易勝男，孔小艷△，錢錦花，呂敏娟，朱 莉，茍瀟*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)系，云南 玉溪 653106 )

藏豬是高原重要畜種，也是典型的高原動(dòng)物。通過(guò)長(zhǎng)期自然選擇和人工選擇，藏豬表現(xiàn)出一系列高原適應(yīng)的表型和生理特征[1-2]，具有長(zhǎng)而濃密的鬃毛，其肺動(dòng)脈平滑肌含量豐富，血紅蛋白與氧結(jié)合和釋放的能力顯著高于低地豬種[3]，遺傳背景單一，是研究低氧適應(yīng)機(jī)制的重要遺傳資源[4-5]。

內(nèi)皮PAS1蛋白(endothelial PAS domain protein 1，EPAS1)基因編碼低氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子2α亞基(HIF-2α)，該蛋白是低氧調(diào)控通路核心轉(zhuǎn)錄因子[6]。近年對(duì)高原民族和動(dòng)物進(jìn)行全基因組掃描，EPAS1基因是最廣泛報(bào)道的低氧正選擇基因。包括藏族人[7-8]、藏羚羊[9]、雪豹[10]、鹿鼠[11]、牦牛[12]、藏獒[13-14]等。目前EPAS1基因與藏豬低氧適應(yīng)性關(guān)系仍不清楚。本研究選擇滇藏線連續(xù)海拔(800-1800-3300 m)豬種和歐系杜洛克豬為對(duì)照，通過(guò)檢測(cè)EPAS1基因編碼區(qū)的遺傳變異，篩選其低氧調(diào)控活性位點(diǎn)，通過(guò)檢測(cè)EPAS1基因mRNA和蛋白表達(dá)量，探討其低氧適應(yīng)性表達(dá)，明確了EPAS1基因與藏豬低氧適應(yīng)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

迪慶藏豬10頭(海拔3 300 m左右)，采自云南省香格里拉市；撒壩豬10頭(海拔1 800 m左右)，采自楚雄州種豬種雞場(chǎng)；滇南小耳豬10頭(海拔800 m左右)，采自滇南小耳豬保種場(chǎng)；杜洛克豬10頭(海拔800 m左右)，采自西雙版納州；每組公母比例1:1。使用EDTA抗凝真空采血管，采集前腔靜脈血5 mL，用于DNA提??；屠宰8月齡藏豬和杜洛克豬各5頭，取心、肝、肺、腎、肺動(dòng)脈、肌肉組織，液氮保存，用于總RNA的提??；取肺組織樣品，中性固定液保存，用于免疫組化試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA多態(tài)檢測(cè) 所有采集的血液樣本用BioTeke全血基因組DNA快速提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)提取基因組DNA。根據(jù)豬EPAS1基因序列(GenBank登錄號(hào)：NC_010445.4)，針對(duì)其16個(gè)外顯子區(qū)，用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì) PCR 引物序列，引物由北京迪納興科生物科技有限公司合成(表1)。PCR總體積為25 μL，含2 μL DNA(30 ng/μL)、1 μL 10 μmol/L正向引物、1 μL 10 μmol/L反向引物、11 μL Mix(北京天根生物技術(shù)公司)、10 μL ddH2O(雙蒸餾水)。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物在上海美季生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 豬EPAS1基因的引物Table 1 Prime sequences of EPAS1 gene in pigs

1.2.2 熒光定量PCR 所采的組織樣用RT-PCR試劑盒PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Ereser (Perfect Real Time)，Takara code DRR047A(大連寶生物公司)提取總RNA。用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，根據(jù)EPAS1基因的mRNA序列(GenBank登錄號(hào)：NM_001097420)設(shè)計(jì)定量引物，上游引物 GACAGAGTCCCCGG，下游引物 TCAGGTTCCTCCTTC，產(chǎn)物長(zhǎng)度120 bp；根據(jù)內(nèi)參基因28S rRNA mRNA序列(GenBank登錄號(hào)：DQ297674)設(shè)計(jì)定量引物，上游引物TGGAATGCGAGTGC，下游引物CCACCGTCCTGCTGT，產(chǎn)物長(zhǎng)度142 bp，由北京迪納興科生物科技有限公司合成。熒光定量PCR反應(yīng)總體積25 μL，含2 μL cDNA(約30 ng/μL)、1 μL 10 μmol/L正向引物、1 μL 10 μmol/L反向引物、12.5 μL SYBR Green Master(ROX)、8.5 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增在Bio-Red CFX96TM Real-Time PCR Systems上進(jìn)行，50 ℃激活熒光信號(hào)2 min，95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，60 ℃/55 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。

1.2.3 免疫組織化學(xué)試驗(yàn) 取藏豬、杜洛克豬的肺組織制成石蠟切片(厚度4～8 μm)，用于免疫組織化學(xué)試驗(yàn)。兔IgG作為HIF-2α抗體，滴加稀釋的一抗(兔IgG)在肺組織，37 ℃環(huán)境下孵育1 h左右，PBS洗滌3次，滴加生物素標(biāo)記羊抗鼠/兔IgG，置于20～37 ℃環(huán)境中20 min，PBS洗滌3次。操作步驟參照即用型SABC二抗試劑盒和DAB顯色試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。陰性對(duì)照試驗(yàn)不加兔IgG。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 DNA序列由BioEdit軟件比對(duì)，篩選變異位點(diǎn)。采用Excel 2010和SAS 9.0軟件的卡方檢驗(yàn)?zāi)K計(jì)算等位基因頻率。采用Haploview軟件估算單倍型頻率和連鎖不平衡分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EPAS1基因外顯子突變位點(diǎn)SNP檢測(cè)分析

對(duì)EPAS1基因編碼區(qū)(16個(gè)外顯子)進(jìn)行測(cè)序，共檢測(cè)到21個(gè)SNP(MAF>0.1)，均為同義突變。此外，發(fā)現(xiàn)在第14外顯子A83409G為錯(cuò)義突變，密碼子AGT突變成GGT，為絲氨酸變成甘氨酸，但是藏豬G等位基因的頻率為0.800，杜洛克豬、滇南小耳豬G等位基因頻率分別為1、0.600，藏豬突變等位基因的頻率與低地杜洛克豬、滇南小耳豬的突變等位基因頻率不存在顯著性差異(P>0.05)，所以不是低氧優(yōu)勢(shì)位點(diǎn)，不計(jì)入21個(gè)SNP中。

表2列出了藏豬、撒壩豬、滇南小耳豬和杜洛克豬EPAS1基因21個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率，發(fā)現(xiàn)在C61310T(第6外顯子)位點(diǎn)，藏豬T等位基因頻率是0.600，平原杜洛克豬只有CC 1種基因型，T等位基因頻率為0，但是海拔1 800 m的撒壩豬和800 m的滇南小耳豬T的等位基因的分別為0.900和0.967。G81330A(內(nèi)含子)處，藏豬、撒壩豬、滇南小耳豬和杜洛克豬的A等位基因頻率分別為0.438、0.880、0.080、0。這兩個(gè)SNP的突變頻率沒(méi)有隨海拔的變化而變化，因此，這兩個(gè)等位基因的分布與海拔無(wú)關(guān)，不是低氧選擇候選的位點(diǎn)。同理，對(duì)其他位點(diǎn)的分析比較，外顯子位點(diǎn)(T81631C、A81922G、T81955C和C81992T)和內(nèi)含子位點(diǎn)(T81302C、T81321A、C81358T、A81476G、A81490G、C81491A、T81534C、G82070A和C82150T)等位基因頻率并未呈現(xiàn)海拔趨勢(shì)，所以推測(cè)這些位點(diǎn)也不是低氧選擇候選位點(diǎn)。在A79520G(第10外顯子)處，藏豬G等位基因頻率為0.731，撒壩豬為0.500，滇南小耳豬為0.333，杜洛克為0，基因頻率有海拔趨勢(shì)。第11外顯子T80174C位點(diǎn)的C等位基因?yàn)椴刎i獨(dú)有，為海拔趨勢(shì)位點(diǎn)。同理，內(nèi)含子位點(diǎn)C81133T的基因頻率有海拔趨勢(shì)，外顯子位點(diǎn)C80195T，內(nèi)含子位點(diǎn)A79997G和T80081C具有藏豬獨(dú)有等位基因，為海拔趨勢(shì)位點(diǎn)。但以上6個(gè)海拔趨勢(shì)位點(diǎn)之間關(guān)系不清楚，需要通過(guò)單倍型分析探討低氧選擇的搭載效應(yīng)。

表2 4個(gè)豬群體EPAS1基因21個(gè)SNP位點(diǎn)基因頻率海拔分布Table 2 Elevational frequency distribution of 21 SNPs of EPAS1 gene in 4 pig breeds

2.2 連鎖不平衡分析和單倍型分析

運(yùn)用 Haploview 軟件對(duì)EPAS1基因21個(gè)SNP位點(diǎn)(MAF>0.1)進(jìn)行單倍型分析，分群構(gòu)建LD Plot圖(圖1)。圖中方框顏色由淺到深代表r2值增加。如圖1所示，這些位點(diǎn)間連鎖不平衡程度未呈現(xiàn)明顯海拔趨勢(shì)，位點(diǎn)間未發(fā)生低氧選擇的搭載效應(yīng)。

2.3 EPAS1基因mRNA表達(dá)結(jié)果分析

對(duì)杜洛克豬和藏豬的心、肝、肺、腎、肺動(dòng)脈、肌肉組織進(jìn)行EPAS1基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)，結(jié)果表明，EPAS1表達(dá)量在肺動(dòng)脈最高(表3)；在心、肝、肺、肌肉組織中藏豬表達(dá)量均與杜洛克豬無(wú)明顯差異(P>0.05)(表3、圖2)，均在2倍之內(nèi)。

2.4 免疫組織化學(xué)試驗(yàn)結(jié)果分析

基于EPAS1基因主要在肺表達(dá)，本研究對(duì)迪慶藏豬和低地杜洛克豬的肺組織通過(guò)免疫組化檢測(cè)EPAS1基因編碼蛋白HIF-2α的蛋白表達(dá)水平。圖3為EPAS1在藏豬肺組織中蛋白表達(dá)的免疫組化結(jié)果，其中箭頭所指的棕黃色或棕褐色顆粒為免疫陽(yáng)性信號(hào)。而積分光密度結(jié)果顯示，在肺組織中，藏豬HIF-2α蛋白表達(dá)量(16241.74)與杜洛克豬(15720.36)并無(wú)顯著性差異(P<0.05)。

3 討 論

EPAS1與各種疾病有關(guān)，普遍存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，參與疾病的病理生理過(guò)程[15-17]。在高原適應(yīng)研究中，作為HIF通路核心調(diào)控基因，EPAS1是在高原民族和動(dòng)物中篩選到的明星基因。EPAS1基因可以下調(diào)藏族人群在高原低氧條件中的血紅蛋白水平和肺動(dòng)脈壓，從而降低自身血液黏滯度，提高血流通暢性，鈍化高原代償性反應(yīng)，逐漸適應(yīng)高原低氧環(huán)境[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)藏雞的EPAS1基因編碼區(qū)有一個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)(rs316126786G→A)，對(duì)應(yīng)氨基酸從Tyr突變?yōu)镃ys，基因頻率與海拔明顯相關(guān)，認(rèn)為是藏雞高海拔低氧適應(yīng)重要的功能位點(diǎn)[20]。HIF通路在牦牛適應(yīng)高原低氧環(huán)境中也發(fā)揮了重要作用，EPAS1在肺高血壓、血管滲透和紅細(xì)胞生成方面有重要作用[21]。在高原綿羊中發(fā)現(xiàn)EPAS1基因第12、16外顯子區(qū)有與紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度和紅細(xì)胞平均體積增加相關(guān)位點(diǎn)[23-24]。研究連續(xù)海拔的山羊[25]、綿羊[26]EPAS1基因中都含有隨海拔變化基因頻率也隨之變化的海拔趨勢(shì)位點(diǎn)，還存在非同義突變。牦牛的低氧適應(yīng)基因試驗(yàn)中，以三江黃牛作為對(duì)照組，連續(xù)海拔的牦牛作為試驗(yàn)組，篩選EPAS1基因的SNPs，發(fā)現(xiàn)3個(gè)牦牛特異性SNPs，存在低氧優(yōu)勢(shì)單倍型，但是3個(gè)SNPs的基因頻率并不是海拔趨勢(shì)位點(diǎn)[22]。不同海拔高度引起低氧環(huán)境差異，EPAS1基因與藏族高海拔適應(yīng)也有關(guān)聯(lián)，也存在海拔趨勢(shì)位點(diǎn)[27]?？梢酝茰y(cè)低氧環(huán)境對(duì)EPAS1基因的選擇是一個(gè)連續(xù)過(guò)程。有關(guān)于藏豬的研究中，在董坤哲的研究中選取了2個(gè)海拔藏豬與3種平原豬篩選EPAS1基因SNPs，發(fā)現(xiàn)14個(gè)SNPs，有4個(gè)位點(diǎn)的基因頻率在藏豬和平原豬之間有很大不同，有3個(gè)位點(diǎn)的基因頻率有海拔趨勢(shì)，說(shuō)明EPAS1基因可能與海拔環(huán)境相關(guān)，可以在低適應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮作用[28-29]。

表3 不同類群豬種EPAS1基因的相對(duì)表達(dá)量(Ct值)Table 3 EPAS1 gene expression level in different pig breeds(Ct value)

圖2 不同類群豬種間EPAS1基因的mRNA表達(dá)量的比較
Fig.2EPAS1 mRNA gene expression comparison between different pig breeds

以前藏豬低氧相關(guān)報(bào)道多以藏豬與低地豬種相比較，其分化位點(diǎn)不能排除種群間固有分化。本研究選取滇藏線連續(xù)海拔豬種藏豬、撒壩豬、滇南小耳豬和歐系杜洛克豬為對(duì)照材料，檢測(cè)EPAS1基因編碼功能位點(diǎn)和表達(dá)量變化，探討該明星基因在藏豬低氧適應(yīng)中的角色。在低氧相關(guān)位點(diǎn)篩選上，初步確定有21個(gè)SNP，其中6個(gè)位點(diǎn)呈現(xiàn)海拔趨勢(shì)。為了驗(yàn)證海拔趨勢(shì)位點(diǎn)是否為低氧正選擇位點(diǎn)，通過(guò)單倍型連鎖不平衡分析，6個(gè)海拔趨勢(shì)位點(diǎn)間連鎖不平衡程度并未呈現(xiàn)海拔趨勢(shì)，未呈現(xiàn)低氧選擇的遺傳搭載效應(yīng)，結(jié)果表明藏豬EPAS1基因不存在編碼功能位點(diǎn)。作為低氧調(diào)控因子，本研究以藏豬和杜洛克為材料，利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了EPAS1基因低氧適應(yīng)性表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)藏豬EPAS1基因在心臟、肝臟、肺、肌肉組織中mRNA表達(dá)量相較于杜洛克略高，但無(wú)顯著差異，免疫組化結(jié)果也顯示EPAS1蛋白表達(dá)量相較于杜洛克略高，亦無(wú)顯著差異。結(jié)果與以前藏豬與低地豬表達(dá)量結(jié)果一致[29-31]。本研究結(jié)果初步表明，作為低氧適應(yīng)明星基因，EPAS1基因在藏豬中未呈現(xiàn)低氧適應(yīng)性表達(dá)譜，可能未受到低氧正選擇，推測(cè)藏豬具有不同的低氧適應(yīng)分子基礎(chǔ)。藏豬的低氧適應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的性狀，在激活和穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子外，還會(huì)涉及到表觀調(diào)控機(jī)制，如DNA甲基化、組蛋白修飾等，調(diào)控基因的選擇性表達(dá)，影響器官的發(fā)育和個(gè)體生長(zhǎng)[32]；且EPAS1有參與低氧有關(guān)的下游基因的表達(dá)調(diào)控[33]，如EPO、VEGF、VEGFR等，可以與相關(guān)基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，從而更好的評(píng)價(jià)EPAS1基因在低氧調(diào)控機(jī)制中的作用。