翟鍇華 婁季宇

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450003

腦卒中最常見的類型為缺血性卒中，目前認(rèn)為血管再通是治療缺血性卒中的最有效方法，但是缺血后的再灌注損傷是影響治療效果的主要因素，其發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，涉及一系列級聯(lián)反應(yīng)。鞣花酸是一種天然的植物化學(xué)物，具有抗突變、抗氧化應(yīng)激及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用。研究發(fā)現(xiàn)鞣花酸可以減輕缺血再灌注損傷，但具體機(jī)制仍不明確。磷酸化激活的PI3K/Akt信號通路參與腦缺血再灌注后氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、血管生成等多個(gè)生理、病理過程[1]，活化的PI3K/Akt/NOS通路可能是鞣花酸對腦缺血再灌注損傷大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的藥理機(jī)制。因此本文在腦缺血再灌注大鼠模型中探討鞣花酸預(yù)處理對PI3K/Akt/NOS通路的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組雄性Wistar大鼠36只，體質(zhì)量250～300 g均購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，遵循鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)和使用準(zhǔn)則。實(shí)驗(yàn)中動物飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)SPF級動物實(shí)驗(yàn)室。按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham，n=12)、缺血再灌注組(IR，n=12)及鞣花酸預(yù)處理組(EA，n=12)。鞣花酸溶于生理鹽水中配置成混懸液，連續(xù)每天給予鞣花酸預(yù)處理組大鼠100 mg/kg的鞣花酸灌胃，假手術(shù)組和缺血再灌注組大鼠同等體積的生理鹽水灌胃。

1.2主要試劑及器材線栓(北京西濃科技有限公司)，小動物手術(shù)顯微鏡(Carl Zeiss公司，德國)、離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific 公司，瑞典)、顯微鏡(Nikon公司，日本)等。cleaved caspase-3、細(xì)胞色素C、Bax、Bcl-2、Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS抗體購自 Cell Signaling Technology (CST)。EA(上海源葉生物科技有限公司)，HE 染色試劑盒購自碧云天，切片機(jī)(型號：CM3050S，德國Leica公司)，BCA試劑盒及TBTS購自Sigma公司，ImageQuantTM 400凝膠成像系統(tǒng)(美國通用)。

1.3腦缺血再灌注模型的制作及評價(jià)參照改良LONGA等[2]的造模方法制作大鼠缺血再灌注模型，腹腔注射3.6%水合氯醛(1 mL/100 g)，麻醉成功后，仰臥固定于鼠板上，分離左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，結(jié)扎頸外動脈及頸總動脈的近心端，動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈，從頸總動脈遠(yuǎn)心端將線栓從頸總動脈分叉處送至頸內(nèi)動脈(18±2)mm，阻斷大腦中動脈血流，縫合切口并將線栓尾端固定于皮膚外面，缺血120 min后抽查線栓。參照LONGA評分法對麻醉清醒后的大鼠進(jìn)行評分，選取1～3分的大鼠為本實(shí)驗(yàn)的動物模型。

1.4HE染色各組大鼠神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評分后隨機(jī)選 6 只大鼠麻醉后處死，分離腦組織，剪取缺血側(cè)腦組織約 0.5 g 儲存在-80 ℃?zhèn)溆谩ＪＳ嘟M腦織嚴(yán)格按照操作規(guī)范經(jīng)蠟包埋，制作病理切片。之后參照說明書步驟以蘇木素及伊紅染色，然后在光學(xué)顯微鏡下選取 5 個(gè)視野進(jìn)行觀察并采集圖像。

1.5Westernblot方法檢測凋亡相關(guān)蛋白及PI3K/Akt/eNOS信號蛋白的表達(dá)在冰上將腦組織剪碎后加入蛋白裂解液，制作為勻漿液后3 000 r/min，離心 20 min后取其上清液，BCA 試劑盒測得蛋白總濃度，具體操作步驟及流程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，取各組中等質(zhì)量的樣品液DS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，將膜置入一抗(Bax 1：1000，β-actin 1：1000)，于4 ℃孵育過夜后TBST清洗3次后加二抗，室溫孵育2 h，TBST 漂洗3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，用Image J軟件灰度值(DPI)分析。同樣步驟檢測CytC、Cleaved caspase-3、Bcl-2、p-Akt、Akt、p-eNOS、eNOS表達(dá)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本研究中所有數(shù)據(jù)用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠NSS評分與假手術(shù)組比較，模型組大鼠NSS評分顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，鞣花酸預(yù)干預(yù)組大鼠的NSS評分顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

注：*與Sham組比較，&與IR組比較，P<0.05圖1 鞣花酸對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重程度評分的影響Figure 1 Effect of ellagic acid on neurological severity score in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury

2.2腦梗死區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的變化高倍鏡下各實(shí)驗(yàn)組的大鼠皮層的組織學(xué)觀察結(jié)果，如圖1所示：假手術(shù)組缺血區(qū)皮層細(xì)胞數(shù)量較多，形態(tài)正常；模型組細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)異常，胞漿中可見一個(gè)或者多個(gè)空泡，基質(zhì)疏松，可見較多的深染的凋亡小體及壞死細(xì)胞；鞣花酸預(yù)處理組神經(jīng)元正常結(jié)構(gòu)消失但大體形態(tài)存在，神經(jīng)元皺縮較模型組程度低(圖2)。

2.3各組大鼠腦組織凋亡蛋白表達(dá)變化模型組cleaved caspase-3、細(xì)胞色素C和Bax表達(dá)量明顯升高(P<0.05，圖3)；鞣花酸組cleaved caspase-3、細(xì)胞色素C和Bax表達(dá)量明顯下降(P<0.05，圖3)。

2.4各組大鼠腦組織中PI3K/Akt/NOS信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化模型組p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS的值明顯升高，鞣花酸組p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS的值明顯下降(P<0.05，圖4)。

圖2 鞣花酸對大鼠缺血再灌注腦損傷HE染色的影響(×400)

Figure1 The effect of EA on wistar rats with IR observed by HE staining (×400)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與IR組比較，&P<0.05

圖3 鞣花酸對大鼠腦皮層中cleaved caspase-3、細(xì)胞色素C、Bax/Bcl-2表達(dá)的影響

Figure 3 The effects of EA on protein expression of cleaved caspase-3，Cytochrome C，Bax/Bcl-2 in the cortex

注：與Sham組比較，*P<0.05；與IR組比較，&P<0.05圖4 各組大鼠腦組織中p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS的比值Figure 4 The expression of p-Akt/Akt and p-eNOS/eNOS in the brain tissue of each group

3 討論

缺血性腦卒中的再灌注可能誘發(fā)鈣離子超載、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、凋亡過度等，進(jìn)一步加重缺血再灌注區(qū)神經(jīng)元損傷[3]，導(dǎo)致患者嚴(yán)重的殘疾或甚至死亡的重要因素之一，因此探討如何減輕腦缺血再灌注后損傷具有重大意義[4]。目前研究已發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)緩解：氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎癥反應(yīng)及凋亡等多種病理機(jī)制。雖然凋亡在維持機(jī)體內(nèi)正常細(xì)胞群體數(shù)量穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，但是在過分刺激或者不利的環(huán)境下，凋亡水平的改變會干擾正常細(xì)胞群體數(shù)量穩(wěn)態(tài)，從而影響神經(jīng)元的功能，甚至?xí)霈F(xiàn)細(xì)胞內(nèi)正常蛋白或者細(xì)胞器的嚴(yán)重?fù)p傷，造成器官或者機(jī)體的損傷，此時(shí)凋亡演變?yōu)椴涣嫉姆磻?yīng)，因此調(diào)控凋亡過程是防治疾病的一個(gè)途徑[5-6]。

腦血管病預(yù)后及生存質(zhì)量與神經(jīng)功能缺損密切相關(guān)，因此在藥物對腦缺血再灌注的作用研究中，運(yùn)動行為學(xué)的判斷至關(guān)重要。本試驗(yàn)中鞣花酸預(yù)處理組大鼠的NSS顯著高缺血再灌注組，同時(shí)鞣花酸預(yù)處理后皮層細(xì)胞的數(shù)量及形態(tài)較模型組均有改善，提示鞣花酸預(yù)處理可以減輕缺血再灌注腦損傷程度，從而改善腦缺血再灌注損傷造成的神經(jīng)功能缺損。同時(shí)鞣花酸來源于漿果類和堅(jiān)果類，其來源廣泛、低毒性和易獲得等特點(diǎn)，因此鞣花酸在治療缺血性卒中方面可能是一個(gè)很有前景的藥物。因腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，而鞣花酸在腦缺血再灌注損傷中的作用及其機(jī)制目前仍不清楚。

為了進(jìn)一步探討機(jī)體內(nèi)鞣花酸對凋亡水平調(diào)控的作用，本試驗(yàn)選擇檢測重要的凋亡蛋白的表達(dá)。腦缺血再灌注損傷后的有害線粒體反應(yīng)已被證實(shí)[7]，線粒體釋放促細(xì)胞凋亡因子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，上調(diào)凋亡水平響神經(jīng)元凋亡。在細(xì)胞凋亡途徑中的線粒體凋亡途徑中，細(xì)胞色素C的釋放至胞漿，與凋亡誘導(dǎo)因子相互作用，進(jìn)一步活化天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)，Caspase-3是多種細(xì)胞凋亡途徑的必經(jīng)之路，在細(xì)胞凋亡中最關(guān)鍵的因素，Caspase-3接受凋亡信號后裂解為活性的cleaved caspase-3，調(diào)控下游凋亡蛋白，而Bcl-2具有抑制凋亡的作用，Bax/Bcl-2比值是判定細(xì)胞凋亡狀態(tài)的重要標(biāo)志。本試驗(yàn)中模型組大鼠腦組織中cleaved caspase-3、細(xì)胞色素C和Bax/Bcl-2明顯升高，提示升高的cleaved caspase-3、細(xì)胞色素C和Bax/Bcl-2與腦缺血再灌注損傷有關(guān)，給予鞣花酸可以明顯的降低cleaved caspase-3、細(xì)胞色素C和Bax/Bcl-2，推測鞣花酸可能抑制cleaved caspase-3相關(guān)的凋亡，從而降低大鼠缺血區(qū)的凋亡水平減輕缺血再灌注損傷。

本研究的目的是探討腦缺血再灌注損傷大鼠中鞣花酸對PI3K/Akt/NOS通路調(diào)控及其神經(jīng)保護(hù)作用。PI3K/Akt通路是機(jī)體內(nèi)經(jīng)典的促增殖、抗凋亡信號，激活的PI3K/Akt通路對于維持正常的凋亡水平，保證神經(jīng)元正常功能具有至關(guān)重要的作用[8]。有文獻(xiàn)報(bào)道PI3K/Akt信號通路參與電針對缺血腦組織的保護(hù)作用[9]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注損傷過程中PI3K/Akt 通路中的P-PI3K/PI3K和P-Akt/Akt升高，信號通路處于抑制狀態(tài)，藥物干預(yù)后激活 PI3K/Akt 信號，P-PI3K/PI3K和P-Akt/Akt下降，過度凋亡受到抑制，局灶性腦缺血再灌注損傷明顯減輕[10]，因而目前認(rèn)為在缺血性腦卒中中PI3K/Akt 通路是一個(gè)很有希望的治療靶點(diǎn)。本試驗(yàn)中模型組P-Akt/Akt顯著下降，提示缺血再灌注中P-Akt表達(dá)比例增加，信號通路處于抑制狀態(tài)，同時(shí)促凋亡蛋白(cleaved caspase-3、細(xì)胞色素C和Bax/Bcl-2)表達(dá)增加，凋亡水平升高；而鞣花酸預(yù)處理組P-Akt/Akt顯著升高，提示缺血再灌注中P-Akt表達(dá)比例下降，信號通路處于激活狀態(tài)，同時(shí)促凋亡蛋白(cleaved caspase-3、細(xì)胞色素C和Bax/Bcl-2)表達(dá)下降，過度凋亡被抑制。從以上試驗(yàn)結(jié)果推測，激活該通路可抑制凋亡過度表達(dá)，減輕缺血再灌注損傷，鞣花酸在腦缺血再灌注損傷大鼠中的腦保護(hù)作用可能是激活PI3K/Akt 信號。與目前研究符合，丹酚酸通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路抑制凋亡，減輕腦缺血再灌注損傷[11]。

Akt主要通過兩種途徑控制細(xì)胞凋亡，一種是通過TSC1/TSC2復(fù)合物和mTOR信號通路來調(diào)控細(xì)胞生長；另一種是作用于CDK 的抑制分子P21和P27，并間接影調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖。NOS是合成NO的重要限速酶，作為PI3K/Akt信號通路中下游靶目標(biāo)之一，在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，缺血是誘導(dǎo)NOS表達(dá)增加的一個(gè)重要因素。適當(dāng)濃度的NO對腦血流的調(diào)節(jié)十分重要，過多的NO與超氧陰離子形成具有強(qiáng)氧化能力的過氧亞硝酸，加重氧化應(yīng)激損傷，表現(xiàn)出神經(jīng)毒性作用。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)是NOS三種亞型之一，在eNOS敲除小鼠的梗死面積明顯增大，提示eNOS可能在腦缺血有一定的保護(hù)作用[12]。本實(shí)驗(yàn)顯示，模型組P-eNOS/eNOS顯著下降，提示缺血再灌注中P-eNOS表達(dá)比例增加，信號通路處于抑制狀態(tài)，同時(shí)促凋亡蛋白(cleaved caspase-3、細(xì)胞色素C和Bax/Bcl-2)表達(dá)增加，凋亡水平升高；而鞣花酸預(yù)處理組P-eNOS/eNOS顯著升高，提示缺血再灌注中P-eNOS表達(dá)比例下降，信號通路處于激活狀態(tài)，同時(shí)促凋亡蛋白(cleaved caspase-3、細(xì)胞色素C和Bax/Bcl-2)表達(dá)下降，過度凋亡被抑制。從以上試驗(yàn)結(jié)果推測，eNOS作為PI3K/Akt信號通路中下游靶目標(biāo)之一，參與激活該的通路從而抑制凋亡過度表達(dá)，減輕缺血再灌注損傷。

鞣花酸可激活PI3K/Akt/eNOS信號通路，抑制缺血再灌注損傷區(qū)神經(jīng)元的凋亡，減輕腦組織損傷，減輕神經(jīng)功能缺損，因此激活PI3K/Akt/eNOS通路可能是鞣花酸治療缺血性卒中的藥理機(jī)制之一。但是本研究目前只進(jìn)行初步探討，鞣花酸對PI3K/Akt通路的下游信號的調(diào)控機(jī)制涉及較少，需要進(jìn)一步深入研究鞣花酸對在缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制。