寧科功 趙信義 伍 鵬 王 舟 高 鷹

(1.云南白藥股份有限公司，云南 昆明；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710032)

牙齒是人體最為堅(jiān)硬的礦化組織。在人口腔環(huán)境中，正常情況下牙釉質(zhì)表面處于脫礦-再礦化動態(tài)平衡中，維持了牙齒硬組織的結(jié)構(gòu)、形態(tài)和功能。但是在某些情況下，牙釉質(zhì)表面脫礦-再礦化動態(tài)平衡被病理因素打破，脫礦超過了再礦化，導(dǎo)致釉質(zhì)表面礦物質(zhì)緩慢丟失，出現(xiàn)諸如牙齒齲壞、酸蝕癥等牙齒疾病[1]。在這種情況下，需要通過外界干涉來減小牙齒表面的脫礦，或者促進(jìn)再礦化來修復(fù)牙齒的脫礦[2]?？谇蛔o(hù)理用品，特別是牙膏，是人們每天都要使用的潔齒產(chǎn)品，賦予牙膏具有牙齒硬組織再礦化功能一直是人們追求的目標(biāo)[3]。目前國內(nèi)外市售的許多牙膏聲稱具有牙齒硬組織再礦化功能，對于這些牙膏的評價(jià)和管理已經(jīng)成為行業(yè)協(xié)會一項(xiàng)緊迫的任務(wù)，但是國內(nèi)一直缺少體外評價(jià)牙膏促進(jìn)牙釉質(zhì)再礦化有效性的標(biāo)準(zhǔn)方法。國際上雖然有許多關(guān)于牙齒再礦化研究的論文，但是所采用的方法復(fù)雜，測試過程步驟多、時間長，更適合于牙齒再礦化的學(xué)術(shù)研究，例如機(jī)制研究。本研究基于單純體外評價(jià)牙膏促進(jìn)牙釉質(zhì)再礦化有效性為目的，研究出一種方法簡單、步驟少、時間短的牙釉質(zhì)體外再礦化有效性試驗(yàn)方法，以為建立相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 新鮮牛切牙近1個月拔出的牛切牙，拔出后浸泡于生理鹽水中于4℃冷藏保存。

1.1.2 牙齒脫礦液配方[4]0.1 mol/L乳酸，30g/L羧甲基纖維素，用0.2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為4.2。

1.1.3 人工唾液的配方[4]1.5mmol/L CaC12，0.9mmol/L KH2PO4，130mmo1/L KCl，1.0mmol/L NaN3、20mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，用0.2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0。

1.1.4 含氟牙膏配方摩擦劑水合二氧化硅、濕潤劑甘油，表面活性劑月桂醇硫酸，粘合劑羧甲基纖維素鈉鹽，香精薄荷醇，氟化鈉。共配制氟含量分別為0.05%、0.1%、0.15%三種含氟牙膏。

1.1.5 無氟牙膏配方 與1.4中的含氟牙膏基本相同，只是不含氟化鈉。

1.2 方法

1.2.1 釉質(zhì)試塊的制備選擇新近拔除的牛切牙，去除牙根及釉質(zhì)表面污物。用低速金剛石切割機(jī)切割成4mm×5mm×2mm的釉質(zhì)塊，用環(huán)氧樹脂包埋并暴露唇面釉質(zhì)(圖1)。然后分別用#800、#1200、#2000碳化硅水砂紙?jiān)谧⑺乱来文佊再|(zhì)面和試塊底面，充分暴露釉質(zhì)面并使釉質(zhì)面與試塊底面平行。最后用0.3μm氧化鋁拋光液進(jìn)行拋光，使釉質(zhì)表面平整且為鏡面狀，在體視顯微鏡下檢查無明顯的劃痕。

1.2.2 釉質(zhì)塊表面硬度測定在維氏顯微硬度計(jì)上測定釉質(zhì)的表面硬度，載荷100g，保荷15s。每個釉質(zhì)塊表面測定5個點(diǎn)，均勻分布于釉質(zhì)表面，以均值表征釉質(zhì)初始表面硬度(SH0)。

1.2.3 釉質(zhì)塊的表面脫礦將每個試樣分別置于盛有15ml脫礦液(1.1.2)的帶蓋塑料瓶中，將塑料瓶置于37℃恒溫箱中靜置脫礦30min～10hs。脫礦后取出釉質(zhì)試塊，去離子水沖洗、吹干后測定表面維氏硬度，方法同1.2.2，以均值表征釉質(zhì)脫礦后表面硬度(SH1)。

1.2.4 脫礦釉質(zhì)試塊的分組及處理將釉質(zhì)塊按照脫礦后硬度由大到小排列，按照硬度值均衡分配原則將試樣分為7組，每組10個試樣。七個實(shí)驗(yàn)組為：無氟牙膏刷牙組、0.05%氟牙膏刷牙組、0.15%氟牙膏刷牙組、無氟牙膏浸泡組、0.05%氟牙膏浸泡組、0.1%氟牙膏浸泡組、0.15%氟牙膏浸泡組。

無氟牙膏刷牙組:脫礦釉質(zhì)試塊釉質(zhì)表面每天用無氟牙膏刷牙兩次(早上8∶00、晚上19∶00)，每次刷牙1分鐘，浸泡1分鐘，刷牙用軟毛旋轉(zhuǎn)電動牙刷(THOMAS)(圖2)，刷牙壓力75g，牙膏漿以牙膏∶去離子水=1∶2(質(zhì)量比)比例配置，經(jīng)高速分散機(jī)分散均勻。刷牙后釉質(zhì)試塊用去離子水沖洗、吹干，放入盛有15ml人工唾液(1.1.3)的帶蓋塑料瓶中，將塑料瓶置于37℃恒溫箱中進(jìn)行再礦化處理。此過程連續(xù)進(jìn)行兩周。

圖2 釉質(zhì)試塊安放在硅橡膠凹面底座中(a)，凹面加入牙膏漿，用電動牙刷對釉質(zhì)表面進(jìn)行磨刷，牙刷磨頭配有砝碼(b)，磨刷壓力為75g。

0.05%氟牙膏刷牙組和0.15%氟牙膏刷牙組：方法同無氟牙膏刷牙組，只是使用的牙膏漿分別是含0.05%氟的牙膏和含0.15%氟的牙膏。

無氟牙膏浸泡組：脫礦釉質(zhì)試塊每天用無氟牙膏漿浸泡兩次(早上8∶00、晚上19∶00)，每次2分鐘。牙膏漿以牙膏∶去離子水=1∶2(質(zhì)量比)比例配置，經(jīng)高速分散機(jī)分散均勻。牙膏漿用量：10個試樣/10ml,浸泡時牙膏漿處于搖動狀態(tài)(圖3)。浸泡后釉質(zhì)試塊用去離子水沖洗、吹干，放入盛有15ml人工唾液(1.1.3)的帶蓋塑料瓶中，將塑料瓶置于37℃恒溫箱中進(jìn)行再礦化處理。此過程連續(xù)進(jìn)行兩周。

圖3 釉質(zhì)試塊浸泡牙膏漿

0.05%氟牙膏浸泡組、0.10%氟牙膏浸泡組及0.15%氟牙膏浸泡組：方法同無氟牙膏浸泡組，只是使用的牙膏漿分別是含0.05%氟的牙膏漿、含0.10%氟的牙膏漿和含0.15%氟的牙膏漿。

1.2.5 再礦化后的硬度測定各組釉質(zhì)試塊在連續(xù)處理2周后對釉質(zhì)表面的硬度進(jìn)行測定，方法同1.2.2。以均值表征釉質(zhì)再礦化后表面硬度(SH2)。

1.2.6 再礦化后脫礦釉質(zhì)試塊表面硬度恢復(fù)率的計(jì)算[5]以下式計(jì)算釉質(zhì)試塊再礦化后表面硬度恢復(fù)率(SHR%)：

SHR%=[(SH2-SH1)/( SH0-SH1)]×100

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間差異比較選用單因素方差分析(ANOVA)，組間均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 牙釉質(zhì)的脫礦方式與脫礦時間

圖4是釉質(zhì)試塊放入脫礦液中于37℃水浴中，分別進(jìn)行靜置脫礦和搖晃脫礦3h后的表面硬度變化柱狀圖，可見未脫礦前釉質(zhì)塊表面硬度基本相同，脫礦3h后，靜置脫礦的釉質(zhì)表面硬度降低至111.7kg/cm2，而搖晃脫礦的釉質(zhì)表面硬度降低至51.2kg/cm2。研究發(fā)現(xiàn)，釉質(zhì)表面硬度低于90kg/cm2時，顯微硬度計(jì)在高倍鏡(×400)下壓痕輪廓變得模糊，難以測量壓痕尺寸，需要在低倍鏡(×100)下測量，增加了數(shù)值轉(zhuǎn)換過程。

圖4 靜置脫礦與搖晃脫礦3h后釉質(zhì)的表面硬度

對于靜置脫礦來說，在脫礦的3h內(nèi)，脫礦時間與釉質(zhì)表面硬度的關(guān)系見圖5，可見脫礦最初1.0h內(nèi)，釉質(zhì)表面硬度下降較快，1.0h后硬度下降減緩。

圖5 靜置脫礦時間與硬度的關(guān)系

2.2 牙釉質(zhì)脫礦后在人工唾液中的再礦化效果曲線

圖6是初始表面硬度為335kg/cm2的釉質(zhì)靜置脫礦3.0h后硬度變化及在37℃人工唾液中靜置浸泡(每24h更換新鮮人工唾液)6天(144h)過程中釉質(zhì)表面硬度的變化情況，可見脫礦后的釉質(zhì)經(jīng)過在人工唾液中浸泡后，釉質(zhì)表面硬度有大幅度增加，再礦化效果非常明顯，特別是在浸泡人工唾液的最初24h內(nèi)，釉質(zhì)表面硬度增加幅度最大，24h后表面硬度增加顯著減緩，說明在人工唾液浸泡的最初24h，脫礦的釉質(zhì)再礦化效果最為明顯，浸泡24h后，再礦化效果顯著減緩。這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5]。

圖6 牙釉質(zhì)脫礦后在人工唾液中的再礦化效果曲線

2.3 牙膏漿浸泡與刷牙對脫礦釉質(zhì)再礦化的影響

圖7是脫礦釉質(zhì)每天分別用4種牙膏漿浸泡2分鐘2次，其他時間浸泡于人工唾液中，連續(xù)進(jìn)行2周后脫礦牙釉質(zhì)的硬度恢復(fù)率，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，0.10%氟及0.15%氟牙膏漿浸泡組的硬度恢復(fù)率顯著高于無氟牙膏和0.05%氟組(P<0.05),而無氟牙膏漿組與0.05%氟牙膏漿組的硬度恢復(fù)率無顯著性差異(P>0.05)。0.10%氟及0.15%氟牙膏漿浸泡組間比較，差距無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖7 脫礦釉質(zhì)每天牙膏浸泡2次2周后釉質(zhì)硬度恢復(fù)率

圖8是脫礦釉質(zhì)每天早、晚分別用3種牙膏漿刷牙1分鐘+浸泡1分鐘，其他時間浸泡于人工唾液中，連續(xù)進(jìn)行2周后脫礦牙釉質(zhì)的硬度恢復(fù)率，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，3個實(shí)驗(yàn)組的釉質(zhì)硬度恢復(fù)率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明用牙膏刷牙，無法判別含氟牙膏的再礦化優(yōu)勢。

圖8 脫礦釉質(zhì)每天牙膏刷牙2次2周后釉質(zhì)硬度恢復(fù)率

圖9是脫礦牙釉質(zhì)表面未刷牙(左側(cè))與刷牙(右側(cè))部分的表面三維形貌(A)及藍(lán)線處的表面輪廓線(B)。可見，在脫礦釉質(zhì)表面刷牙部分釉質(zhì)表面有不均勻的實(shí)質(zhì)性損失，說明刷牙過程磨掉了牙釉質(zhì)表面脫礦后的表面層。

圖9 脫礦牙釉質(zhì)表面未刷牙(左側(cè))與刷牙(右側(cè))部分的表面三維形貌(A)及藍(lán)線處的表面輪廓線(B)

3 討論

3.1 關(guān)于釉質(zhì)脫礦硬度

在進(jìn)行體外再礦化試驗(yàn)時，需要對牙釉質(zhì)表面進(jìn)行脫礦，脫礦到什么程度是人們關(guān)心問題。我們認(rèn)為，脫礦的程度首先要有利于脫礦后硬度的測定，現(xiàn)有的釉質(zhì)硬度測定均采用顯微硬度計(jì)進(jìn)行測定，常用的是維氏(Vicker′s)硬度或者努氏(Knoop′s)硬度，這兩種硬度壓痕極小，需要在高倍顯微鏡下測定壓痕尺寸。如果釉質(zhì)脫礦程度太大，在硬度計(jì)高倍鏡下壓痕輪廓會模糊不清，影響壓痕尺寸測定的準(zhǔn)確性。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，釉質(zhì)表面維氏硬度低于90kg/cm2時，高倍鏡下壓痕尺寸測定精度會顯著下降，需要在低倍鏡下測定壓痕尺寸，需要通過倍數(shù)換算確定硬度值，增加了工作量，因此釉質(zhì)脫礦后維氏硬度最好不要低于90kg/cm2。

釉質(zhì)脫礦后的硬度也不能太高，現(xiàn)有的研究表明，釉質(zhì)脫礦后的再礦化效果(硬度恢復(fù)率)與脫礦后釉質(zhì)硬度有關(guān)，較低硬度的釉質(zhì)再礦化后的硬度恢復(fù)率較高。參考相關(guān)文獻(xiàn)，我們認(rèn)為釉質(zhì)脫礦后的維氏硬度最好在100～160kg/cm2范圍內(nèi)。

3.2 關(guān)于再礦化試驗(yàn)方法

文獻(xiàn)中有許多牙釉質(zhì)再礦化試驗(yàn)方法[7-9]，用于不同的再礦化研究中，其中pH循環(huán)法(pH cycling model)是一種脫礦-再礦化循環(huán)法，模擬人口腔中酸堿度變化情況。但是這種方法需要較長的時間(15～30天)，而且每天的操作步驟多，工作量大。作為評價(jià)潔齒劑促進(jìn)脫礦牙釉質(zhì)再礦化有效性的體外試驗(yàn)方法，應(yīng)當(dāng)具有試驗(yàn)時間短、操作步驟少、便于大通量進(jìn)行、能夠展示再礦化有效性的特點(diǎn)，而人工唾液浸泡法也是常用的、有效的再礦化方法[10]。鑒于此，我們認(rèn)為潔齒劑的再礦化試驗(yàn)方法采用人工唾液浸泡方法。從本研究的結(jié)果來看，人工唾液的浸泡具有顯著的再礦化效果，特別是在浸泡最初的24h，再礦化效果非常顯著。

關(guān)于再礦化試驗(yàn)的時間，從圖6可見，牙釉質(zhì)脫礦后浸泡于人工唾液后，在最初的24h內(nèi)釉質(zhì)的表面硬度增加幅度最大，24h后至第5天，釉質(zhì)硬度仍然有緩慢增加，第5天后增加幅度很小?；谶@樣的現(xiàn)象，我們建議牙釉質(zhì)體外再礦化試驗(yàn)時間定位5～6天為宜。

3.3 關(guān)于潔齒劑施加方式

評價(jià)潔齒劑促進(jìn)脫礦牙釉質(zhì)再礦化的有效性是本研究建立體外試驗(yàn)方法的核心。本研究評價(jià)了潔齒劑浸泡和潔齒劑刷牙兩種方式，以公認(rèn)的能夠促進(jìn)牙齒再礦化的含氟牙膏作為試驗(yàn)的陽性對照，以無氟牙膏作為陰性對照。結(jié)果表明，用含0.10%和0.15%氟的牙膏漿每日早、晚各浸泡2分鐘，可以顯著促進(jìn)釉質(zhì)的再礦化，表現(xiàn)在釉質(zhì)硬度恢復(fù)率顯著大于陰性對照的無氟牙膏和含0.05%氟的牙膏，這一結(jié)果與許多文獻(xiàn)報(bào)告一致[11,12]。說明本研究采用的再礦化方法及潔齒劑施加方法是有效的。而用牙膏刷牙的施加方法，由于會磨除硬度降低的表面釉質(zhì)層而不能展現(xiàn)釉質(zhì)的再礦化效果，因此建議不要使用刷牙方法來評價(jià)潔齒劑促進(jìn)再礦化的有效性。

3.4 關(guān)于潔齒劑促進(jìn)脫礦牙釉質(zhì)再礦化有效性的判定

關(guān)于潔齒劑促進(jìn)脫礦牙釉質(zhì)再礦化的體外試驗(yàn)方法，我們建議設(shè)立陰性對照組、陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組，陰性對照組的潔齒劑采用不具有促進(jìn)脫礦牙釉質(zhì)再礦化的配方組成物，例如僅含有基本成分的潔齒劑，不含任何活性成分。而陽性對照應(yīng)當(dāng)采用已經(jīng)證明有促進(jìn)脫礦釉質(zhì)再礦化的潔齒劑，例如本研究中的氟含量不低于0.10%的含氟潔齒劑，設(shè)立陽性對照的目的是確保試驗(yàn)過程的有效性，只要陽性對照組的釉質(zhì)硬度恢復(fù)率高于陽性對照，說明試驗(yàn)過程是有效的。測試中，只要受試產(chǎn)品組(實(shí)驗(yàn)組)經(jīng)過5天的再礦化試驗(yàn)，其釉質(zhì)硬度恢復(fù)率顯著高于陽性對照組(P<0.05),即可判定受試產(chǎn)品具有促進(jìn)脫礦釉質(zhì)再礦化的能力。