]。在48～120 h, AMPK抑制劑組剪切力顯著(P<0.05)高于對(duì)照組，這表明AMPK活力高肉的剪切力越小。高永芳等[31]指出通過(guò)AMPK激活劑AICAR處理，顯著改善了宰后牛肉的嫩度。

圖9 宰后背最長(zhǎng)肌成熟過(guò)程中剪切力的變化
Fig.9 Changes of shear force oflongissimusdorsimuscle during postmortem aging

保水性與肉的嫩度，風(fēng)味，營(yíng)養(yǎng)等品質(zhì)有著直接關(guān)系，其中蒸煮損失是衡量保水性的主要指標(biāo)。宰后牦牛肉成熟過(guò)程中蒸煮損失的變化如圖10所示，4組肉樣均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在第48 h達(dá)到最大值。其中清除活性氧的NAC組顯著(P<0.05)低于其他3組，保水性最好。這與張玉林研究鵝肉品質(zhì)的結(jié)果相一致，認(rèn)為ROS能夠通過(guò)改變肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)影響保水性[15]。在成熟6～24 h，AMPK抑制劑組則低于H2O2組，這可能是因?yàn)锳MPK活性被抑制，糖酵解過(guò)程產(chǎn)生的乳酸含量低于H2O2組，pH值遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，保水性好。張一敏等[24]的研究也指出，AMPK能夠通過(guò)調(diào)節(jié)糖酵解進(jìn)程而影響牛肉的保水性等品質(zhì)。

圖10 宰后背最長(zhǎng)肌成熟過(guò)程中蒸煮損失的變化
Fig.10 Changes of cooking loss oflongissimusdorsimuscle during postmortem aging

3 結(jié)論

在宰后牦牛肉成熟過(guò)程中，通過(guò)H2O2處理，產(chǎn)生ROS誘導(dǎo)鈣泵中Ca2+釋放，導(dǎo)致胞漿中Ca2+濃度升高，從而激活了CaMKKβ-AMPK通路，致使活化的AMPK磷酸化糖酵解過(guò)程中的關(guān)鍵酶，如丙酮酸激酶，繼而加速肌糖原降解，乳酸積累及pH值下降，促進(jìn)宰后肌肉糖酵解代謝，同時(shí)，ROS能夠通過(guò)AMPK途徑提高肉的嫩度，清除活性氧能夠顯著(P<0.05)提高肉的保水性。AMPK活力高能夠加速糖酵解過(guò)程致使肉的保水性下降。因此，宰后肉成熟過(guò)程中能夠通過(guò)調(diào)控AMPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)及糖酵解過(guò)程來(lái)改善肉的品質(zhì)。