胡獻麗 朱琳嶺 李苓菱 徐志愛 張文

摘?要?基于Small interfering RNA（siRNA）的RNA干擾（RNA interference，RNAi）策略已經(jīng)成為生物醫(yī)學研究的常規(guī)手段，而通常采用的基于聚陽離子或陽離子磷脂的siRNA遞送系統(tǒng)遞送效率低、細胞毒性高，而且缺少示蹤功能，嚴重制約了siRNA藥物臨床轉(zhuǎn)化。為克服傳統(tǒng)siRNA遞送載體的不足，本研究發(fā)展了一種新型siRNA熒光納米遞送系統(tǒng)。首先利用牛血清白蛋白為模板，通過生物礦化策略合成具有近紅外熒光發(fā)射的金納米簇（Gold nanocluster，GN），利用乙二胺（Ethylenediamine，EDA）或N，N-二甲基乙二胺（N，N'-Dimethylethylenediamine，DMA）對GN進行共價修飾，得到陽離子化金納米簇（Cationic gold nanocluster，CGN），同時實現(xiàn)siRNA高效遞送和熒光示蹤。然后，以表達綠色熒光蛋白（Green fluorescence protein，GFP）的肺癌A549細胞（A549-GFP）為細胞模型，驗證了CGN可實現(xiàn)siRNA高效遞送，并沉默A549-GFP細胞的GFP表達;進一步利用共聚焦激光掃描顯微鏡實現(xiàn)了GN細胞分布的熒光示蹤。本研究結果表明，CGN有望用作siRNA遞送載體和示蹤探針。

關鍵詞?siRNA;金納米簇;陽離子化;熒光示蹤;遞送載體

1?引 言

Small interfering RNA（siRNA）是具有21～25個核苷酸序列的短鏈RNA?；趕iRNA的RNA干擾技術（RNA interference，RNAi）可特異性降解信使RNA（Messenger RNA，mRNA），沉默目標基因的蛋白表達，已在生物醫(yī)學基礎研究和疾病治療方面發(fā)揮了重要作用[1～4]，針對RNA干擾機制的基礎研究獲得了2006年諾貝爾生理或醫(yī)學獎。近年來，針對杜氏肌營養(yǎng)不良癥、脊髓性肌萎縮癥和遺傳性轉(zhuǎn)甲腺素蛋白淀粉樣變性等疾病的siRNA藥物已陸續(xù)獲準上市[5，6]。盡管siRNA藥物已取得較大進展，但由于其具有較大分子量，而且?guī)в胸撾姾?，不能主動跨越細胞膜進入細胞內(nèi)，siRNA藥物的高效遞送仍是制約siRNA藥物臨床轉(zhuǎn)化的主要瓶頸[7，8]。

非病毒陽離子載體（主要包括陽離子聚合物和陽離子脂質(zhì)體）可通過靜電相互作用，與負電性siRNA形成納米級復合物，實現(xiàn)siRNA的細胞及活體高效遞送[9～11]。但是，常規(guī)陽離子載體通常缺乏成像功能，不便于監(jiān)控siRNA在細胞及體內(nèi)的轉(zhuǎn)染過程。 開發(fā)具有成像功能的siRNA遞送系統(tǒng)備受關注[12，13]。在各種成像方式中，利用熒光探針的光學成像方式具有背景干擾小、 空間分辨率高、 可避免電離輻射等優(yōu)點，是生物成像應用的優(yōu)先選擇。 通常使用的有機小分子熒光探針可標記遞送載體，但有機小分子染料光穩(wěn)定性較差，易光漂白，限制了其廣泛應用[14～16]。半導體量子點的熒光量子產(chǎn)率高于傳統(tǒng)有機熒光染料，而且具有更好的光穩(wěn)定性及更窄的熒光發(fā)射光譜，已被用于siRNA胞內(nèi)遞送及熒光成像。然而，量子點因為生物降解性差而導致的生物安全性問題，嚴重制約了其生物醫(yī)學轉(zhuǎn)化[17～20]。隨著量子局限團簇技術的發(fā)展，科研人員開始開發(fā)基于貴金屬的納米團簇（Metal nanocluster，MN）。MN具有粒子尺寸小、熒光壽命長、穩(wěn)定性好及毒性低等優(yōu)點，已被廣泛用于生物成像探針方面的研究[21～23]。其中，熒光金納米簇（Gold nanocluster，GN）由于熒光性能獨特、化學穩(wěn)定性高、生物相容性好，在疾病標志物及特異性信號分子的熒光檢測方面具有良好的應用前景[24～26]。在GN的制備方法中，以蛋白質(zhì)為模板材料，利用仿生礦化策略合成的GN既能留了蛋白質(zhì)模板的三維結構，又能在較寬的pH范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。目前，基于牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）、胰蛋白酶、胰島素、溶菌酶合成的GN已廣泛用于細胞核靶向、癌細胞成像及離子傳感等多個方面[27～32]，但是，由于以蛋白質(zhì)為模板合成的GN通常帶負電，難以負載siRNA，所以GN用于siRNA遞送方面的應用鮮見報道[33]。

本研究以BSA為模板，合成了具有近紅外熒光發(fā)射特性的GN，并通過共價作用進行陽離子修飾，獲得的熒光陽離子化金納米簇（Cationic gold nanocluster，CGN）用于siRNA高效遞送及熒光示蹤。在中性條件下，siRNA帶負電，可通過靜電相互作用吸附在CGN表面，形成納米復合物。此納米復合物經(jīng)細胞攝取后進入酸性內(nèi)涵體，CGN利用“質(zhì)子海綿”效應[34～37]使內(nèi)涵體破裂并釋放siRNA，實現(xiàn)siRNA的胞漿遞送，并高效沉默目標基因。以穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白（Green fluorescence protein，GFP）的A549肺癌細胞（A549-GFP）為細胞模型，證實了CGN可將siRNA高效輸送至A549-GFP細胞中，并有效抑制GFP表達;同時，利用CGN的熒光成像功能考察了siRNA/CGN納米復合物在細胞內(nèi)的分布行為。初步研究結果表明，CGN有望用于siRNA胞內(nèi)遞送和熒光示蹤。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Cary 60紫外-可見光譜儀、Cary Eclipse熒光光譜儀（美國Agilent公司）;Omniflex飛行時間質(zhì)譜（Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS，德國Bruker公司）;熱重分析儀（Thermal gravimetric analyzer，TGA，日本Shimadzu公司）;NanoSizer動態(tài)光散射儀（Dynamic light scattering，DLS，英國Malvern公司）;Fluoview FV-1000共聚焦激光掃描顯微鏡（Confocal laser scanning microscopy，CLSM，日本Olympus公司）;凝膠成像儀（Chemi Doc MP System，美國Bio-Rad公司）;JEM-2100F透射電子顯微鏡（Transmission electron microscopy，TEM，日本電子株式會社）。

BSA、乙二胺（Ethylenediamine，EDA）、N，N-二甲基乙二胺（N，N'-Dimethylethylenediamine，DMA）、1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（1-[3-（Dimethylamino）propyl]-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC·HCl）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-Hydroxysuccinimide，NHS）、氯金酸（Chloroauric acid，HAuCl4）和3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（3-（4，5-Dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT，Sigma-Aldrich公司）;Lipo-2000、Hoechst 33342、Lysotracker green和Gibco胎牛血清（Thermo Fisher Scientific公司）;透析袋（截留分子量3.0 kDa，Spectrum Laboratories 公司）;其它化學試劑均為分析純試劑，購于國藥集團化學試劑有限公司。所有的玻璃儀器使用前均用濃HCl-濃HNO3（3∶1，V/V）洗凈，然后用乙醇和超純水沖洗。siRNA-GFP、siRNA-NC及siRNA-NC-Cy3序列購于Takara生物工程有限公司（大連）。

siRNA序列如下： siRNA-GFP： 5'-GGC TAC GTC CAG GAG CGC ACC-3';siRNA-NC： 5'-CGG UGA GCC AGG CGU GCA AUU-3'。

2.2?GN的合成

參照文獻[27]的方法合成GN，具體過程如下：在37℃恒溫和劇烈攪拌（900～1000 r/min）下，向5 mL BSA溶液（50 mg/mL）中，迅速加入5 mL HAuCl4溶液（10 mmol/L），反應2 min后，快速加入0.5 mL NaOH溶液（1.0 mol/L），在37℃下攪拌（900～1000 r/min）12 h，最終得到棕色的GN膠體溶液。

2.3?GN的陽離子化修飾

將EDA（0.65 mL，10 mmol）或DMA（0.65 mL，10 mmol）溶液用6.0 mol/L HCl調(diào)節(jié)至pH 4.8，然后加入新制備的GN，并加入18.1 mg EDC/11.0 mg NHS（94 μmol），室溫攪拌2 h。然后，溶液用醋酸緩沖液調(diào)節(jié)至pH 4.75，用5 μm 的濾膜過濾反應液，接著用截留分子量為30 kDa的離心超濾管離心（5000 g，30 min，15℃）除去未反應物質(zhì)，最后，用去離子水透析純化。純化后的溶液冷凍干燥，得到棕色固體即為DA或DMA共價修飾的CGN。

2.4?電泳分析

利用瓊脂糖凝膠電泳遷移法檢測CGN負載siRNA能力。使用TAE緩沖液（40 mmol/L Tris-acetate，1.0 mmol/L EDTA，pH 8.0）制備1.0%（w/V）瓊脂糖膠，300 ng siRNA分別與不同濃度的GN混合，外加80 V電壓作用20 min，然后進行凝膠成像。

2.5?細胞培養(yǎng)

A549非小細胞肺癌細胞從中國科學院上海細胞庫獲得。采用慢病毒載體轉(zhuǎn)染方式構建GFP穩(wěn)定表達的A549穩(wěn)轉(zhuǎn)株（A549-GFP）[38]。A549和A549-GFP細胞使用含有10%胎牛血清、100 μg/mL硫酸鏈霉素和100 U/mL 青霉素鈉的DMEM高糖細胞培養(yǎng)基，在37℃恒溫、 5%CO2的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.6?體外細胞毒性評價

將A549細胞以3.5 × 103細胞/孔的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加100 μL培養(yǎng)基。孵育24 h后，加入不同質(zhì)量濃度的GN或CGN，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，利用MTT法測定細胞存活率。

2.7?siRNA轉(zhuǎn)染實驗及GN的細胞分布

將A549-GFP細胞置于24孔細胞培養(yǎng)板孔內(nèi)的10 mm2 蓋玻片上培養(yǎng)，密度為5.0 × 104細胞/孔，經(jīng)過24 h預培育后，加入負載了siRNA-GFP的CGN（siRNA/CGN質(zhì)量比為1∶20，siRNA濃度為1.0 μg/mL），并以混合相同含量siRNA的商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑Lipo-2000混合物作為對照，Lipo-2000用量參照使用說明。繼續(xù)孵育48 h，培養(yǎng)好的細胞先用PBS清洗，然后用4%（V/V）多聚甲醛固定。使用共聚焦激光掃描顯微鏡進行細胞成像，計算A549-GFP細胞的GFP沉默效率。

為了考察GN和siRNA的胞內(nèi)分布行為，將A549細胞以5.0 × 104細胞/孔的密度在24孔細胞培養(yǎng)板孔內(nèi)的10 mm2 蓋玻片上培養(yǎng)。經(jīng)過24 h預培育后，加入負載Cy3-siRNA-NC的CGN（siRNA/CGN質(zhì)量比為1∶20），siRNA濃度為1.0 μg/mL。繼續(xù)孵育12 h后，用Hoechst-33342和Lysotracker-Green （DND-26，75 nmol）染色30 min。培養(yǎng)好的細胞先用PBS清洗，然后用4%（V/V）多聚甲醛固定。用共聚焦激光掃描顯微鏡進行細胞成像。濾光片設置Hoechst-33342 （Ex=360 nm，Em=450 nm）、Lysotracker-Green （Ex= 488 nm，Em= 515 nm）、CGN （Ex= 360 nm，Em= 675 nm （far-red））和Cy3 （Ex=543 nm，Em= 595 nm）。

3?結果與討論

3.1?CGN復合物的合成及siRNA負載原理

蛋白質(zhì)保護的GN生物相容性良好，熒光性質(zhì)穩(wěn)定，熒光發(fā)射波長可調(diào)，而且可發(fā)射近紅外熒光[39，40]。基于此，本研究利用BSA生物礦化合成的GN進行陽離子化修飾，并用作siRNA的

遞送載體。陽離子化的GN（DMA/EDA-GN）的制備過程及對siRNA的遞送原理如圖1所示。在堿性條件下，以BSA為模板時，HAuCl4被還原，合成可發(fā)射近紅外熒光的GN[27]。在EDC/NHS的活化作用下，EDA或DMA能與GN表面BSA上的谷氨酸等殘基反應，使BSA-GN陽離子化。siRNA呈負電性，即可通過靜電作用吸附在CGN表面，從而實現(xiàn)對siRNA的有效負載。負載了siRNA的納米復合物進入細胞后，細胞內(nèi)的酸性pH環(huán)境使EDA或DMA上的胺基質(zhì)子化，產(chǎn)生“質(zhì)子海綿”效應[34～37]，破環(huán)內(nèi)涵體，釋放siRNA，有效沉默靶基因。

3.2?DMA/EDA-GN復合物的表征

3.2.1?吸收及熒光光譜表征?首先對合成的GN和CGN進行吸收及熒光光譜表征。如圖2A所示，BSA在400～800 nm的波長區(qū)間內(nèi)無明顯吸收峰，并在480 nm光激發(fā)下不發(fā)射熒光。本研究中，BSA同時作為模板和保護劑，合成的GN在480 nm附近出現(xiàn)特征吸收峰，且在480 nm光激發(fā)下，650 nm波長附近出現(xiàn)較強的熒光發(fā)射，800 nm附近仍有熒光，證明成功制備出了近紅外GN。而GN經(jīng)陽離子化后，其吸收光譜保持不變，480 nm光激發(fā)時仍然有較強的熒光，最大熒光發(fā)射波長略有紅移（圖2B）。

3.2.2?MALDI-TOF 質(zhì)譜及熱重（TGA）分析

采用MALDI-TOF質(zhì)譜分析了DMA/EDA-GN納米復合物的組成。由圖3A可知，BSA的分子量為65.0 kDa。經(jīng)過生物礦化合成GN后，GN的分子量變?yōu)?7955 Da，數(shù)值增加了2955 Da，根據(jù)文獻[27，41]的方法計算可得BSA包裹金原子的數(shù)量為15。共價修飾DMA后，納米復合物質(zhì)量增加至70500 Da，由此計算得GN上DMA的連接數(shù)量為37，同樣地，可分析出EDA的連接數(shù)為38。進一步利用熱TGA法分析DMA/EDA-GN納米復合物的組成。金原子化學性質(zhì)穩(wěn)定，耐高溫，因此，當DMA/EDA-GN納米復合物經(jīng)600℃高溫處理后，有機組分DMA、EDA和BSA均被高溫分解，最終剩余物質(zhì)為金。熱重分析結果（圖3B）顯示，GN的熱降解率為90%，DMA/EDA-GN的熱降解率約為95%，與質(zhì)譜分析結果一致。

3.2.3?DLS和TEM表征?本研究合成的GN為穩(wěn)定的淡棕色溶液，通過DLS考察了其陽離子化前后納米復合物的尺寸。如圖4A所示，溶液條件下的GN粒徑約為8 nm，分散較為均勻，經(jīng)過DMA/EDA修飾的CGN粒徑略微增大，約為10 nm，沒有發(fā)生明顯團聚。從TEM圖（圖4B）可知，修飾后的GN仍為均勻分散的球形，表明陽離子化過程不影響GN的形貌。3種GN長時間放置后仍保持穩(wěn)定。

3.2.4?Zeta電位及電泳分析?進一步利用Zeta電位分析儀考察了DMA/EDA-GN納米

復合物修飾前后的電位變化。由于BSA在中性條件下帶負電，BSA合成的GN表面也呈負電性，測得Zeta電位值為（19.8 ± 1.7） mV。經(jīng)過DMA/EDA修飾后，表面電位發(fā)生了很大變化：由負電性反轉(zhuǎn)為正電性，分別變?yōu)椋?0.9 ± 1.5） mV和（28.9 ± 0.9） mV，復合物表面帶正電，說明DMA和EDA的成功修飾。因此，帶正電的納米復合物表面可成功負載帶負電的siRNA。通過凝膠電泳考察了CGN負載siRNA的能力。

由圖5可知，帶負電的GN難以負載siRNA，即使將GN與siRNA的質(zhì)量比增加至60∶1，也無法負載siRNA，阻止siRNA遷移。然而，將GN陽離子化修飾后，基于正負電荷的較強靜電作用，CGN和siRNA在質(zhì)量比為10∶1時，便可有效負載siRNA，當CGN/siRNA的質(zhì)量比增加至60∶1時，CGN可完全阻止siRNA遷移。電泳實驗表明，DMA/EDA-GN可有效負載siRNA，有望用于siRNA遞送。

3.2.5?細胞毒性分析?siRNA遞送載體的細胞毒性對其臨床應用至關重要。將A549肺癌細胞分別與GN、EDA-GN和DMA-GN孵育24 h，采用MTT法評價GN的細胞毒性，結果如圖6所示。GN具有良好的生物相容性，在濃度為250 g/mL時，細胞仍然保持80%的代謝活力。修飾EDA/DMA后，EDA-GN和DMA-GN組的細胞存活率約下降10%，陽離子化修飾并未顯著增大GN的細胞毒性。

3.3?細胞對siRNA/CGN復合物的攝取及分布研究

細胞實驗中，選取野生型A549細胞為模型，使用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）研究siRNA/CGN納米復合物的細胞攝取及分布行為。采用Cy3標記的siRNA-NC對siRNA進行定位，使用細胞核染色劑Hoechst 33342對細胞核進行定位。首先考察siRNA和GN在細胞內(nèi)的分布，如圖7A所示，在A549細胞中可同時發(fā)現(xiàn)Cy3的熒光信號和DMA-GN的熒光信號，且兩者存在共定位，表明細胞成功攝取了siRNA/CGN納米復合物。為了證實細胞對siRNA的攝取，使用Hoechst 33342對細胞核進行定位。如圖7B所示，Cy3-siRNA和CGN分布在細胞核周圍，進一步表明CGN可實現(xiàn)對siRNA的有效胞內(nèi)遞送。另外，研究表明，非病毒載體成功遞送siRNA的瓶頸在于能否實現(xiàn)內(nèi)涵體逃逸。如負載的siRNA不能從內(nèi)涵體中及時釋放，將被轉(zhuǎn)運到溶酶體，并被溶酶體內(nèi)的酶降解，失去活性[42，43]。為了證實CGN載送的siRNA可實現(xiàn)內(nèi)涵體逃逸，進一步利用Lysotracker green對溶酶體進行定位。游離Cy3-siRNA和A549細胞共孵育后，細胞內(nèi)未觀察到Cy3紅色熒光，表明游離siRNA無法進入細胞。相反，DMA-GN可將siRNA高效遞送到細胞內(nèi)。特別是DMA-GN組的Cy3和Lysotracker green的熒光信號呈分離狀態(tài)，表明siRNA可從內(nèi)涵體逃逸到胞漿，避免溶酶體降解（圖7C和7D）。

3.4?GFP基因沉默研究

以A549-GFP細胞為細胞模型，考察了DMA-GN和 EDA-GN的基因轉(zhuǎn)染效率。siRNA-GFP可有效抑制GFP基因表達，將siRNA-GFP/CGN納米復合物與A549-GFP 肺癌細胞共孵育，通過GFP基因表達研究其基因沉默效率。如圖8所示，未處理細胞組中的所有細胞均可觀察到綠色熒光表達。商品化轉(zhuǎn)染試劑Lipo-2000組可高效遞送siRNA，使得GFP陽性率約下降50%。但是，Lipo-2000處理組細胞數(shù)量顯著減少，且細胞呈圓球狀，表明Lipo-2000對細胞有毒副作用。使用與Lipo-2000組同等劑量的siRNA，siRNA-GFP/EDA-GN或siRNA-GFP/DMA-GN組的GFP蛋白陽性率分別下降到42.0%±5.0%和28.7%±2.5%。DMA-GN組的GFP沉默效率約為Lipo-2000陽性對照組的2倍，但細胞數(shù)目較多，而且狀態(tài)與未處理組相近，表明CGN不僅細胞毒性比Lipo-2000小，且對siRNA-GFP的轉(zhuǎn)染效率高，有望用于siRNA高效遞送。同時，DMA-GN的siRNA轉(zhuǎn)染能力顯著高于EDA-GN，可能與二甲基胺的質(zhì)子緩沖能力和內(nèi)涵體逃逸能力相關[44]。

4?結 論

基于GN的易合成、生物相容性好以及具有穩(wěn)定的近紅外熒光發(fā)射等特性，利用胺類化合物對其進行陽離子化修飾，制備CGN，成功實現(xiàn)了siRNA的有效載送和熒光示蹤。將siRNA/CGN作用于A549-GFP肺癌細胞后，可有效沉默GFP基因表達，使GFP基因表達率降至28.7%，其抑制效果接近商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑Lipo-2000。相比于Lipo-2000，siRNA/CGN復合物的細胞毒性較低，A549細胞受到的影響較少。因此，此siRNA遞送體系具有制備簡單、生物相容性好、載送效率高等優(yōu)點，為siRNA基因遞送及疾病治療提供了更多的可能。

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