肖坤 龔燦 郭強勝 許旭

摘 要 建立了定量核磁共振碳譜（13C-qNMR）技術(shù)測定食用油中特定位置不飽和脂肪酸含量的方法。使用反轉(zhuǎn)門控去耦技術(shù)對食用油中的脂肪酸進(jìn)行位置特異性分析，針對未完全分離的譜峰，比較了直接普通積分、使用不同的洛倫茲/高斯函數(shù)比值去卷積積分等數(shù)據(jù)處理方式對核磁共振碳譜定量結(jié)果的影響，選擇以洛倫茲-高斯（3：2）的比例，對譜圖進(jìn)行去卷積擬合，提取sn-1，3和sn-2位亞油酸和油酸兩種不飽和脂肪酸的定量峰，測定3種食用油中甘油三酯的飽和脂肪酸、sn-1，3位亞油酸、sn-2位亞油酸、sn-1，3位油酸、sn-2位油酸含量分別為：大豆油（16.2%、27.8%、24.0%、15.5%、7.9%（w/w，下同））;玉米油（15.3%、30.7%、20.5%、20.1%、13.3%）;花生油（18.3%、18.7%、12.5%、24.9%、25.5%）。大豆油中sn-1，3位亞麻酸、sn-2位亞麻酸分別為4.5%和4.0%，玉米油和花生油中未檢出亞麻酸。上述結(jié)果與1H-qNMR測定的各脂肪酸總量一致。13C-qNMR可對食用油中脂肪酸進(jìn)行位置特異性分析，無需復(fù)雜的樣品前處理過程，可區(qū)分不飽和脂肪酸的不同位置分布，為在缺乏甘油三酯標(biāo)樣的情況下測量食用油中特定甘油三酯位置異構(gòu)體成分含量提供了新方法。

關(guān)鍵詞 定量核磁共振波譜法;核磁共振碳譜;食用油;脂肪酸;位置異構(gòu)體

1 引 言

食用油是人體所需脂肪和能量的重要來源[1]，也是體內(nèi)必需脂肪酸的主要來源。目前，市場上常見的食用油多為植物油，如大豆油、玉米油、花生油和橄欖油等。甘油三酯（TAGs）是食用油的主要成分，因其甘油骨架上結(jié)合的脂肪酸不同而種類繁多[2]，其中的亞麻酸、油酸、亞油酸以及棕櫚酸等飽和脂肪酸的攝入量與多種慢性疾病有關(guān)[3～6]。食用油中脂肪酸的主要分析方法有氣相色譜法（GC）[7～11]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）[12～14]等。這些方法需要復(fù)雜的樣品前處理過程，即將甘油三酯轉(zhuǎn)酯化為沸點較低的脂肪酸甲酯再分析[15]。Barison等[16]提出了一種簡便的核磁共振氫譜（1H-NMR）方法，測定食用油中脂肪酸的相對含量，快速簡便，且無需復(fù)雜的樣品前處理過程，測定的脂肪酸結(jié)果與AOAC的氣相色譜法一致。

脂肪酸在甘油骨架中還存在位置特異性，可根據(jù)sn-1、sn-2、sn-3（sn： stereospecific numbering）編號區(qū)別各脂肪酸在甘油骨架的位置[7]，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。脂肪酸的位置對油脂的物理性質(zhì)、生物化學(xué)性質(zhì)和營養(yǎng)價值都有重要影響[17]。位于sn-2位的脂肪酸通過腸壁以甘油單酯的形式被吸收[18]，可能對動脈粥樣硬化、血脂和脂蛋白原形成不同的急性或慢性作用，并增加患心血管疾病的風(fēng)險[19～21];而位于sn-1，3位的脂肪酸則作為游離的脂肪酸被人體吸收。研究表明[22，23]，棕櫚酸在甘油骨架的sn-2位具有促進(jìn)嬰幼兒對礦物質(zhì)吸收的作用;而sn-1，3位的棕櫚酸則很容易被腸道內(nèi)脂肪酶水解成游離棕櫚酸，與鈣、鎂等礦物質(zhì)發(fā)生皂化反應(yīng)，降低人體對脂肪的吸收利用效率。因此，對甘油三酯中的脂肪酸進(jìn)行區(qū)域特異性分析非常重要。

脂肪酸在甘油骨架上的位置分析通常通過酶水解、格氏化學(xué)降解和色譜分析的組合確定[26]。常規(guī)的酶和化學(xué)方法存在長鏈多不飽和脂肪酸對某些脂肪酶催化分析的抗性[27]、通過格式化學(xué)降解可能引起的?；w移[28]、樣品制備期間的損失或污染等缺點[29]。脂肪酸的核磁共振分析通常使用1H-NMR，但1H-NMR不能對脂肪酸進(jìn)行位置特異性分析。13C-NMR的化學(xué)位移范圍（約200 ppm）較大，可以識別幾乎所有不飽和脂肪酸，而且可以通過特征化學(xué)位移區(qū)分不飽和脂肪酸的位置特異性，還可以避免甘油三酯的酶促和格氏水解中無法完全消除酰基遷移所引起的樣品損失或污染等問題。因此，定量核磁共振碳譜（13C- qNMR）在分析食用油中不同位置脂肪酸時具有明顯優(yōu)勢。

目前，13C-qNMR已被用于天然產(chǎn)物[30]和代謝物[31]的定量分析、材料科學(xué)[32]和脂質(zhì)分析[33]等領(lǐng)域。甘油三酯骨架上的羰基碳是13C-qNMR的主要研究對象。然而，羰基碳自旋-晶格弛豫時間（T1）比其它類型的碳更長，而且脈沖角度、脈沖序列以及溫度等實驗參數(shù)對區(qū)域特異性分析影響較大，導(dǎo)致每次NMR實驗時間較長[34]。這對于在較短的實驗時間內(nèi)實現(xiàn)最佳信噪比（S/N），進(jìn)而進(jìn)行準(zhǔn)確的區(qū)域特異性分析提出了挑戰(zhàn)。為縮短實驗時間，Vlahov等[35]假設(shè)所有羰基碳受質(zhì)子去耦的影響相同，在完全核Overhauser增強（NOE）下可獲得信噪比較高的譜圖。Suárez等[36]將寬帶去耦脈沖序列應(yīng)用于qNMR碳譜分析。然而，Gouk等[34]的研究表明，在sn-1，3和sn-2處的羰基碳的NOE可能不同，因此，寬帶去耦脈沖序列并不能用于qNMR碳譜分析中。除了羰基碳，甘油三酯的sn-1，3和sn-2位的其它碳原子也具有不同的化學(xué)位移，如乙烯基碳。Meusel等[37]將GC、MALDI-TOF-MS和DEPT-45結(jié)合，通過分析乙烯基碳確定食用油中甘油三酯的含量。Merchak等[38]使用13C-INEPT序列（極化轉(zhuǎn)移技術(shù)）和氣相色譜（GC）分析橄欖油樣品中脂肪酸和角鯊烯，同時用13C-INEPT光譜的去卷積峰面積作為預(yù)測因子構(gòu)建多變量預(yù)測模型。相對復(fù)雜的HSQC-TOCSY NMR譜也已被用于分析甘油三酯混合物中棕櫚酸和油酸的位置特異性分布[39]。通常，13C-NMR譜中的峰強度與碳核的數(shù)目不成正比，原因是每個碳原子的自旋-晶格弛豫時間不同，以及核的Overhauser增強（NOE）效應(yīng)不同。然而，采用加順磁弛豫試劑和加大脈沖間隔，特別是可以采用反轉(zhuǎn)門控去耦消除NOE效應(yīng)，同時消除全部質(zhì)子的耦合，可以達(dá)到 13C核定量分析的目的[40]。脈沖傅里葉變換NMR的門控去偶（Gated decoupling）取13C的脈沖時間間隔tR> 5T1（T1為該化合物各碳原子中的最長縱向弛豫時間），這樣可使磁化矢量恢復(fù)到平衡值，全去耦的碳譜NOE影響很小，譜線高度正比于碳原子數(shù)目，可用于定量分析。

本研究根據(jù)文獻(xiàn)[16]的方法，以苯甲酸為內(nèi)標(biāo)，用1H-qNMR同時測定了大豆油中亞麻酸、亞油酸、油酸和飽和脂肪酸的絕對含量，進(jìn)行了方法學(xué)驗證。在此基礎(chǔ)上，采用13C-NMR反轉(zhuǎn)門控去耦技術(shù)對食用油中的脂肪酸進(jìn)行位置特異性分析，應(yīng)用去卷積法提取sn-1，3和sn-2位上油酸和亞油酸的峰面積，選擇苯甲酸作為內(nèi)標(biāo)計算各位置不同脂肪酸的含量。本方法簡便且無需復(fù)雜的樣品前處理過程，可在沒有甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)樣品的情況下，對食用油中甘油三酯的位置特異性脂肪酸進(jìn)行絕對含量的分析測定。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Bruker AVANCE III 500MHz核磁共振譜儀（德國Bruker公司）;VGT-2120QT超聲波清洗機(jī)（廣東固特超聲實業(yè)有限公司）;DC-12氮吹儀（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

苯甲酸（基準(zhǔn)物質(zhì)，99.95%～100.05%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;氘代氯仿（99.8% D +0.03% TMS，Cambridge Isotope Lab公司）;油酸（Oleic Acid，>99.0%）和亞油酸（Linoleic acid，>99.0%，日本Tokyo Chemical Industry公司）;亞麻酸（Linolenic Acid，>99.0%，美國Acros Organics公司）;三油酸甘油酯（OOO）、三亞油酸甘油酯（LLL）（上海阿拉丁試劑有限公司）;1，2-二油酸-3-亞麻酸甘油三酯（OOLn）、1，3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯（OPO）（瑞典Larodan精細(xì)化學(xué)品有限公司）。 所有甘油三酯均冷凍保存。

大豆油（Soybean oil）、玉米油（Corn oil）和花生油（Peanut oil）購于本地超市。

2.2 樣品的制備

稱取約200 mg樣品，溶于0.5 mL CDCl3，氮氣吹掃2 min后，加入準(zhǔn)確稱取的苯甲酸內(nèi)標(biāo)，并超聲2 min，去除樣品中順磁性溶解氧對實驗的影響，然后轉(zhuǎn)移至5 mm的核磁管中待用。所有油樣均用60℃水浴加熱10 min，確保其均勻性。

2.3 定量核磁共振碳譜

13C-qNMR采集條件：反轉(zhuǎn)門控去耦脈沖序列zgig30，其脈沖時序圖和相循環(huán)如圖2所示。掃描次數(shù)NS=256，空掃次數(shù)DS=4，延遲時間D1 =35 s，譜寬SW=285 ppm，O1P=110 ppm，O2P=4.5 ppm，SI=256 K，測定NMR圖譜。積分前先調(diào)平NMR基線，選擇對應(yīng)的峰的積分區(qū)間，每個峰積分3～5次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）<1%時取平均值。在對譜圖進(jìn)行處理之前，先進(jìn)行相位校正和基線調(diào)平。最后，根據(jù)中國藥典的絕對定量公式計算待測組分的含量（Ws）[41]：

其中Wr為稱取得苯甲酸（內(nèi)標(biāo)）的質(zhì)量，As和Ar分別為供試品和苯甲酸內(nèi)標(biāo)峰（δ 129.43 ppm）的峰面積，Es和Er分別為供試品和苯甲酸內(nèi)標(biāo)的當(dāng)量重量（分子量/該共振峰處的碳核數(shù)目）。

2.4 1H-qNMR譜中脂肪酸的分析

1H-qNMR采集條件：脈沖序列zg30。選擇脈沖寬度P1=14.10 μs，延遲時間D1=6 s，掃描次數(shù)NS=32，測定NMR圖譜。參考文獻(xiàn)[16]中脂肪酸的計算方法，并加入內(nèi)標(biāo)苯甲酸，對大豆油中脂肪酸的含量進(jìn)行測定。

3 結(jié)果與討論

3.1 脂肪酸的1H-NMR分析

3.1.1 實驗參數(shù)的影響 分別考察了不同延遲時間D1和掃描次數(shù)NS對1H-NMR譜積分面積的影響。當(dāng)D1≥5 s，NS≥16時，信噪比（S/N）可以達(dá)到150以上，且Ar與As趨于穩(wěn)定。故選擇參數(shù)P1=14.10 μs，D1=6 s，NS=32。

3.1.2 方法學(xué)考察結(jié)果 亞麻酸、亞油酸、油酸3種脂肪酸線性相關(guān)系數(shù)（R）為0.9990～0.9997，日內(nèi)精密度（RSD）為0.2%～0.7%，日間精密度（RSD）為0.8%～2.0%。根據(jù)中國藥典的標(biāo)準(zhǔn)曲線剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差和英國藥典對qNMR要求（S/N ≥ 150：1），估計3種脂肪酸的檢出限在1.4～5.5 g/L之間，定量限為4.8～17.2 g/L。在測定后的樣品中加入3種脂肪酸（加標(biāo)量均約為樣品中含量的兩倍），測得加樣回收率為96.8%～102.9%。

3.1.3 樣品中主要脂肪酸的測定 分別平行稱取200 mg左右大豆油樣品，用2.4節(jié)的方法的測定其中主要不飽和脂肪酸的含量（n=3）為：亞麻酸9.1%±0.6%、亞油酸51.5%±1.7%、油酸23.2%±1.5%、飽和脂肪酸16.2%±1.2%（w/w）。

3.2 脂肪酸的13C-qNMR分析

3.2.1 食用油中位置脂肪酸的13C-NMR峰歸屬 采用2.3節(jié)的方法，測定幾種甘油三酯試劑純品的NMR譜圖，具體歸屬見圖3。

對比圖1中的甘油骨架和脂肪酸的基本結(jié)構(gòu)，對比甘油三酯純品的13C-NMR譜圖，并參考文獻(xiàn)[38]，確定食用油中不同位置脂肪酸的13C-NMR化學(xué)位移如圖4和圖5所示。具體歸屬結(jié)果見表1。

3.2.2 13C核弛豫時間（T1）的測定

通過反轉(zhuǎn)恢復(fù)脈沖序列測量了用于獲得定量13C-NMR譜圖的弛豫時間。選擇脈沖序列： t1irpg，T1 delay設(shè)置為： 0.05、0.5、1、3、6、10、16、24和50 s。測得sn-1，3位亞油酸（L）的T1最大值為6.75 s。考慮脈沖延遲時間D1、弛豫時間T1與磁化矢量恢復(fù)關(guān)系。當(dāng)D1為5倍T1時，磁化矢量恢復(fù)率大于99.9%。最終選擇D1為35 s。

對于反轉(zhuǎn)門控去偶技術(shù)，為了使去偶照射建立起來的NOE效應(yīng)不影響下一次測定，必須增加兩次NMR信號采樣之間的延遲時間，但增加延遲時間會延長分析時間。通常在實驗測定核弛豫時間（T1）的基礎(chǔ)上，選擇5倍T1或稍長的時間作為延遲時間。

3.2.3 13C-NMR譜定量峰的選擇 根據(jù)圖4中乙烯基碳的歸屬，在實際油樣中選擇δ=129.683 ppm（即圖4中的G）和δ=129.657 ppm（即圖4中的H）分別作為sn-1，3位油酸和sn-2位油酸的定量峰;δ=130.145 ppm（即圖4中的A）和δ=130.139 ppm（即圖4中的B）分別作為sn-2位亞油酸和sn-1，3位亞油酸的定量峰;除了大豆油中可以觀察到亞麻酸sn-1，3和sn-2的位置特征峰，在其它3種食用油幾乎觀察不到亞麻酸的特征峰，因此，只對大豆油油中亞麻酸進(jìn)行定量分析，δ=127.775 ppm（即圖4中的Q）和δ=127.758 ppm（即圖4中的R）分別作為sn-2位亞麻酸和sn-1，3位亞麻酸的定量峰。

根據(jù)圖5中對羰基碳的歸屬，選擇實際油樣中δ=173.262 ppm（圖5sn-1，3的O）和δ=172.887 ppm（即圖5中sn-2的O）分別作為sn-1，3位油酸和sn-2位油酸的定量峰;δ=173.253 ppm（即圖5中sn-1，3的L）和δ=172.947 ppm（即圖5中sn-2的L）分別作為sn-1，3位亞油酸和sn-2位亞油酸的定量峰;對于飽和脂肪酸，選擇δ=173.298 ppm（即圖5中sn-1，3的P）作為其定量峰，在sn-2位置幾乎檢測不到飽和脂肪酸，因此，只對sn-1，3位的飽和脂肪酸進(jìn)行定量分析。

3.2.4 13C-NMR譜的數(shù)據(jù)處理方式 當(dāng)譜圖中有峰重疊或受噪聲影響過大時，可以使用去卷積方法算出各峰的峰面積。NMR峰的理論形狀是由洛倫茲（Lorenz，L）方程給出的[42]。然而，由于場的不均勻性和加權(quán)函數(shù)可以產(chǎn)生部分高斯（Gauss，G）線形狀。洛倫茲線性適用于底部較寬，頂部較尖的峰形，而高斯線性適用于底部較窄、頂部較緩的峰形。從圖6可見，6B和6C是兩個互補的形狀，在某種程度上，大多數(shù)對稱的峰可用洛倫茲和高斯線性以適當(dāng)?shù)谋壤拼妗?/p>

本研究選擇直接普通積分和去卷積積分兩種積分方式對得到的碳譜譜圖進(jìn)行對比考察分析，其中，去卷積積分選擇純高斯、純洛倫茲以及洛倫茲和高斯線性不同比例（1∶4，2∶3，1∶1，3∶2，3∶1）進(jìn)行擬合。其中“普通積分”為選擇兩個波谷之間的部分進(jìn)行直接中切法（Midcut method）積分處理。

由圖6A（圖3中的A和B兩峰）可見，使用直接普通積分時，兩個相鄰峰的譜圖重疊以及基線都會對峰面積造成影響，無法準(zhǔn)確獲取該化學(xué)位移處峰的面積信息，引起最終的結(jié)果的偏差。

去卷積積分，對需要去卷積的部分進(jìn)行去卷積擬合，將得到的譜圖用Bruker Topspin軟件，Analysis菜單里的Line Ship Fitting→Lorenz/Gauss Deconvolution[dcon]功能處理，得到相應(yīng)的峰面積。本研究選用7種去卷積擬合方式進(jìn)行處理： 純洛倫茲（b）、純高斯（c）、洛倫茲∶高斯=1∶4（d）、2∶3（e）、1∶1（f）、3∶2（g）、3∶1（h），分析比較了去卷積結(jié)果，詳見電子版文后支持信息表S1（乙烯基區(qū)域）和表S2（羰基區(qū)域）。當(dāng)對譜圖直接進(jìn)行積分（中切法）時，得到的結(jié)果偏差較大。用純洛倫茲或純高斯進(jìn)行去卷積擬合時，計算出的結(jié)果區(qū)別較大，兩種峰去卷積擬合殘差較大，與氫譜測定的脂肪酸總量仍有較大的差別。采用洛倫茲和高斯以一定比例進(jìn)行去卷積擬合時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)洛倫茲∶高斯=3∶2時，擬合程度與原來的峰形最相似，且與氫譜測定的脂肪酸總量結(jié)果接近。 選擇洛倫茲∶高斯=3∶2進(jìn)行去卷積擬合提取。

對羰基區(qū)域的譜圖進(jìn)行同樣處理，區(qū)域擬合的結(jié)果與氫譜計算得到的脂肪酸含量結(jié)果（飽和脂肪酸（16.2%±1.2%，亞油酸51.5%±1.7%，油酸23.2%±1.5%）接近。從表3可知，該區(qū)域擬合的結(jié)果同表2的結(jié)果接近。

考察了在洛倫茲∶高斯=60∶40（40% L）附近其它的比例。對于乙烯基區(qū)域，當(dāng)洛倫茲∶高斯=62∶38（38% L）時，碳譜結(jié)果與氫譜最接近，對于羰基區(qū)域，洛倫茲∶高斯=58∶42（42% L）時，碳譜結(jié)果與氫譜最接近，考慮到整個圖譜的處理方法盡量一致，且在40% L附近不同比例的差異不大。 選擇以洛倫茲∶高斯=60∶40（40% L）的比例，同時用于去卷積計算乙烯基區(qū)域和羰基區(qū)域的峰面積。

大多數(shù)NMR峰可用洛倫茲和高斯以適當(dāng)?shù)谋壤?。本研究選用洛倫茲∶高斯=3∶2進(jìn)行去卷積擬合，對于不同的譜儀、儀器狀態(tài)、樣品，兩者之間的比例可能也有差別，故在對譜圖進(jìn)行去卷積擬合時，建議通過考察實驗數(shù)據(jù)選擇合適的比例。

3.2.5 檢出限（LOD） 根據(jù)中國藥典四部[35]通則（2015版）規(guī)定，基于能顯示基線噪聲的分析方法，可以以信噪比為3或2時的相應(yīng)濃度確定檢出限（LOD）。本研究以普通光譜分析信噪比S/N>3確定檢出限，選擇本研究中采用的定量峰，根據(jù)其信噪比計算檢出限，結(jié)果見表2。

對于qNMR，英國藥典[103]要求根據(jù)S/N≥150確定定量限。對于碳譜，達(dá)到此信噪比的要求較難。中國藥典四部[35]通則（2105版）中“9101 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則”以S/N=10時對應(yīng)濃度為方法的定量限（LOQ）。上述研究結(jié)果可滿足中國藥典的信噪比要求。但較低的信噪比會使精密度差一些。需要進(jìn)一步研究提高13C-qNMR信噪比和精密度的方法。本研究暫未對定量限做明確評價。

3.3 實際樣品分析

稱適量大豆油、玉米油和花生油樣品和內(nèi)標(biāo)苯甲酸，按2.2節(jié)的方法配制成待測樣品，用2.3節(jié)的方法測定。分析結(jié)果見表3，與3.1.3節(jié)中大豆油中脂肪酸的測定結(jié)果基本一致，說明NMR碳譜以內(nèi)標(biāo)法測定不同位置脂肪酸的結(jié)果可靠。

大豆油中亞油酸含量最多，且sn-1，3位亞油酸與sn-2位的亞油酸含量都高，其次是油酸，而亞麻酸含量較少，且這幾種脂肪酸多位于sn-1，3位，飽和脂肪酸只在sn-1，3位。玉米油中亞油酸含量較高，且sn-1，3位較sn-2位含量多，花生油中油酸最多。由食用油的1H-qNMR分析結(jié)果可知，玉米油和花生油中含有的亞麻酸較少，在碳譜中難以觀察到其特征峰，也難以測定其含量。而大豆油中的亞麻酸含量比較多，可采用13C-qNMR測定其含量。同時，在這幾種食用油中，不飽和脂肪酸在sn-1，3位和sn-2位都有分布，并且含量相差不大，而飽和脂肪酸則都位于sn-1，3位，未檢測到有sn-2位的飽和脂肪酸。

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