盧 靜 張 環(huán)

(重慶登康口腔護理用品股份有限公司,重慶 400025)

臨床上常用廣譜抗菌劑如洗必泰、四環(huán)素等防齲，但長期使用易引起口腔菌群失調(diào)、使細菌產(chǎn)生耐藥性，因此近年來尋找天然防齲藥物已成為國內(nèi)外研究熱點。蜂膠是蜜蜂從植物的樹芽、樹皮等部位采集的樹脂，再混以蜜蜂的舌腺、蠟腺等腺體分泌物，經(jīng)蜜蜂加工轉(zhuǎn)化而成的一種膠狀物質(zhì)。在國外，蜂膠被譽為“紫色黃金”。蜂膠是一種具有抗微生物作用的天然抗菌劑，對細菌、真菌都有一定的抑制作用[1-2]。

超臨界二氧化碳萃取是一種新型的萃取分離技術(shù)。該技術(shù)是利用CO2在臨界點附近某一區(qū)域(超臨界區(qū))內(nèi)，有選擇性地把極性大小、沸點高低和分子量大小的成分依次萃取出來。然后借助調(diào)整溫度和壓力的方法使超臨界流體變成普通氣體，被萃取物質(zhì)則完全或基本析出，從而達到分離提純的目的。用這種方法得到的蜂膠超臨界提取物無毒、無殘留、安全，萃取條件室溫、無氧，避免有效成分高溫分解和氧化，抗菌成分最大程度保留。

本研究通過體外抗菌實驗，評估添加了蜂膠超臨界提取物的牙膏對金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、變異鏈球菌(ATCC25175)、牙齦卟啉單胞菌(ATCC33277)這三種常見口腔致病菌的抗菌功效。

1 材料和儀器

儀器：超凈臺(上海博訊生化設備有限公司)、水套式二氧化碳培養(yǎng)箱(上海三騰儀器有限公司)。

試劑：蜂膠超臨界提取物(東莞波頓香料有限公司)；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(杭州微生物試劑有限公司)。

2 含蜂膠超臨界提取物的牙膏的抗菌活性研究

2.1 金黃色葡萄球菌抑菌活性

從-80℃冰箱中取出保存的菌種，從中挑取適量菌落置于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)36h活化，然后取適量菌液于平板中涂布，37℃下培養(yǎng)24-36h；

將受試菌種分別接種到相應培養(yǎng)基中，待菌種進行活化后，用已滅菌移液槍槍頭吸取1ml已活化的待測菌種，置于已滅菌的9mL生理鹽水試管中，充分均勻數(shù)次，制成菌懸液。然后用已滅菌移液槍槍頭吸取1mL上述菌懸液置于另一只裝有已滅菌9mL生理鹽水試管中進行稀釋，依次稀釋成107CFU/ml的菌懸液(約10倍稀釋5次)，備用。

將編號為A(0.1%蜂膠牙膏)、B(0.3%蜂膠牙膏)、C(空白牙膏)的樣品牙膏分別與水按20%(1∶5)，10%(1∶10)，5%(1∶20)的比例稀釋成牙膏漿，每個樣品稀釋三個濃度，共9種牙膏漿濃度。采用牛津杯抑菌法測定金黃色葡萄球菌在加入牙膏漿后的抑菌活性，抑菌圈直徑大小作為加入樣品后的活性指標。將滅菌處理后的培養(yǎng)基分別倒入無菌平板中，每個平板約15ml，待平板凝固后，用移液槍取200μL菌懸液分別加在平板上，用涂布棒均勻涂開。每個平板放入3個已滅菌的牛津杯，成等邊三角形擺放，其中2個牛津杯盛放同一濃度的牙膏漿，1只盛放水溶液作空白對照。然后用已滅菌移液槍槍頭分別吸取200μL上述不同濃度的9種牙膏漿和水溶液置于同一平板的3只牛津杯內(nèi)，每種濃度的樣品液做兩組平行試驗，共18個平板，在37℃下培養(yǎng)36h觀察結(jié)果。

表1 樣品牙膏的平均抑菌圈大小(單位cm)

用十字交叉法測量每個平板中的抑菌圈直徑，樣品牙膏在20%，10%，5%的稀釋比例下，除C樣品牙膏無抑菌圈出現(xiàn)外，其它樣品均有明顯的抑菌圈出現(xiàn)。A、B樣品牙膏對金黃色葡萄球菌的抑制作用較好但無明顯差異。

2. 2 變異鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌抑菌活性[3-4]

從-80℃冰箱中取出保存的菌種，挑取適量菌落置于平板上，37℃下培養(yǎng)36h，然后進行傳代和種子培養(yǎng)。用接種環(huán)挑取適量菌種于無菌生理鹽水離心管中，充分振搖，稀釋成107CFU/ml的菌懸液(約10倍稀釋4次)，備用。將A、B、C三個樣品牙膏分別與水按40%，20%，10%，5%，2.5%，1.25%的比例稀釋成牙膏漿，共18種濃度的牙膏漿，備用。取不同濃度的牙膏漿1ml加入無菌平板中，再在無菌平板中加入9ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，搖勻。配制成比牙膏漿濃度稀釋10倍的帶樣平板(即濃度為4%，2%，1%，0.5%，0.25%，0.125%)，樣品溶劑水為空白對照。用移液槍取100 μL107CFU/ml的菌懸液加在帶樣平板上，用涂布棒均勻涂開。每個濃度做兩組平行，在37℃厭氧培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)72h，觀察供試菌生長情況，完全抑制細菌生長的最低樣品濃度為對樣品供試菌的最小抑制濃度MIC。

表2 變異鏈球菌生長菌落計數(shù)

樣品牙膏C對變異鏈球菌的抑制效果較差，樣品牙膏綜合濃度在0.25%和0.12%下，A牙膏和B牙膏對變異鏈球菌的抑制作用相當。

表3 牙齦卟啉單胞菌生長菌落計數(shù)

表4 樣品牙膏對變異鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌的最小抑制濃度MIC

樣品牙膏C對牙齦卟啉單胞菌的抑制效果較差，樣品牙膏濃度在0.25%時， B牙膏對牙齦卟啉單胞菌的抑制作用優(yōu)于A牙膏；樣品濃度為0.12%時，A牙膏對牙齦卟啉單胞菌的抑制作用優(yōu)于B牙膏。

從抑菌實驗結(jié)果可知，添加了蜂膠的牙膏對常見口腔致病菌金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、變異鏈球菌(ATCC25175)、牙齦卟啉單胞菌(ATCC33277)有明顯的抗菌功效，0.1%蜂膠牙膏與0.3%蜂膠牙膏效果沒有明顯差異，而不添加蜂膠的牙膏則無明顯的抑菌效果。

3 討論

蜂膠是一種相對理想的天然廣譜抗菌劑，對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌均有不同程度的抑制作用，并且無毒性[2]。蜂膠抗微生物的作用機制較復雜，可能是由于眾多成分共同作用所致。蜂膠超臨界提取物采用超臨界萃取工藝可以最大程度的保留抗菌成分，添加0.1%就可以達到較好的抗菌效果。早在50年代，國外就應用蜂膠軟膏成功地治療了復發(fā)性口瘡、口腔糜爛、潰瘍等口腔疾病。蜂膠在食品、保健品領域用得比較廣泛，但在口腔護理用品領域還未得到很好地推廣。因此，如何有效利用蜂膠作為抗菌劑治療齲齒和牙周炎是未來很有必要去研究的一個熱門領域。