林諄 陳曉 林冬果 劉大漁

摘?要?采用多層紙芯片共培養(yǎng)體系研究了外泌體介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞-肺成纖維細(xì)胞相互作用。多層紙芯片體系包含接種乳腺癌細(xì)胞成份的腫瘤層，接種肺成纖維細(xì)胞的招募層，以及上述兩層之間的侵襲層。疊加多層紙芯片形成包含乳腺癌細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞的三維共培養(yǎng)體系，而拆解多層紙芯片則逐層檢測(cè)細(xì)胞，因而可以從時(shí)間和空間角度解析細(xì)胞間相互作用。研究了在腫瘤層接種乳腺癌細(xì)胞或固定乳腺癌細(xì)胞來源的外泌體，發(fā)現(xiàn)二者同樣可以誘導(dǎo)招募層的肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞。之后，在招募層種植外泌體誘導(dǎo)的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，其顯示出較原生細(xì)胞更強(qiáng)的乳腺癌細(xì)胞招募作用。研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成主要在于腫瘤外泌體介導(dǎo)的宿主器官成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而宿主器官微環(huán)境的改變反之招募腫瘤細(xì)胞定向遷移。

關(guān)鍵詞?紙芯片;乳腺癌;成纖維細(xì)胞;外泌體;共培養(yǎng);轉(zhuǎn)移前微環(huán)境

1?引 言

腫瘤轉(zhuǎn)移具有明顯的器官選擇性[1，2]，其中一個(gè)重要原因在于腫瘤細(xì)胞與宿主器官之間存在信息交流，從而引發(fā)宿主器官形成轉(zhuǎn)移前微環(huán)境，后者促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性種植[3，4]。近期的大量研究顯示，外泌體是腫瘤細(xì)胞與外界進(jìn)行信息交流的重要媒介[5]。外泌體來源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，經(jīng)多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中，其成分包含復(fù)雜RNA和蛋白質(zhì)。外泌體在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用，尤其是可以改造遠(yuǎn)端臟器細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷移和定植[6]。因而，研究外泌體介導(dǎo)的腫瘤定向遷移對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制和轉(zhuǎn)移干預(yù)研究具有重要價(jià)值。鑒于播散的腫瘤細(xì)胞中只有少部分能夠在轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中存活并形成腫瘤[7，8]，通過宏觀水平解析外泌體介導(dǎo)的腫瘤遷移具有極大的難度。因此，迫切需要發(fā)展能夠以簡(jiǎn)單的手段研究外泌體介導(dǎo)的腫瘤-遠(yuǎn)端臟器的動(dòng)態(tài)相互作用的腫瘤轉(zhuǎn)移模型。

目前，用于研究腫瘤轉(zhuǎn)移的模型主要包括動(dòng)物水平和細(xì)胞水平兩類。相較于動(dòng)物模型，細(xì)胞水平腫瘤轉(zhuǎn)移模型能夠更直接和清晰地反映細(xì)胞遷移行為[9～13]。例如，經(jīng)典的Transwell實(shí)驗(yàn)是利用包含多孔薄膜的裝置檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的跨膜遷移行為。然而，Transwell實(shí)驗(yàn)有一些限制，包括使用二維培養(yǎng)細(xì)胞，不能仿真腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)結(jié)構(gòu)形式;由于擴(kuò)散效應(yīng)，跨膜化學(xué)環(huán)境差別難以長(zhǎng)期維持;無(wú)法研究腫瘤細(xì)胞在遷移過程中的動(dòng)態(tài)變化。鑒于外泌體介導(dǎo)的腫瘤-遠(yuǎn)端臟器動(dòng)態(tài)相互作用是一個(gè)長(zhǎng)期過程，因而，相關(guān)研究需要一種既可長(zhǎng)時(shí)間保持微環(huán)境穩(wěn)定性，又能夠動(dòng)態(tài)解析細(xì)胞-微環(huán)境相互作用的研究工具。

紙基微流控芯片是構(gòu)建細(xì)胞仿生環(huán)境的有利工具。紙是一種具有多孔結(jié)構(gòu)的生物兼容性材料，可作為支架實(shí)現(xiàn)三維細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)[14，15]。此外，借助于圖形化加工獲得的紙芯片可以實(shí)現(xiàn)多區(qū)域細(xì)胞培養(yǎng)，能夠?qū)崿F(xiàn)高通量細(xì)胞分析[16～18]。紙芯片可以進(jìn)一步疊加，構(gòu)建更為復(fù)雜的細(xì)胞培養(yǎng)體系。這類多層紙芯片被嘗試用于腫瘤細(xì)胞-微環(huán)境相互作用研究，并顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：可以將含有不同微環(huán)境組分的紙張堆疊起來，充分再現(xiàn)微環(huán)境的復(fù)雜性[14，16];多層疊紙結(jié)構(gòu)允許信號(hào)分子的交流，并能長(zhǎng)期保持化學(xué)濃度梯度[19，20]。這種非血管結(jié)構(gòu)可以簡(jiǎn)便地形成復(fù)雜的化學(xué)濃度梯度，為細(xì)胞相互作用研究提供有利條件;拆分多層疊紙結(jié)構(gòu)可以將從特定層回收的細(xì)胞對(duì)應(yīng)遷移過程中的特定階段，有助于從時(shí)間和空間角度解析細(xì)胞-微環(huán)境相互作用?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，多層紙芯片培養(yǎng)體系是研究外泌體介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞-微環(huán)境相互作用的有力工具。

本研究設(shè)計(jì)了一種多層紙芯片培養(yǎng)體系，用于研究外泌體介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞-肺成纖維細(xì)胞相互作用。多層紙芯片由腫瘤層、侵襲層和招募層組成，其中，腫瘤層接種乳腺癌細(xì)胞或固定乳腺癌細(xì)胞來源外泌體，招募層接種肺成纖維細(xì)胞，侵襲層將這兩層分隔。疊加多層紙芯片形成包含乳腺癌細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞的三維共培養(yǎng)體系，而拆解多層紙芯片則可以逐層檢測(cè)細(xì)胞。利用此多層紙芯片工具，分析共培養(yǎng)體系內(nèi)不同層面上細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能，從時(shí)間和空間角度解析外泌體介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞-宿主器官相互作用。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

Optima XPN-80 超速離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）;SZ-100Z納米顆粒分析儀 （法國(guó)HORIBA公司）;JEM-1400plus掃描電鏡（日本JEOL公司）;IX71倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）;Ti-E A1共聚焦顯微鏡（日本Nikon公司）。

PBS、DMEM 培養(yǎng)基、0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液、細(xì)胞核染料DAPI、鈣黃綠素/AM（Calcein/AM）、鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）（美國(guó)Thermo Fisher公司）;α-SMA一抗、Vimentin一抗（美國(guó)Abcam公司）;FITC熒光標(biāo)記二抗（武漢博士德公司）;胎牛血清（美國(guó)Sigma公司）;多聚甲醛、海藻酸鈉（上海生工公司）;CaCl2（羅恩公司）;BCA試劑盒（江蘇碧云天公司）;人肺成纖維細(xì)胞株HLFs來自中山大學(xué);乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231和MDA-MB-453來自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。

2.2?紙芯片的加工

紙芯片使用Whatman 105擦鏡紙以蠟染方法加工[21]。單張紙芯片尺寸為8 cm×3 cm，包含10個(gè)蠟染疏水屏障封閉的圓形親水區(qū)，親水區(qū)直徑8 mm，間隔8 mm。圖形化紙片在150℃下烘烤10～15 s，將蠟融化并滲透到紙全層。之后，紙片在乙醇浴中消毒30 min，在層流罩中經(jīng)紫外線照射后，風(fēng)干。

2.3?細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-453細(xì)胞、HLFs用DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），在37℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)?；厥盏募?xì)胞重懸于含2%海藻酸鈉的DMEM培養(yǎng)基中，備用。

2.4?外泌體的提取與鑒定

培養(yǎng)至第三天，收集乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)液，500 r/min離心10 min，取上清液，12000 r/min離心20 min，去除凋亡小體和細(xì)胞碎片，上清液以120000 r/min離心70 min，獲得外泌體。將外泌體用20 mL PBS清洗后，再次超速離心，收集的外泌體用PBS重懸，進(jìn)行掃描電鏡檢測(cè)，并用納米粒子分析儀進(jìn)行粒徑分析。使用BCA試劑盒測(cè)定外泌體濃度。

2.5?外泌體處理肺成纖維細(xì)胞

HLFs以50000細(xì)胞/孔的密度接種于六孔板中，每孔添加10 μg/mL 乳腺癌細(xì)胞來源外泌體。每3天補(bǔ)充1次培養(yǎng)基。

2.6?多層紙芯片共培養(yǎng)體系的構(gòu)建

紙芯片上的細(xì)胞培養(yǎng)步驟：（1）將細(xì)胞重懸于2%海藻酸鹽-DMEM溶液，以106細(xì)胞/mL密度接種于紙芯片親水區(qū)，每個(gè)區(qū)域約5000個(gè)細(xì)胞;（2）向接種區(qū)加入40 mmol/L CaCl2溶液，靜置2 min，形成海藻酸鈣凝膠;（3）接種細(xì)胞的紙芯片置于含DMEM的培養(yǎng)皿中，于5% CO2培養(yǎng)箱中37°C孵育過夜;（4）將各層紙芯片按照順序組裝。如圖1所示，多層紙芯片培養(yǎng)體系包含腫瘤層、侵襲層和招募層。腫瘤層接種MDA-MB-231和MDA-MB-453乳腺癌細(xì)胞或上述細(xì)胞來源的外泌體，招募層接種HLFs，兩層之間由侵襲層隔開，親水區(qū)域?yàn)椴缓?xì)胞的海藻酸鈣凝膠。此外，招募層和鄰近的侵襲層之間插入一層PC膜，防止腫瘤細(xì)胞進(jìn)入招募層。多層紙芯片由定制的聚四氟乙烯夾板固定。組裝完成后，多層紙芯片頂層夾板的開孔處加入DMEM溶液，裝置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，每天換液。

2.7?芯片上的細(xì)胞檢測(cè)

培養(yǎng)3天后，拆卸紙芯片裝置，將每層紙芯片各置于單獨(dú)的培養(yǎng)皿中，以PBS清洗2遍，37℃下Calcein-AM 染色孵育10 min。紙芯片置于倒置顯微鏡下拍攝，熒光圖像用Image J軟件分析。細(xì)胞分布計(jì)算公式為Fi/Ft×100%，其中，F(xiàn)i為某層某親水區(qū)的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)t為各層同一位置親水區(qū)熒光強(qiáng)度之和。

2.8?細(xì)胞免疫熒光分析

拆解的單層紙芯片置于培養(yǎng)皿中，以4%多聚甲醛固定，室溫孵育20 min，以PBS沖洗3次后，用4% BSA封閉。招募層紙芯片細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)用抗α-SMA 一抗（1：500稀釋） 和抗 Vimentin一抗 （1∶500 稀釋）于4℃孵育12 h，再用FITC二抗標(biāo)記，37℃孵育1 h。細(xì)胞核用1 μg/mL DAPI染色。紙芯片用PBS沖洗3次后，置于共聚焦顯微鏡下拍攝，熒光圖片用Image J軟件分析。

3?結(jié)果與討論

3.1?多層紙芯片培養(yǎng)體系的構(gòu)建

為研究外泌體介導(dǎo)的腫瘤-遠(yuǎn)端臟器動(dòng)態(tài)相互作用，構(gòu)建了一種多層紙芯片培養(yǎng)體系。多層紙芯片培養(yǎng)體系的優(yōu)勢(shì)在于既可通過組裝獲得包含復(fù)雜微環(huán)境的培養(yǎng)體系，又可通過拆解獲得每個(gè)層面上的細(xì)胞信息。本研究設(shè)計(jì)的多層紙芯片的每層含有10個(gè)親水區(qū)域，因而允許進(jìn)行平行的細(xì)胞-微環(huán)境相互作用研究。多層紙芯片培養(yǎng)體系包含腫瘤層、侵襲層和招募層（圖2），并在招募層和鄰近侵襲層之間插入一層多孔PC膜，以防止侵襲層和招募層之間的細(xì)胞串?dāng)_。

將這種多層紙芯片共培養(yǎng)體系用于外泌體介導(dǎo)的乳腺癌-肺相互作用研究。多層紙芯片體系中，接種乳腺癌細(xì)胞的腫瘤層模擬原發(fā)乳腺癌，接種HLFs的招募層模擬肺，兩層之間的數(shù)層侵襲層模擬腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移途徑。完成培養(yǎng)后，將多層紙芯片拆解，不同層面紙芯片對(duì)應(yīng)細(xì)胞遷移的不同階段。逐一分析不同層面上細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能，可以從時(shí)間和空間角度解析外泌體介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞-宿主器官相互作用。侵襲層中出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞是腫瘤遷移的證據(jù)，由培養(yǎng)條件對(duì)腫瘤遷移的影響可以獲知微環(huán)境因素在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮的作用。

這種多層紙芯片培養(yǎng)體系為研究外泌體介導(dǎo)的研究乳腺癌細(xì)胞-HLFs相互作用提供了有利的工具：一方面，將乳腺癌細(xì)胞來源外泌體固定于腫瘤層，觀察其對(duì)HLFs的轉(zhuǎn)化作用;另一方面，在招募層種植外泌體誘導(dǎo)的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，觀察其對(duì)乳腺癌細(xì)胞招募作用。借助于多層紙芯片培養(yǎng)體系，從時(shí)間和空間角度解析外泌體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成及其對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。

3.2?紙芯片上的乳腺癌細(xì)胞與肺成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)

將乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231和MDA-MB-453）置于腫瘤層，將HLFs置于招募層，將芯片組裝后培養(yǎng)。為了更好地模擬體內(nèi)條件，將腫瘤層置于底層缺氧環(huán)境，將招募層置于頂層富氧環(huán)境。共培養(yǎng)結(jié)束后，拆解多層紙芯片，用死/活細(xì)胞熒光染色標(biāo)記各層紙上的細(xì)胞。結(jié)果表明，不同紙層上的細(xì)胞活性良好（圖3A）。

與單獨(dú)培養(yǎng)相比，乳腺癌細(xì)胞-HLFs共培養(yǎng)條件下HLFs細(xì)胞活性無(wú)明顯變化（圖3B），而乳腺癌細(xì)胞的活性則有所提高（圖3C）。此結(jié)果表明，多層紙芯片不僅能夠提供充足的氧氣和養(yǎng)分，還可通過細(xì)胞間相互作用提高腫瘤細(xì)胞的活性。

3.3?乳腺癌細(xì)胞來源的外泌體激活肺成纖維細(xì)胞

研究了多層紙芯片共培養(yǎng)體系中腫瘤層和招募層細(xì)胞之間的相互作用。與文獻(xiàn)[22]報(bào)道相似，本研究同樣觀察到腫瘤細(xì)胞通過旁分泌效應(yīng)促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變成腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞。在紙芯片共培養(yǎng)體系中，將腫瘤層置于中間層（L3），招募層位于頂層（L6），在共培養(yǎng)不同時(shí)間后，檢測(cè)HLFs的波形蛋白（Vimentin）的表達(dá)情況。與不同乳腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)的兩組實(shí)驗(yàn)中，HLFs中波形蛋白表達(dá)隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加（圖4）。此結(jié)果表明，原發(fā)癌灶的腫瘤細(xì)胞參與宿主器官轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成，而此過程具有時(shí)間依賴性。

鑒于外泌體是腫瘤細(xì)胞與其它細(xì)胞信息交流的一個(gè)重要途徑[23]，進(jìn)一步研究了外泌體在肺成纖維細(xì)胞向腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮的作用。制備并確認(rèn)了乳腺癌細(xì)胞來源外泌體（圖5A），并將純化得到的外泌體固定在多層紙芯片的腫瘤層，與HLFs共培養(yǎng)。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明，培養(yǎng)后的HLFs中，波形蛋白和α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá)均增高（圖5B），說明外泌體誘導(dǎo)了HLFs轉(zhuǎn)變成CAFs。因此，可以認(rèn)為外泌體的傳輸是形成腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的一個(gè)重要途徑，其主要作用在于誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的形成。

3.4?腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞定向遷移

為了研究來自宿主器官的招募效應(yīng)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響，檢測(cè)了向招募層轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞數(shù)量。將腫瘤層置于底層（L2），招募層置于頂層（L6）。利用Calcein-AM染色檢測(cè)各層的細(xì)胞密度，進(jìn)而表征細(xì)胞在共培養(yǎng)體系中的分布情況。MDA-MB-231和MDA-MB-453細(xì)胞都向招募層遷移，侵襲層的細(xì)胞密度顯示招募作用的強(qiáng)弱。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大部分乳腺癌細(xì)胞都轉(zhuǎn)移至第4層和第5層。與HLFs共培養(yǎng)時(shí)，有40.97%±6.56% 的MDA-MB-453 細(xì)胞和19.86%±2.57% MDA-MB-231細(xì)胞遷移到侵襲層;與CAFs共培養(yǎng)時(shí)，MDA-MB-453細(xì)胞的遷移比例增長(zhǎng)到62.97%±4.95%，而 MDA-MB-231細(xì)胞提高到44.97%±2.74%（圖6）。細(xì)胞遷移結(jié)果表明，CAFs在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用，而CAFs又是由外泌體誘導(dǎo)HLFs形成。由此得出，在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體誘導(dǎo)HLFs轉(zhuǎn)變成CAFs，形成轉(zhuǎn)移前微環(huán)境;CAFs招募腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至宿主器官。因此，多層紙芯片的共培養(yǎng)體系是研究腫瘤細(xì)胞和宿主器官細(xì)胞相互作用的有力工具。骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞等其它細(xì)胞也可置于招募層，利用多層紙芯片模型可研究腫瘤不同器官定向遷移的機(jī)制。

4?結(jié) 論

設(shè)計(jì)的多層紙芯片共培養(yǎng)體系具有以下特性： 便于加入不同類型的細(xì)胞用于研究腫瘤與宿主遷移的相互作用;基于紙層堆疊形成的共培養(yǎng)方法能夠模擬體內(nèi)微環(huán)境;拆解多層紙芯片允許從時(shí)間和空間上研究細(xì)胞間相互作用。基于以上優(yōu)勢(shì)，這種多層紙芯片共培養(yǎng)體系是腫瘤器官傾向性轉(zhuǎn)移機(jī)制研究的有利工具。利用此多層紙芯片共培養(yǎng)體系研究了外泌體介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞-HLFs相互作用。一方面，乳腺癌細(xì)胞分泌外泌體誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞;另一方面，外泌體誘導(dǎo)產(chǎn)生的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞反過來招募乳腺癌細(xì)胞?；诙鄬蛹埿酒才囵B(yǎng)體系的細(xì)胞相互作用，研究證實(shí)了原位腫瘤細(xì)胞可通過外泌體誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的定向遷移。

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