張嵐 李小琴 王光麗

摘?要?基于石墨相氮化碳（g-C3N4）在可見光（≥ 400 nm）照射下可激活辣根過氧化物酶（HRP），使HRP能夠催化氧化特征底物3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），設(shè)計(jì)了一種新型夾心型免疫傳感器，用于高靈敏檢測甲胎蛋白（AFP）。此夾心型免疫傳感器利用附著于微孔板上的一抗（Ab1）捕獲目標(biāo)物AFP，然后與HRP和二抗（Ab2）共同標(biāo)記的金納米顆粒（Ab2-AuNPs-HRP）反應(yīng)，并結(jié)合酰胺放大技術(shù)（TSA），增大表面固定的HRP的量，實(shí)現(xiàn)信號放大。加入g-C3N4后，在可見光照射下，HRP的活性被激發(fā)，TMB被氧化后的信號（即652 nm處的吸光度）與AFP的濃度在0.5 pg/mL～0.1 μg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢出限（LOD，S/N=3）為0.17 pg/mL。 本研究構(gòu)建的新型免疫傳感器具有靈敏度高、選擇性好、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際樣品測定中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞?石墨相氮化碳;辣根過氧化物酶;活化;免疫分析

1?引 言

天然酶具有活性高、選擇性和特異性好等優(yōu)勢，在生物分析中應(yīng)用廣泛。辣根過氧化物酶（HRP）是一種含亞鐵血紅素的蛋白質(zhì)，具有性質(zhì)穩(wěn)定、比活性高、分子量小、容易制備等優(yōu)點(diǎn)，在催化和分析檢測等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用。通常利用H2O2以及濃H2SO4進(jìn)行HRP活性的調(diào)控，由于使用了腐蝕性的化學(xué)試劑，因此操作不便，且對環(huán)境有污染。最近，利用納米材料調(diào)控天然酶活性的研究備受關(guān)注。Fruk等[1]發(fā)現(xiàn)紫外光照射的CdS量子點(diǎn)可引發(fā)HRP的催化活性，氧化其熒光底物（中性紅）;Kamda等[2，3]發(fā)現(xiàn)在紫外光或可見光激發(fā)下，鐵摻雜的鈦酸鹽及鉑摻雜的赤鐵礦固體薄膜可激發(fā)并調(diào)控HRP的活性。最近，本研究組[4，5]發(fā)現(xiàn)鄰苯二酚類化合物（如鄰苯二酚、多巴）與二氧化鈦納米粒子結(jié)合后，在可見光激發(fā)下，也可活化HRP，氧化其特征底物3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）。研究發(fā)現(xiàn)，在光照下，納米材料可產(chǎn)生多種活性成分，如超氧陰離子（O·2）、空穴（h+）和羥基自由基（·OH）等，進(jìn)而活化天然酶HRP，使其在無H2O2存在條件下也表現(xiàn)出較高的催化活性。利用光照后的納米材料調(diào)控HRP催化活性的體系，可方便地通過調(diào)控光照的有無實(shí)時(shí)調(diào)控酶活性。光激發(fā)納米材料為調(diào)控天然酶活性提供了一種簡單方便、無需加入破壞性化學(xué)試劑的新途徑。但是，已報(bào)道的可調(diào)控HRP活性的納米材料仍十分有限，部分納米材料本身有毒性，而且有的材料需在紫外光下激發(fā)，但紫外光本身會導(dǎo)致HRP失活。因此，能夠較好調(diào)控HRP活性的納米材料，尤其是對納米材料活化HRP體系的生物傳感應(yīng)用研究仍需進(jìn)一步探索。

石墨相氮化碳（g-C3N4）是一種生物相容性好、毒性低的無金屬半導(dǎo)體材料，具有優(yōu)異的熒光、光電轉(zhuǎn)換、光催化等性質(zhì)[6～8]。AFP是一種重要的臨床腫瘤標(biāo)志物，廣泛應(yīng)用于肝細(xì)胞肝癌和卵黃囊腫瘤的診斷，在胎兒缺陷和腫瘤（尤其是肝臟腫瘤）的臨床診斷中具有重要作用[9]。 本研究發(fā)現(xiàn)，在可見光照射下，所合成的g-C3N4納米片可活化HRP催化氧化底物TMB，產(chǎn)生較強(qiáng)的特征吸收信號。以甲胎蛋白（AFP）為模型物，在光照條件下，將g-C3N4納米片活化HRP與酰胺放大技術(shù)（TSA）結(jié)合，建立了一種比色檢測AFP的方法。研究結(jié)果表明，本方法具有簡單方便、檢測線性范圍寬、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

Hitachi S-4800掃描電子顯微鏡（日本Hitachi公司）;D8型X射線衍射儀（德國布魯克公司）;FT-IR 6700光譜儀（美國Thermo Fisher公司）;拉曼光譜儀（英國Renishaw公司）;TU-1901分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）;熒光分光光度計(jì)（美國Varian公司）;CELS5001350氙燈光源（北京中教金源科技有限公司）;酶標(biāo)儀（美國SpectraMax M5公司）;CHI 800C型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）。

癌胚抗原（CEA）、前列腺抗原（PSA）和甲胎蛋白（AFP）購自北京久峰潤達(dá)生物技術(shù)公司;超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和HRP購自美國Sigma-Aldrich公司;叔丁醇（TBA）、異丙醇（IPA）、乙二胺四乙酸（EDTA）、碘化鉀（KI）、3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、鼠來源AFP抗體對（一抗Ab1、二抗Ab2）、N-羥基丁二酰亞胺（NHS）、1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亞胺（EDC）、牛血清白蛋白（BSA）、N-2-羥乙基哌嗪-N'-（2-乙磺酸）、酪胺、吐溫-20、色氨酸（Trp）、丙氨酸（Ala）和人血清白蛋白（HSA）均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。血清樣本來源于江南大學(xué)校醫(yī)院。

2.2?g-C3N4納米片的合成

參照文獻(xiàn)[10]的方法，稱取10.0 g三聚氰胺（C3N6H6）置于陶瓷坩堝中，在馬弗爐中，以3℃/min加熱至550℃，保持2 h，得到黃色的固體產(chǎn)物。研磨后，稱取40 mg粉末于40 mL水中，超聲10 h，懸浮液以5000 r/min離心15 min，得到g-C3N4納米片。

2.3?g-C3N4光誘導(dǎo)活化HRP性質(zhì)的探究

2.3.1?g-C3N4光誘導(dǎo)活化HRP?取50 μL 200 μg/mL g-C3N4和一定濃度的HRP于200 μL HAc-NaAc緩沖溶液（0.4 mol/L，pH 3.0）中，超聲10 min，使g-C3N4分散。加入500 μmol/L TMB，用水稀釋至1.0 mL，溶液混合均勻后，放置于氙燈（≥ 400 nm）下照射15 min，測定652 nm處的吸光度。

2.3.2?g-C3N4光誘導(dǎo)活化HRP體系的催化動力學(xué)研究?在30℃下，將50 μL 200 μg/mL g-C3N4和100 μg/mL HRP加入200 μL HAc-NaAc緩沖溶液（0.4 mol/L，pH 3.0）中，再加入不同濃度的TMB溶液，用水稀釋至1.0 mL，混合均勻，以TMB為底物，基于米氏方程計(jì)算反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)。在可見光照射下，每隔1 min測量652 nm處的吸光度，研究反應(yīng)的動力學(xué)性質(zhì)。

2.4?基于光誘導(dǎo)g-C3N4活化HRP免疫檢測AFP

2.4.1?HRP/AuNPs/Ab2復(fù)合物的合成?參照文獻(xiàn)[11]的方法，采用檸檬酸三鈉還原HAuCl4合成金納米粒子（AuNPs）。將AFP二抗（Ab2）和HRP共同固定在AuNPs上，獲得HRP/AuNPs/Ab2復(fù)合物，合成步驟參照文獻(xiàn)[12]： （1）用0.1 mol/L Na2CO3調(diào)節(jié)AuNPs溶液至pH 8～9;（2）取40 μL 100 μg/mL Ab2和160 μL 100 μg/mL HRP加入到1.0 mL AuNPs（Ab2和HRP的濃度為最佳比例）中，混合溶液在4℃下孵育12 h;（3）將混合溶液以12000 r/min離心20 min，移除過量的Ab2和HRP，HRP/AuNPs/Ab2復(fù)合物超聲后，重新分散在1.0 mL PBS緩沖溶液（pH=7.4，含1.0%（w/w）BSA）中，于4℃避光儲存。

2.4.2?HRP/酪胺復(fù)合物的合成?參照文獻(xiàn)[12]的方法合成HRP/酪胺復(fù)合物： 將600 μL 1.0 mg/mL HRP加入1.5 mL HEPES緩沖溶液（50 mmol/L，pH 9.3）中，室溫超聲5 min;將混合物用3.0 mol/L HCl調(diào)節(jié)至pH 7.3，將15 mg NHS和20 mg EDC加入到上述溶液中，室溫?cái)嚢?5 min;將600 μL 5.0 mg/mL 酪胺溶液逐滴滴加到上述溶液，得到的混合溶液在室溫下攪拌12 h;將混合溶液離心10 min，用蒸餾水洗滌兩次，得到HRP/酪胺復(fù)合物;將其超聲分散到500 μL PBS緩沖溶液（0.1 mol/L，pH 7.4）中，于4℃避光儲存。

2.4.3?比色法檢測AFP?具體步驟如下： （1）20 μL 0.1 mg/mL AFP一抗（Ab1）加入到96微孔板中，在4℃條件下過夜，用洗滌液洗滌未吸附在微孔板上的Ab1，室溫下加入20 μL 封閉液，靜置2 h，封閉非特異性吸附位點(diǎn)，再用洗滌液洗滌;（2）20 μL不同濃度的AFP抗原加入微孔板中，室溫下孵育1 h后洗滌;（3）20 μL HRP/AuNPs/Ab2復(fù)合物加入到上述溶液中，室溫下孵育1 h后，洗滌;（4）室溫下，依次將H2O2（5 μL，2 mmol/L）和酪胺/HRP復(fù)合物（10 μL）加入微孔板中，放置1 h后，洗滌;（5）將20 μL 10 μg/mL g-C3N4、100 μL醋酸緩沖溶液（0.4 mol/L，pH 3.0）和20 μL 500 μmol/L TMB加入微孔板中，置于氙燈（≥ 400 nm）下照射15 min，測定652 nm處的吸光度數(shù)值。

3?結(jié)果與討論

3.1?g-C3N4的表征

由圖1A可知，g-C3N4具有石墨烯類似結(jié)構(gòu)和不規(guī)則折疊狀片層結(jié)構(gòu)，尺寸約為1.5～2.5 μm。所合成的g-C3N4有兩個(gè)明顯的吸收峰，在（002）方向上，27.7°處的強(qiáng)峰為g-C3N4結(jié)構(gòu)中石墨層間堆積吸收峰;在（100）方向上，13.02°處的弱衍射峰為周期性的平面結(jié)構(gòu)衍射峰[13]。與大塊g-C3N4相比[10]，27.5°處的衍射峰強(qiáng)移動到27.7°，表明納米層狀結(jié)構(gòu)合成成功;13.02°處的峰變?nèi)?，表明石墨層的平面尺寸變小（圖1B）。如紅外光譜（FT-IR）（圖1C）所示，在3000和3600 cm1處的寬吸收峰為NH和OH的伸縮振動峰，1000和1800 cm1處的吸收峰為CN雜環(huán)的伸縮振動峰，811 cm1處的吸收峰為三嗪環(huán)振動峰。由于g-C3N4表面富含OH、NH等親水基團(tuán)，使其具有良好的水溶性。圖1D為g-C3N4的紫外-可見吸收光譜，在測試條件下，由于濃度較小，可見光區(qū)吸收不明顯。在785 nm激發(fā)光下，g-C3N4在702和1231 cm1有典型的拉曼峰（圖1E）。量子局限效應(yīng)使得導(dǎo)帶和價(jià)帶向相反的方向移動[14]，導(dǎo)致熒光發(fā)射峰由大塊g-C3N4的449 nm[15]藍(lán)移至440 nm（圖1F）。所制備的g-C3N4具有熒光性質(zhì)，說明其具有光誘導(dǎo)電子激發(fā)/轉(zhuǎn)移特性，具有光活性。

3.2?可見光照射g-C3N4活化HRP及其機(jī)理

在沒有H2O2的條件下，g-C3N4經(jīng)可見光照射可活化HRP。如圖2所示，通過對比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不光照的g-C3N4或光照條件下的HRP，均不能明顯地氧化TMB;而光照下的g-C3N4對TMB的氧化效果也較弱;只有光照條件下g-C3N4和HRP的混合物才能催化氧化TMB，使溶液變成藍(lán)色。研究發(fā)現(xiàn)，納米材料可產(chǎn)生多種活性中間體[4，5]（如·OH、H2O2、O·2和h+等）活化HRP。據(jù)此推斷，在可見光照射下，g-C3N4通過產(chǎn)生某些活性中間體活化HRP，使其表現(xiàn)出催化氧化TMB的效果。

為進(jìn)一步闡明光照條件下g-C3N4活化HRP的機(jī)制，本研究引入了活性中間體的捕獲劑，探究各種活性物質(zhì)對體系催化氧化活性的影響。例如，叔丁醇（TBA）和異丙醇（IPA）可捕獲·OH[16]，乙二胺四乙酸（EDTA）和KI可捕獲h+ [17]，超氧化物歧化酶（SOD）可捕獲O·2[18]，過氧化氫酶（CAT）可催化分解H2O2生成水和氧氣。如圖3A所示，與不含捕獲劑相比，加入KI和SOD清除劑后，催化反應(yīng)被抑制，可知h+和O·2是主要的活性成分。由光電化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，g-C3N4具有光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移特性，在可見光開/關(guān)循環(huán)照射下，可產(chǎn)生光電流（圖3B）。通過線性掃描測得g-C3N4的導(dǎo)帶電位為1.13 V（相對于飽和Ag/AgCl，圖3C），此電位比氧氣的還原電位（0.046 V vs NHE[19]）更負(fù)。因此，可見光照射g-C3N4半導(dǎo)體，使得光生電子由價(jià)帶躍遷至導(dǎo)帶，導(dǎo)帶上的電子還原溶解氧，產(chǎn)生O·2，進(jìn)而活化HRP;而價(jià)帶產(chǎn)生的h+可直接氧化HRP，將其轉(zhuǎn)化為活化狀態(tài)，進(jìn)而氧化底物TMB[2]。

通過光照的有無可調(diào)控g-C3N4/HRP的催化活性。如圖3D所示，在光照條件下，oxTMB的吸光度明顯增加;在無光照時(shí)，吸光度變化較小。停止光照射后，酶催化反應(yīng)在很大程度上被抑制，這可能是活性中間體（O·2 和 h+）在酸性環(huán)境中壽命短[2]所致。相對于常規(guī)HRP體系通過加入濃H2SO4引起酶的變性以終止酶催化反應(yīng)，本研究體系通過打開或關(guān)閉可見光源即可方便地調(diào)控HRP的活性。

考察了g-C3N4活化HRP的實(shí)驗(yàn)中，光照時(shí)間和HRP的濃度對催化效果的影響。如圖4A所示，g-C3N4/HRP起始反應(yīng)速率較快，隨著光照時(shí)間延長，反應(yīng)趨于平衡;如圖4B所示，固定g-C3N4的量，g-C3N4/HRP催化氧化TMB的效果隨著HRP量的增加而增強(qiáng)，表明體系的氧化能力與HRP的量有直接關(guān)系。

反應(yīng)體系的pH值和反應(yīng)溫度都會影響g-C3N4/HRP的催化活性。由圖5可知，g-C3N4/HRP催化體系的最適pH值和溫度分別為pH 3.0和30℃。而常規(guī)HRP催化體系（以H2O2為活性激發(fā)物質(zhì)）的最優(yōu)pH值和溫度分別為pH 3.0和40℃。

進(jìn)一步探究了g -C3N4/HRP體系的催化動力學(xué)特征。動力學(xué)參數(shù)由米氏方程的雙倒數(shù)曲線υ= Vmax[S]/Km+[S]獲得（其中，υ代表催化反應(yīng)的初始速率，υmax代表最大反應(yīng)速率，[S]和Km分別代表底物濃度和米氏常數(shù)）。如圖6所示，計(jì)算得g-C3N4/HRP體系的Km=100 μmol/L，比HRP的Km（434.0 μmol/L[20]）小，表明g-C3N4/HRP對底物TMB的親和力比HRP（以H2O2為活性激發(fā)物質(zhì)）高。

3.3?基于g-C3N4活化HRP的免疫分析方法檢測AFP

基于光照條件下g-C3N4可活化HRP，并利用TSA 技術(shù)[21]增大表面所固定的信號分子HRP的量，實(shí)現(xiàn)了AFP的檢測，原理如圖7所示，此夾心型免疫傳感器利用附著于96孔板的一抗（Ab1）捕獲目標(biāo)物AFP，然后添加表面固定了二抗（Ab2）與HRP的金納米粒子（即Ab2-AuNPs-HRP復(fù)合物），并通過酪胺和HRP的結(jié)合作用繼續(xù)捕獲合成的HRP-酪胺重復(fù)單元[21]，實(shí)現(xiàn)信號放大。在可見光照射下，加入的g-C3N4激發(fā)HRP活性，催化氧化特征底物TMB產(chǎn)生檢測信號。通過實(shí)驗(yàn)可驗(yàn)證由TSA技術(shù)形成的HRP-酪胺重復(fù)單元可放大檢測信號。如圖8所示，無TSA時(shí)，檢測信號低;有TSA時(shí)，檢測信號增強(qiáng)。兩者存在明顯差別，說明形成的HRP-酪胺重復(fù)單元可放大檢測信號。

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，對所建立的新型免疫傳感器檢測AFP的性能進(jìn)行了研究。由圖9可知，體系的吸光度值與目標(biāo)物AFP濃度的對數(shù)之間存在線性關(guān)系，線性范圍為0.5 pg/mL～0.1 μg/mL，線性方程為y=0.071x（ng/mL）+0.277，R2=0.995，檢出限為0.17 pg/mL （S/N=3）。與報(bào)道的AFP檢測方法（表1）對比可知，本方法的檢出限較低，具有較高的靈敏度。

選擇了一些陽離子（如K+、Na+、Zn2+、Mg2+、Ca2+）及與AFP性質(zhì)相似的干擾物質(zhì)（如人血清白蛋白（HSA）、色氨酸（Trp）、丙氨酸（Ala）、免疫球蛋白（人IgG、鼠IgG）、癌胚抗原（CEA）、前列腺抗原（PSA）），考察了本方法的選擇性。 如圖10所示，在相同的測定條件下，干擾物只產(chǎn)生較小的吸光度變化，表明本方法具有較好的選擇性。

3.4?人血清中AFP的檢測

將本方法應(yīng)用于人血清樣品中AFP的檢測，結(jié)果如表2所示。測得人血清樣品中AFP的含量為1.58 ng/mL，不同水平AFP的加標(biāo)回收率為94.3%～101.3%，表明本方法可用于實(shí)際血清樣品中AFP的檢測。

4?結(jié) 論

在可見光照射下，g-C3N4納米片可活化HRP，使HRP在沒有H2O2存在時(shí)催化氧化TMB。基于此原理，結(jié)合TSA技術(shù)，本研究建立了比色法檢測AFP的新型免疫分析方法，實(shí)現(xiàn)了AFP的超靈敏檢測。

References

1?Fruk L，Rajendran V，Spengler M，Niemeyer C. ChemBioChem，2007，8（18）： 2195-2198

2?Kamada K，Nakamura T，Tsukahara S. Chem. Mater.，2011，23（11）： 2968-2972

3?Kamada K，Moriyasu A，Soh N. J. Phys. Chem. C，2012，116（39）： 20694-20699

4?Wang G L，Li X Q，Cao G X，Yuan F，Dong Y M，Li Z J. Chem. Commun.，2017，53（81）： 11165-11168

5?Li P，Cao G X，Liu Q Y，Guo Y Y，Dong Y M，Li Z J. Sens. Actuators B，2018，262： 110-117

6?Zhang X L，Zheng C，Guo S S，Li J，Yang H H，Chen G N. Anal. Chem.，2014，86（7）： 3426-3434

7?Akhundi A，Habibi A，Yangjeh A. Mater. Chem. Phys.，2016，174： 59-69

8?Wang X，Maeda K，Thomas A，Takanabe K，Xin G，Carlsson J M，Domen K，Antonietti M. Nat. Mater.，?2009，8： 76-80

9?CHANG Bin-Xia，XIN Shao-Jie. World Chinese Journal of Digestology，2010，18（6）： 576-580

常彬霞，辛紹杰. 世界華人消化雜志，2010，18（6）： 576-580

10?Zhang X，Xie X，Wang H，Zhang J J，Pan B C，Xie Y. J. Am. Chem. Soc.，2013，135（1）： 18-21

11?Hu X L，Wu X M，F(xiàn)ang X，Wang G L，Li Z J. Biosens. Bioelectron.，2016，77： 666-672

12?Hou L，Tang Y，Xu M D，Gao Z Q，Tang D P. Anal. Chem.，2014，86（16）： 8352-8358

13?Rong M，Lin L，Song X H，Zhao T T，Zhong Y X，Yan J W，Wang Y R，Chen X. Anal. Chem.，2015，87（2）： 1288-1296

14?Zhang S W，Li J X，Zeng M Y，Xu J Z，Wang X K，Hu W P. Nanoscale，2014，6（8）： 4157-4162

15?Gao J T，Wang Y，Zhou S J，Lin W，Kong Y. ChemCatChem，?2017，9（9）： 1708-1715

16?Wang G L，Xu X F，Wu X M，Cao G X，Dong Y M，Li Z J. J. Phys. Chem. C，2014，118（48）： 28109-28117

17?Cao J，Xu B Y，Luo B D，Lin H L，Chen S F. Appl. Surf. Sci.，2011，257（16）： 7083-7089

18?Wang G L，Xu X F，Qiu L，Dong Y M，Li Z J，Zhang C. ACS Appl. Mater. Interfaces，2014，6（9）： 6434-6442

19?Kamegawa T，Seto H，Matsuura S，Yamashita H. ACS Appl. Mater. Interfaces，2012，4（12）： 6635-6639

20?Wang X，Mao W，Zhang J. J. Colloid Interface Sci.，2015，448： 17-23

21?Zaidi A U，Enomoto H，Milbrandt J，Roth K A. J. Histochem. Cytochem.，2000，48（10）： 1369-1375

22?Liang G D，Liu S F，Zou G Z，Zhang X L. Anal. Chem.，2012，84（24）： 10645-10649

23?Du D，Zou Z X，Shin Y S，Wang J，Wu H，Engelhard M H，Liu J，Aksay I A，Lin Y H. Anal. Chem.，2010，82（7）： 2989-2995

24?Zhang J，Wang S，Liu K P，Wei Y，Wang X，Duan Y X. Anal. Chem.，2015，87（5）： 2959-2965

25?Tawa K，Kondo F，Sasakawa C，Nagae K，Nakamura Y，Nozaki A，Kaya T. Anal. Chem.，2015，87（7）： 3871-3876

26?Peng M P，Ma W，Long Y T. Anal. Chem.，2015，87（12）： 5891-5896