朱娟娟,馬海軍*,李敏,杜夢(mèng),田婷婷
1(北方民族大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院,寧夏 銀川,750021)2(寧夏葡萄與葡萄酒技術(shù)創(chuàng)新中心,寧夏 銀川,750021)
近年來,隨著我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)水平持續(xù)快速增長(zhǎng)、居民消費(fèi)水平不斷提升和消費(fèi)者飲酒習(xí)慣逐漸改變,我國(guó)釀酒工業(yè)呈現(xiàn)了快速發(fā)展趨勢(shì),特別是葡萄酒消費(fèi)逐年增長(zhǎng),已成為我國(guó)工業(yè)經(jīng)濟(jì)中增長(zhǎng)較快且具活力的產(chǎn)業(yè)之一。當(dāng)前消費(fèi)者對(duì)葡萄酒質(zhì)量的要求也逐漸增高,既要求其具有獨(dú)特的風(fēng)味又要求其具有高的保健功能。
硒是谷胱甘肽過氧化物酶、谷氧還蛋白還原酶、硫氧還蛋白還原酶及其他一些脫碘酶等含硒酶蛋白的必需組分,還能形成多種硒代謝產(chǎn)物參與代謝活動(dòng)[1],對(duì)維持人體正常代謝,特別是對(duì)機(jī)體自身免疫功能、局部物質(zhì)能量代謝以及重要內(nèi)分泌器官功能具有重要作用,缺硒不僅容易導(dǎo)致正常發(fā)育障礙,還會(huì)促使多種疾病發(fā)生[2]。無機(jī)硒不能被人體直接吸收利用且易引起中毒,而植物能夠?qū)⑵滢D(zhuǎn)化成有機(jī)硒,通過食物鏈被人體吸收利用[3-4],則富硒食品的研發(fā)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。大量研究證實(shí),葉面噴施硒后樹體葉片吸收的硒可直接向果實(shí)中轉(zhuǎn)運(yùn),從而提高釀酒葡萄硒含量,且具有用量低、利用率高等優(yōu)點(diǎn)[5],因此,通過添加外源硒提升釀酒葡萄硒含量成為釀制富硒葡萄酒的途徑之一。
隨著富硒食品的研發(fā),研究者們發(fā)現(xiàn)適量硒除了提高植物組織含硒量外,還可以增加葉綠素含量、促進(jìn)光合作用、提高可溶性蛋白質(zhì)含量、清除自由基、增強(qiáng)免疫機(jī)能、抵抗真菌病害的入侵以及拮抗環(huán)境毒害等作用,并對(duì)氮、硫及氨基酸代謝產(chǎn)生影響[6]。葉面噴施富硒肥可使奧迪亞無核葡萄平均單株產(chǎn)量增加4.45%[7],提高鮮食葡萄和釀酒葡萄果實(shí)單粒重、橫徑、縱徑、可溶性糖和VC含量[5,8-9];降低甜柿葉片和果實(shí)中的鎘、鉛、汞含量,增加果實(shí)可溶性糖、VC和可溶性固形物含量,降低果實(shí)可滴定酸含量[10]。釀酒葡萄富含酚類物質(zhì),它們是葡萄中重要的次生代謝產(chǎn)物,也是葡萄酒中最重要的風(fēng)味物質(zhì)之一,不僅賦予葡萄酒各種顏色而且使葡萄酒具有各種復(fù)雜的口感和味感特征;然而,葡萄中酚類物質(zhì)含量受氣候條件、土壤狀況、栽培措施以及品種等多因素影響[11]。有關(guān)硒對(duì)葡萄生長(zhǎng)發(fā)育、抗氧化酶活性、硒的累積和分配以及果實(shí)糖酸含量影響的報(bào)道屢見不鮮,但對(duì)釀酒葡萄果實(shí)酚類物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)元素以及抗氧化特性的研究甚少。因此,本研究通過大田葉面噴施不同濃度亞硒酸鈉,監(jiān)測(cè)發(fā)育期果實(shí)總糖、還原糖、可溶性固形物、可滴定酸、pH值、總酚、總黃烷醇和花色苷含量以及礦質(zhì)元素含量,并測(cè)定果實(shí)DPPH自由基清除活性、ABTS自由基陽離子清除活性和總還原力,運(yùn)用灰色系統(tǒng)關(guān)聯(lián)度,綜合評(píng)價(jià)不同濃度硒對(duì)釀酒葡萄品質(zhì)的影響,旨在為生產(chǎn)優(yōu)良葡萄酒原料提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。
沒食子酸、葡萄糖、抗壞血酸、三氯乙酸、鐵氰化鉀、甲醇、濃HNO3、濃H2SO4、1,1-二苯基-2-三硝基苯(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2′-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid,ABTS)]、福林試劑、兒茶酚、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)、H2O2均為分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠;高純氬氣(純度 ≥99.99%),上海恒箐特種氣體有限公司。
UV-2100紫外可見分光光度計(jì),上海尤尼柯上海尤尼柯儀器有限公司;AUW 220D電子天平,日本島津公司;PHS-3C型酸度計(jì),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;PAL-1型手持折射儀,上海鑫際儀器有限公司;Millipore純水儀,Millipore 公司;15-ESICP全譜直讀電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀,美國(guó)VARIAN公司;MDS-6型微波快速制樣系統(tǒng),上海新儀微波化學(xué)科技公司;ECH-1型電子控溫加熱板,上海新儀微波化學(xué)科技公司。
試驗(yàn)于2017年在寧夏園林場(chǎng)葡萄試驗(yàn)基地(北緯37°43′~39°23′,東經(jīng)105°45′~106°47′)進(jìn)行,該地區(qū)屬于中溫帶大陸性氣候,年均降水量193.4 mm,年均氣溫9.4 ℃,年均日照時(shí)數(shù)3 000 h,無霜期185 d。供試品種為歐亞種釀酒葡萄(VitisviniferalL.)赤霞珠(Cabernet sauvignon),2006年定值,東西行向,行距3.0 m,株距0.5 m,葡萄架勢(shì)為單臂籬架,沿葡萄行每隔8 m豎立水泥支柱,其上拉3道鐵絲,葡萄架高約1.5 m。
分別在葡萄的幼果期(7月8日)和著色前期(7月28日)進(jìn)行葉面噴施一定濃度的亞硒酸鈉(Na2SeO3),根據(jù)葡萄植株對(duì)硒的需求量和安全范圍,將噴施的質(zhì)量濃度設(shè)定為5個(gè)水平,分別為0 mg/L(Se0)、10 mg/L(Se10)、25 mg/L(Se25)、50 mg/L(Se50)和75 mg/L(Se75)。試驗(yàn)葡萄分區(qū)處理,每區(qū)有16株葡萄樹,每個(gè)處理完全隨機(jī)排列,重復(fù)3次。試驗(yàn)期間葡萄的施肥、除蟲除草、修剪、施肥追肥等均按正常情況進(jìn)行。7月28日噴施后每隔8~10 d采集1次果實(shí)樣品,直至成熟。樣品立即進(jìn)行液氮速凍,隨后將果粒置于采樣袋中放置在-80 ℃冰箱冷凍儲(chǔ)藏,以備測(cè)定。
1.4.1 葡萄果實(shí)基本理化指標(biāo)
葡萄果實(shí)可溶性固形物用手持糖量計(jì)檢測(cè),以°Brix表示;總糖和還原糖(以葡萄糖計(jì))采用斐林試劑直接滴定法;可滴定酸(以酒石酸計(jì))采用指示劑法;pH值采用酸度計(jì)法測(cè)定。每個(gè)葡萄樣品重復(fù)檢測(cè)3次,最后取平均值。
1.4.2 葡萄果實(shí)酚類物質(zhì)
總酚采用福林-肖卡法,參考ARNOUS等[12]方法,以沒食子酸表示,其回歸方程為y=0.001 1x+0.005 9,R2=0.999 7;總黃烷醇采用二甲氨基肉桂醛法,參考張娟等[11]方法,以兒茶素表示,其回歸方程為y=0.004 5x+0.028 8,R2=0.993 9;花色苷采用pH示差法,參考張娟等[11]方法,以花青素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside,CGE)表示。
1.4.3 葡萄果實(shí)礦質(zhì)元素分析
將采集的樣品洗凈塵沙,經(jīng)冷凍干燥至恒重粉碎后,果實(shí)硝態(tài)氮采用雙波長(zhǎng)紫外分光光度計(jì)法測(cè)定;銨態(tài)氮采用2 mol/L KCl 浸提-靛酚藍(lán)比色法測(cè)定;Se、P、K、S、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn含量采用微波消解-電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀測(cè)定。
1.4.4 葡萄果實(shí)抗氧化特性
DPPH自由基清除能力采用1,1-二苯基-2-三硝基苯法,以Trolox當(dāng)量抗氧化能力表示,其回歸方程為y=3.45x-29.6,R2=0.993 9;ABTS自由基清除能力采用2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽方法,以Trolox當(dāng)量抗氧化能力表示,其回歸方程為y=4.28x-143.9,R2=0.994 6;總還原力采用鐵氰化鉀還原法,以AAE當(dāng)量抗氧化能力表示,其回歸方程為y=7.28x+0.03,R2=0.995 7。
本試驗(yàn)采用SAS 12.1統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析,不同處理間差異比較采用最小顯著差別(least significant difference,LSD)法進(jìn)行多重比較,利用Microsoft Excel 2013軟件作圖。采用灰色系統(tǒng)關(guān)聯(lián)度理論,選取不同處理間具有差異顯著性的理化指標(biāo)進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析,綜合評(píng)價(jià)硒對(duì)赤霞珠釀酒葡萄果實(shí)質(zhì)量的影響。
由圖1可知,葉面噴施硒元素能夠提高葡萄漿果中硒含量,并隨著噴硒濃度的增加而增加,其中Se75處理組漿果硒含量最高,達(dá)到89.1 μg/kg,極顯著(P<0.01)高于其他處理,Se25和Se50極顯著高于(P<0.01)Se10和Se0,但Se25與Se50、Se10與Se0間無顯著性差異。與對(duì)照(Se0)相比,Se10、Se25、Se50和Se75處理組漿果硒含量增加72.9%、350.5%、387.9%和734.9%。
圖1 不同硒濃度對(duì)釀酒葡萄果實(shí)硒含量的影響
Fig.1 Influence of selenium on selenium content of grape berry
注:圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)
葡萄酒釀造過程中,原料漿果中營(yíng)養(yǎng)元素供釀酒酵母和乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖,且葡萄酒中的礦質(zhì)元素組成、含量與葡萄原料密切相關(guān)。由表1可知,葉面噴施硒對(duì)釀酒葡萄果實(shí) K、Zn、Fe、Ca、N-NH4、N-NO3和S元素含量均無顯著性影響,但可以促進(jìn)果實(shí)對(duì)P、Cu、Mn和Mg元素的吸收和積累,其中Se10處理組Mn元素含量最高,Se75處理組P、Cu和Mg元素含量最高。ZHU等[13]研究表明,噴施硒肥能夠提高鮮食葡萄果實(shí) K 和 Ca 元素含量,但本研究結(jié)果與其不相符,可能因品種和硒源不同。與對(duì)照(Se0)相比,Se10、Se25、Se50和Se75處理的漿果 P 元素分別提高7.57%、11.84%、20.06%和20.68%;Cu元素分別提高35.17%、32.26%、31.18%和36.01%;Mn 元素分別提高37.92%、-6.15%、10.10%和-8.54%;Mg 元素分別提高4.76%、6.42%、1.29%和11.84%。
表1 硒對(duì)釀酒葡萄果實(shí)營(yíng)養(yǎng)元素的影響Table 1 Influence of selenium on nutritional elements of grape berry
注:同一行不同字母表示差異顯著性(P<0.05)(下同)
糖和酸是釀酒葡萄果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過程中的基礎(chǔ)物質(zhì),是色素和風(fēng)味物質(zhì)的基礎(chǔ)原料,其組成和含量是決定漿果品質(zhì)和商品價(jià)值的最重要指標(biāo)[14-15]。由圖2可知,硒顯著增加赤霞珠漿果糖類物質(zhì)含量,而對(duì)有機(jī)酸含量的影響因濃度不同而異,但對(duì)pH值無顯著性影響。Se75和Se50處理的漿果糖類物質(zhì)含量最高,其總糖、還原糖和可溶性固形物含量均顯著高于其他處理;Se25處理的總糖、還原糖含量顯著高于Se10處理,但可溶性固形物含量無顯著性差異;Se10與Se0處理間糖類物質(zhì)含量均無顯著性差異。葡萄果實(shí)糖分主要來源于碳水化合物的同化,而噴施硒能夠促使果實(shí)對(duì) P、Cu和Mg元素吸收和積累,其中 P 參與光合磷酸化作用,Cu 和 Mg 元素是葉綠體的結(jié)構(gòu)部分,是維持葉綠體結(jié)構(gòu)所必須的微量元素,也是許多酶的組成成分,從而增強(qiáng)了光合作用,使得光合產(chǎn)物增加,增強(qiáng)了源的供給能力,并且硒可以提高果實(shí)酸性轉(zhuǎn)化酶的活性[11],最終增加果實(shí)中糖類物質(zhì)的含量。相對(duì)于糖分,葡萄果實(shí)中的有機(jī)酸含量很低,但酸有助于抑制微生物繁殖,穩(wěn)定葡萄與葡萄酒的適口性[14]。Se50處理的有機(jī)酸含量最高,其可滴定酸含量顯著高于其他處理,Se10處理的可滴定酸含量顯著高于Se25、Se75和Se0處理,但Se25、Se75和Se0處理間無顯著性差異。有機(jī)酸是通過果實(shí)組織自身固定CO2在果實(shí)內(nèi)部合成[16],而Mn是許多酶的組成成分,對(duì)許多酶活性起重要的調(diào)節(jié)作用,Se50和Se10處理提高了漿果Mn含量,則有助于有機(jī)酸的合成。與對(duì)照(Se0)相比,Se10、Se25、Se50 和Se75處理的總糖含量分別提高2.1%、7.3%、16.0%和16.3%,還原糖含量分別提高1.2%、9.6%、14.7%和13.7%,可溶性固形物含量提高 0.44%、2.6%、15.9%和 16.3%,可滴定酸含量分別提高10.5%、-2.6%、18.4%和-5.3%。故從糖類物質(zhì)來看,最佳處理是Se75和Se50;從有機(jī)酸來看,最佳處理是Se50。
a-總糖;b-還原糖;c-可溶性固形物;d-可滴定酸;e-pH值
圖2 硒對(duì)釀酒葡萄果實(shí)基本理化指標(biāo)的影響
Fig.2 Influences of selenium on basic physical and chemical indicators in wine grapes
注:圖中不同小寫字母表示相同采樣期中不同處理間差異顯著(P<0.05)(下同)
2.4.1 硒對(duì)赤霞珠釀酒葡萄果實(shí)總酚含量的影響
酚類物質(zhì)是葡萄酒中最重要的風(fēng)味物質(zhì)之一,不僅影響葡萄酒顏色、香氣和口感等感官質(zhì)量,還決定葡萄酒的諸多生理活性功能,也是葡萄酒保健價(jià)值所在[17]。然而,葡萄酒中的酚類物質(zhì)主要來源葡萄果皮、籽和肉中酚類物質(zhì)的溶出,則提高果實(shí)中酚類物質(zhì)含量才有可能增加葡萄酒酚類物質(zhì)的含量[11]。由圖3可知,硒對(duì)果籽、果皮和果肉總酚含量具有一定促進(jìn)作用。Se10處理組果籽、果皮和果肉總酚含量最高,且果皮和果肉總酚含量顯著高于Se0處理。盡管Se10與Se0處理間果籽總酚含量無顯著性差異,但Se10處理組果籽總酚含量比Se0處理高24.44%。Se10、Se25、Se75處理與Se0處理間果籽、果皮和果肉總酚含量均無顯著性差異。與對(duì)照(Se0)相比,Se10、Se25、Se50 和Se75處理組果實(shí)總酚含量分別提高27.9%、-9.9%、12.2%和-3.7%,故從果實(shí)總酚含量來看,Se10為最佳處理。
a-果籽;b-果皮;c-果肉
圖3 硒對(duì)釀酒葡萄果實(shí)總酚含量的影響
Fig.3 Influences of selenium on total phenolic content of wine grapes
2.4.2 硒對(duì)赤霞珠釀酒葡萄果實(shí)總黃烷醇含量的影響
黃烷醇是類黃酮合成途徑的產(chǎn)物,與黃酮醇、花青素的前體物質(zhì)相同[18],是形成葡萄酒澀味、苦味的結(jié)構(gòu)物質(zhì),同時(shí)還起到穩(wěn)定葡萄酒色度的作用[19]。葡萄果肉中總黃烷醇含量微小,用常規(guī)測(cè)定方法未檢測(cè)出。由圖4可知,硒對(duì)果籽和果皮總黃烷醇含量具有一定促進(jìn)作用。噴硒處理組葡萄果籽總黃烷醇含量均顯著高于對(duì)照(Se0),但噴硒處理間果籽總黃烷醇含量無顯著性差異。Se10和Se25處理組果皮總黃烷醇含量均顯著高于對(duì)照(Se0),但Se10和Se25處理間無顯著性差異;Se50和Se75處理組果皮總黃烷醇含量與Se0處理間均無顯著性差異,但Se75處理組果皮總黃烷醇含量顯著低于Se50處理組。與對(duì)照(Se0)相比,Se10、Se25、Se50 和Se75處理組果實(shí)總黃烷醇含量分別提高34.0%、41.8%、34.2%和31.6%,故從果實(shí)總黃烷醇含量來看,Se25為最佳處理。
a-果籽;b-果皮
圖4 硒對(duì)釀酒葡萄果籽和果皮總黃烷醇含量的影響
Fig.4 Influences of selenium on total flavanols content of seeds and skins in wine grapes
2.4.3 硒對(duì)赤霞珠釀酒葡萄果實(shí)花色苷含量的影響
花色苷是存在于葡萄果皮中的水溶性天然色素,屬于類黃酮化合物,影響著葡萄酒的色澤、口感及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,且直接決定紅葡萄酒和新葡萄酒的顏色。同時(shí),花色苷與單寧結(jié)合可使葡萄酒中的單寧軟化,降低其苦澀味和粗糙感,使口感變得更加圓潤(rùn)[20]。由圖5可知,隨著生育期的推進(jìn),果皮花色苷含量大幅度提高,且噴硒處理后2周,硒對(duì)其有顯著性影響。采收期,Se50處理組果皮花色苷顯著高于Se0處理,而Se75處理組果皮花色苷顯著低于其他處理。糖是花色苷合成的原料之一,在果實(shí)發(fā)育過程中,花色苷的合成伴隨糖的積累[21],噴施硒有利于葡萄果實(shí)糖類物質(zhì)的積累,從而促進(jìn)花色苷的合成與積累;然而,不同種類糖對(duì)花色苷合成的影響有所不同,其中蔗糖對(duì)花色苷的生物合成有明顯正向調(diào)控作用,而葡萄糖和果糖等的促進(jìn)作用較小[22-23]。本研究中Se50處理可能更有利于蔗糖的合成與積累,故其漿果果皮花色苷含量最高。與對(duì)照(Se0)相比較, Se10、Se25、Se50 和Se75處理組花色苷含量分別提高19.3%、24.3%、49.2%和-51.1%,故從果實(shí)花色苷含量來看,Se50為最佳處理。
圖5 硒對(duì)釀酒葡萄果皮花色苷含量的影響
Fig.5 Influences of selenium on anthocyanins of skins in wine grapes
硒是谷光甘肽過氧化物酶的必須組分,能夠降低膜受過氧化損害,維持植物抗氧化系統(tǒng),減輕氧化損傷[24];同時(shí),酚類物質(zhì)和糖酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也參與抗氧化的過程[25]。由表2可知,噴硒處理顯著提高葡萄漿果抗氧化能力,其中Se50處理漿果的總還原力和ABTS自由基清除活性最高,Se75處理漿果的DPPH自由基清除活性最高。與對(duì)照(Se0)相比,Se10、Se25、Se50和Se75分別提高總還原力80.17%、102.87%、206.63%和86.90%;分別提高DPPH自由基清除活性40.08%、46.79%、56.58%和93.82%;分別提高ABTS自由基陽離子清除活性8.35%、17.94%、32.54%和20.16%。故從抗氧化能力來看,Se50和Se75為最佳處理。
表2 不同濃度硒對(duì)赤霞珠釀酒葡萄果實(shí)抗氧化特性的影響Table 2 Influence of selenium on antioxidant properties of grape berry
采用灰色系統(tǒng)關(guān)聯(lián)度理論,選取不同處理間具有顯著差異的理化指標(biāo)進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析,其包括總糖、還原糖、可滴定酸、可溶性固形物、總酚、總黃烷醇、花色苷、Se、P、Cu、Mn、Mg、總還原力、ABTS、DDPH 15項(xiàng)指標(biāo)。由表3可知,噴硒處理的釀酒葡萄果實(shí)理化特性加權(quán)關(guān)聯(lián)度高于未噴硒處理的釀酒葡萄果實(shí)理化特性加權(quán)關(guān)聯(lián)度,表明噴硒能夠改善釀酒葡萄果實(shí)質(zhì)量;噴硒處理中,釀酒葡萄果實(shí)理化特性加權(quán)關(guān)聯(lián)度隨噴硒濃度的增加先增后降,其中Se50處理的釀酒葡萄果實(shí)理化特性加權(quán)關(guān)聯(lián)度最高,則表明Se50處理組釀酒葡萄果實(shí)質(zhì)量最佳。
表3 不同硒濃度下釀酒葡萄果實(shí)化學(xué)成分的灰度關(guān)聯(lián)分析Table 3 The relational grade of physicochemical property in grape berry of Cabernet Sauvignon under different selenium dose
釀酒葡萄果實(shí)發(fā)育期噴施適宜濃度的硒可顯著提高赤霞珠果實(shí)可溶性固形物、總糖、還原糖、可滴定酸和Se、P、Cu、Mg含量及其總還原力、DPPH自由基清除活性和ABTS自由基清除活性,而對(duì)果實(shí)pH值和K、Zn、Fe、Ca、N-NH4、N-NO3及S元素含量均無顯著性影響。硒對(duì)果實(shí)酚類物質(zhì)如總酚、總黃烷醇、花色苷等含量和營(yíng)養(yǎng)元素Mg的效應(yīng)因噴施濃度不同而異,通過灰色系統(tǒng)關(guān)聯(lián)度分析,Se50處理的釀酒葡萄果實(shí)質(zhì)量指標(biāo)加權(quán)關(guān)聯(lián)度最高,故果實(shí)發(fā)育期噴施50 mg/L的亞硒酸鈉有助于改善果實(shí)質(zhì)量。