羅彥波 陳小靜 李翔宇 張洪非 朱風(fēng)鵬 姜興益 龐永強(qiáng)

摘 要 建立了化學(xué)衍生結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測(cè)加熱卷煙煙氣中9種醛酮類香味成分的分析方法。樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液中的目標(biāo)分析物分別用1-（2-肼基-2-氧代乙基）吡啶-1-溴化物（吉拉德P試劑，GP）和d5-GP衍生，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的衍生化產(chǎn)物作為穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)。在最優(yōu)的衍生化反應(yīng)條件下，9種醛酮類香味成分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)（R2）≥0.9937，檢出限為0.07～12.66 ng/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%～11.6%。9種醛酮類香味成分在3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率為82.5%～118.0%。本方法可用于加熱卷煙煙氣中醛酮類香味成分的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 化學(xué)衍生;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;加熱卷煙;醛酮類香味成分

1 引 言

煙草及煙氣品質(zhì)的控制和評(píng)價(jià)是煙草行業(yè)關(guān)注的重要問題[1]，其中，非煙氣的化學(xué)組成與煙氣品質(zhì)密切相關(guān)，煙氣的化學(xué)組成影響煙氣的香味和吃味，因此，煙氣香味成分的研究一直備受重視。醛酮類香味成分是煙草中數(shù)量最多的一類香味成分[2]，目前，煙氣中已鑒定出的醛酮類香味成分超過500種。許多重要香味成分屬于醛酮類[3]，如3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮在煙氣中能產(chǎn)生甜的、焦糖-楓槭的氣息;4-庚酮?jiǎng)t能產(chǎn)生甜的、水果的氣息;一些高沸點(diǎn)的酮（如紫羅蘭酮）也有明顯的致香作用，不少已用于煙草制品的加香中[2]。有研究表明，醛酮類香味成分的組成和相對(duì)含量綜合影響煙氣的品質(zhì)香味情況[4]。因此，有必要對(duì)煙氣中醛酮類香味成分進(jìn)行分析研究。

目前，醛酮類化合物的檢測(cè)方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5～9]、高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)/紫外檢測(cè)法[10～13]和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14～16]等。由于醛酮類化合物缺少發(fā)色團(tuán)和易電離基團(tuán)，因此，在進(jìn)行紫外和質(zhì)譜分析前，需要通過衍生引入發(fā)色團(tuán)或易電離基團(tuán)，以提高紫外檢測(cè)的吸光度和質(zhì)譜檢測(cè)的離子化效率[17，18]。質(zhì)譜檢測(cè)常用的衍生化試劑有亞硫酸銨[19]、伯胺類[20，21]、肼類[22～29]和酰肼類[30～34]等。吉拉德P試劑（GP）是常用的酰肼類衍生化試劑，其結(jié)構(gòu)中含有恒帶正電荷的季銨鹽結(jié)構(gòu)，因而能夠顯著提高衍生化產(chǎn)物在質(zhì)譜中的離子化效率和檢測(cè)靈敏度。GP已被用于人和牛體液中類固醇激素[31，35]、血漿和干血點(diǎn)中性激素[36，37]等的分析。結(jié)果表明，GP可選擇性地與醛酮類化合物高效反應(yīng)，在分析上述復(fù)雜樣品中具有優(yōu)良的表現(xiàn)。然而，目前尚未見GP用于卷煙煙氣中醛酮類香味成分檢測(cè)的報(bào)道。

煙氣中的醛酮類化合物主要是碳水化合物在加熱條件下產(chǎn)生的，當(dāng)加熱溫度高于300℃時(shí)，醛酮類化合物是構(gòu)成煙氣香味的主要成分之一[38]。與傳統(tǒng)卷煙相比，加熱卷煙煙氣中大多數(shù)化學(xué)成分的釋放量顯著降低，而以“加熱而非燃燒煙絲”為特征的加熱卷煙（加熱溫度約為350℃）在加熱過程中具備醛酮類香味成分生成的物質(zhì)基礎(chǔ)和形成條件，因此，加熱卷煙煙氣中醛酮類香味成分的降低比例有限[39，40]。由于制造工藝和添加原料的差異，不同加熱卷煙煙氣中的醛酮類香味成分的種類也不同。目前，煙氣中醛酮類物質(zhì)的分析方法主要采用外標(biāo)法或單一內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，而且目標(biāo)分析物多為有害的羰基化合物，個(gè)別針對(duì)香味成分的檢測(cè)方法存在目標(biāo)分析物的種類和結(jié)構(gòu)較為單一的問題。

因此，本研究利用GP和d5-GP分別衍生樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液中的醛酮類香味成分，并以d5-GP的衍生化產(chǎn)物為目標(biāo)分析物的穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)。在目標(biāo)分析物的選擇方面，本研究以煙草制品許可使用的醛酮類化合物和煙草在加熱過程中生成的醛酮類化合物為基礎(chǔ)，同時(shí)考慮對(duì)卷煙品質(zhì)的影響和化學(xué)結(jié)構(gòu)（不同碳鏈長(zhǎng)度、含有其它不同的官能團(tuán)、不同羰基或醛基數(shù)目），選擇了如圖1所示的9種代表性目標(biāo)分析物。其中，3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮、庚醛和4-庚酮為煙草在加熱過程中生成的目標(biāo)分析物，其余6種化合物為煙草制品許可使用的醛酮類化合物添加劑。將GP應(yīng)用于加熱卷煙中醛酮類香味成分的檢測(cè)，通過衍生化反應(yīng)向目標(biāo)分析物分子中引入同位素基團(tuán)，并作為內(nèi)標(biāo)，建立了加熱卷煙煙氣中醛酮類香味成分的分析方法。本方法顯著提高了目標(biāo)分析物的靈敏度，對(duì)煙氣中醛酮類香味成分的分離和分析具有參考意義。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Agilent 1200液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）和AB SCIEX 4000三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB公司），配備有G1311A輸液泵、G1322A在線脫氣機(jī)、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱和Analyst 1.5.2工作站。CP224S電子天平（德國(guó)Sartorius公司）;SM450型20通道吸煙機(jī)（配加熱卷煙分析套件，英國(guó)Cerulean公司）; 44 mm劍橋?yàn)V片（德國(guó)Borgwaldt-KC公司）;SB25-12DTD超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）;SHA-B恒溫振蕩器（常州國(guó)華電器有限公司）;TurboVap LV氮?dú)鉂饪s儀（瑞典Biotage公司）;Heidolph多位渦旋儀（德國(guó)Heidolph公司）。

GP和d5-GP（純度≥99%，美國(guó)Avanti Polar Lipids Inc公司）;9種醛酮類化合物：3-羥基-2-丁酮（純度≥99.4%）、3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮（純度≥99.4%）、2，3-丁二酮（純度≥97.0%）、苯甲醛（純度≥995%）、己醛（純度≥95.0%）、4-庚酮（純度≥99. 8%）、庚醛（純度≥97.0%）、壬醛（純度≥99.5%）和紫羅蘭酮（純度≥96.0%），均購(gòu)自美國(guó)Sigma-aldrich公司;甲醇和乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）;甲酸（色譜純，美國(guó)Aladdin公司）;冰醋酸（色譜純，美國(guó)Fisher Scientific公司）;實(shí)驗(yàn)用水為Q-POD Milli-Q超純水儀（美國(guó)Millipore公司）制得的超純水。

2.2 儀器條件

液相色譜條件：色譜柱為Shimadzu VP-ODS（150 mm × 2.0 mm，5 μm），柱溫為40℃，流速為0.2 mL/min，流動(dòng)相A和B分別為0.1%（V/V）甲酸和乙腈。梯度洗脫：0～5 min，5% B;5～22 min，5%～40% B;22～40 min，40%～90% B; 40～45 min，90% B; 45～48 min，90%～5% B; 48～60 min，5% B。進(jìn)樣體積為10 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源;電噴霧電壓為5500 V，氣簾氣壓力為68.95 kPa，霧化氣壓力為75.84 kPa，碰撞氣（Ar氣）壓力為41.37 kPa;掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè);其它質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.3 樣品制備

本研究的目的是建立加熱卷煙中醛酮類香味成分的分析方法，因此，直接采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法對(duì)加熱卷煙進(jìn)行抽吸，并對(duì)其煙氣冷凝物進(jìn)行提取[41，42]。由于加熱卷煙煙氣冷凝物的基質(zhì)比傳統(tǒng)卷煙煙氣簡(jiǎn)單，主要為水分、丙二醇和丙三醇等。因此，冷凝物提取液直接進(jìn)行衍生化處理。具體步驟：采用ISO抽吸模式規(guī)定的抽吸參數(shù)對(duì)加熱卷煙樣品進(jìn)行抽吸，再將捕集有煙氣總粒相物的濾片用15 mL甲醇超聲提取30 min，靜置，取1.0 mL上清液進(jìn)行衍生。衍生時(shí)，在上清液中依次加入125 μL冰醋酸和GP溶液（3.0 μmol/L，溶于甲醇），渦旋混合后在40℃下振蕩反應(yīng)2 h，氮?dú)獯蹈?，?.0 mL甲醇-水（1∶1，V/V）溶液復(fù)溶。在對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行衍生時(shí)，稱取適量目標(biāo)分析物標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成不同質(zhì)量濃度

的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，再分別取系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行衍生，衍生步驟同上。用d5-GP溶液（3.0 μmol/L，溶于甲醇）代替GP溶液對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行衍生，衍生步驟同上。分別取20 μL復(fù)溶后的d5-GP衍生化產(chǎn)物添加至GP衍生后的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液，混勻，待測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 GP標(biāo)記的醛酮化合物的質(zhì)譜特征

GP中帶孤電子對(duì)的氮原子可以進(jìn)攻羰基基團(tuán)上帶正電荷的碳原子發(fā)生親核加成反應(yīng)，生成的羥胺類化合物經(jīng)脫水后形成穩(wěn)定的腙，其反應(yīng)示意圖如圖2所示。經(jīng)衍生化反應(yīng)后目標(biāo)分析物在結(jié)構(gòu)中引入了帶正電荷的季銨基團(tuán)，可以提高質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)。因此，本研究首先考察了GP標(biāo)記的目標(biāo)分析物的二級(jí)碎裂行為，結(jié)果如圖3所示。所有的目標(biāo)分析物被GP標(biāo)記后都能產(chǎn)生一個(gè)丟失79 Da的子離子和相同的碎片離子m/z 80，這是由衍生化試劑中的吡啶環(huán)引起的[30，35]，說明衍生化試劑GP能夠標(biāo)記本實(shí)驗(yàn)中的目標(biāo)分析物。標(biāo)記后的目標(biāo)分析物具有較好的碎裂行為，丟失吡啶環(huán)后，離子[M·GP-Br-Py]的質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)相對(duì)較強(qiáng)，而且附近沒有其它碎片離子的干擾，這有利于對(duì)標(biāo)記后的目標(biāo)分析物進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)。

3.2 衍生化條件的優(yōu)化

為了得到較好的標(biāo)記效率，考察了醋酸和GP的用量、反應(yīng)溫度和時(shí)間等影響衍生化效率的因素。

在衍生化反應(yīng)中，醋酸可以提供酸性的催化環(huán)境，在冰醋酸占整個(gè)反應(yīng)體系體積的0～10%（V/V）范圍內(nèi)，考察了冰醋酸用量的影響。結(jié)果表明，當(dāng)冰醋酸的體積為5%（V/V）時(shí)，衍生化產(chǎn)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值達(dá)到最大，繼續(xù)增大醋酸用量，峰面積的比值基本保持不變。

通過改變衍生化試劑的用量，使GP與目標(biāo)分析物的物質(zhì)的量的比值為10～1000。結(jié)果表明，隨著衍生化試劑用量的增加，衍生化產(chǎn)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值逐漸增加，當(dāng)物質(zhì)的量的比值達(dá)到500時(shí)，峰面積的比值基本不再變化。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制以及實(shí)際樣品分析時(shí)衍生反應(yīng)中，為保證衍生化反應(yīng)完全，選擇GP與待測(cè)物的物質(zhì)的量的比值遠(yuǎn)超過500。

文獻(xiàn)[30，35～37]報(bào)道的GP試劑標(biāo)記的反應(yīng)溫度為室溫～70℃，由于本研究的衍生化反應(yīng)在甲醇（沸點(diǎn)為65℃）中進(jìn)行，因此，選擇的反應(yīng)溫度范圍為30℃～60℃。結(jié)果表明，在30℃～60℃范圍內(nèi)，反應(yīng)溫度對(duì)衍生化產(chǎn)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值影響不大，為了保證穩(wěn)定的衍生化效率，選擇40℃作為后續(xù)的反應(yīng)溫度。

考察了反應(yīng)時(shí)間對(duì)衍生化效率的影響。結(jié)果表明，在0.5～6 h范圍內(nèi)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間從0.5 h延長(zhǎng)到3 h時(shí)，衍生化產(chǎn)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值逐漸增加，繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，峰面積比值增加不明顯。

綜上，選擇的最優(yōu)的衍生化條件為：冰醋酸體積為5%（V/V），反應(yīng)溫度為40℃，反應(yīng)時(shí)間為3 h。

3.3 衍生前后靈敏度比較

由于衍生化產(chǎn)物中含有恒帶正電荷的季銨鹽基團(tuán)，因此，衍生化處理可增加醛酮化合物在電噴霧離子源中的離子化效率和質(zhì)譜響應(yīng)，有助于解決醛酮類香味成分因缺少易電離基團(tuán)而無(wú)法用質(zhì)譜直接檢測(cè)的難題。將9種醛酮類香味成分用質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，目標(biāo)分析物標(biāo)準(zhǔn)溶液未經(jīng)衍生直接進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜分析，只檢測(cè)到3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮和紫羅蘭酮的質(zhì)譜信號(hào);目標(biāo)分析物標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)過GP衍生后進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，所有目標(biāo)分析物均有質(zhì)譜響應(yīng)。經(jīng)過衍生后，3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮和紫羅蘭酮的靈敏度分別提高了36和27倍，其余7種化合物（直接進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜分析沒有信號(hào)）在衍生化之后的質(zhì)譜信號(hào)都比3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮強(qiáng)，可以推測(cè)其靈敏度提高的倍數(shù)更大。以上結(jié)果說明，GP衍生化處理可顯著提高目標(biāo)分析物的靈敏度。

3.4 方法分析性能

考察了GP標(biāo)記后衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性。將標(biāo)記后的產(chǎn)物在0～4℃下避光保存，分別在第0、6、12和24 h進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。結(jié)果表明，9種衍生化產(chǎn)物的峰面積沒有明顯變化，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.0%～11.9%之間，說明此保存條件下衍生化產(chǎn)物在24 h內(nèi)穩(wěn)定，保證了方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。由于經(jīng)過衍生化處理的樣品可在24 h內(nèi)進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，因此，本研究未對(duì)樣品進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定性考察。

在優(yōu)化條件下，考察了方法的檢出限、定量限和線性范圍。檢出限和定量限為衍生化產(chǎn)物信噪比為3和10時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度。以目標(biāo)分析物濃度為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。如表2所示，9種目標(biāo)物的檢出限在0.07～12.66 ng/mL之間，定量限在0.22～42.19 ng/mL之間，線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.9937。

為了考察本方法的重現(xiàn)性，制備3種濃度（各目標(biāo)分析物線性范圍最低值的2、10和40倍）的樣品，以1天內(nèi)制備的5個(gè)樣品和連續(xù)3天配制的樣品進(jìn)行分析，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差）。如表3所示，目標(biāo)分析物的日內(nèi)及日間精密度分別不大于10.8%和11.6%，說明本方法重現(xiàn)性良好。

3.5 實(shí)際樣品分析

采用本方法對(duì)兩種典型加熱卷煙（iQOS和glo）進(jìn)行分析。在iQOS和glo煙氣中檢測(cè)到3-羥基-2-丁酮，其含量均低于本方法的定量限;在glo煙氣中檢測(cè)到2，3-丁二酮，其含量為39.18 ng/支。

如圖4所示，目標(biāo)分析物的定量分析不存在干擾。由于目前沒有分析加熱卷煙煙氣中醛酮類香味成分的標(biāo)準(zhǔn)方法，文獻(xiàn)[39]報(bào)道glo煙氣中2，3-丁二酮的含量為33.60～43.80 ng/支。以iQOS和glo進(jìn)行回收率測(cè)定，在超聲提取階段加入9種目標(biāo)分析物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，3種加標(biāo)水平分別為各目標(biāo)分析物線性范圍最低值的2、10和40倍，每個(gè)濃度水平重復(fù)測(cè)定5次。如表4所示，實(shí)際樣品中目標(biāo)分析物在不同濃度下的回收率為82.5%～118.0%，說明本方法的準(zhǔn)確度好，可用于分析加熱卷煙煙氣中的醛酮類香味成分。

4 結(jié) 論

采用化學(xué)衍生標(biāo)記技術(shù)，建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定醛酮類香味成分含量，并用于實(shí)際加熱卷煙煙氣樣品的分析。本方法具有靈敏度高、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，可以滿足加熱卷煙煙氣中醛酮類香味成分高靈敏度檢測(cè)的需求，同時(shí)也為其它類似樣品中醛酮類化合物的分析提供了參考。

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