張效川，張 夢(mèng)，郭 丹，馬杏娜，補(bǔ)琪琪，張 磊，李 廣

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100)

神經(jīng)降壓素(neurotensin，NTS)廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)和激素樣神經(jīng)肽。NTS通過作用于3個(gè)受體(NTSR1、NTSR2、NTSR3/sortilin)發(fā)揮生理和病理功能[1]，NTS/NTSR1參與調(diào)節(jié)多種腫瘤(例如乳腺癌、前列腺癌和肺癌等)的增殖、侵襲和分化過程[2-6]。Testin(TES)基因最早于1995年被發(fā)現(xiàn)，在睪丸中的表達(dá)量最高，但在其他組織中也有廣泛的表達(dá)并具有多種生物學(xué)功能。在人類中，TES基因位于染色體7q31.2的FRG7G區(qū)，由于其在多種惡性腫瘤中缺乏雜合性，被認(rèn)為是抑癌基因。此外，TES位于細(xì)胞質(zhì)中，是局部粘連的組成部分[7]，參與細(xì)胞間的相互作用[8-11]。TES由1個(gè)PET結(jié)構(gòu)域(在一些活性未知的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn))和3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)排列的LIM結(jié)構(gòu)域(結(jié)合不同蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)相互作用基序)組成。LIM結(jié)構(gòu)域是細(xì)胞增殖、命運(yùn)決定、分化的重要調(diào)節(jié)因子。子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(endometrial epithelial cells，EEC)會(huì)發(fā)生周期性變化，此過程既受外部因素和子宮內(nèi)膜微環(huán)境(例如激素、細(xì)胞生長(zhǎng)因子等)的調(diào)節(jié)[12]，又受子宮內(nèi)膜特異基因的精密調(diào)控，不同階段特異性基因的表達(dá)是形成EEC細(xì)胞階段特異性結(jié)構(gòu)及發(fā)揮特定細(xì)胞功能的基礎(chǔ)。NTS與TES對(duì)子宮內(nèi)膜生物學(xué)過程調(diào)控作用的研究較少，關(guān)于兩者相互作用的研究幾乎沒有。此試驗(yàn)通過構(gòu)建NTS和TES過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染EEC，檢測(cè) EEC 的凋亡率及p38和Caspase-8蛋白表達(dá)量，為進(jìn)一步探究NTS和TES調(diào)控奶山羊EEC的凋亡機(jī)理提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)醫(yī)學(xué)院產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建好的體外奶山羊EEC細(xì)胞系。

1.2 pcDNA3.1過表達(dá)載體的構(gòu)建

查詢奶山羊NTS、TES基因編碼區(qū)序列，通過 PCR Mix (Genstar)對(duì)其CDS 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，分別用XhoI 和KpnI對(duì)擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，用T4DNA連接酶(Takara)及 pcDNA3.1(+)進(jìn)行連接。為了檢測(cè)TES的表達(dá)水平是否受NTS調(diào)控，將pcDNA3.1-NTS載體轉(zhuǎn)染到EECs中。將pcDNA3.1-TES載體轉(zhuǎn)染到EECs中，觀察TES對(duì)NTS的調(diào)節(jié)。構(gòu)建psiCHECK-2-NTS載體，引物:5'-GCCTCGAGCACTTAATGGGTTGTTGA-3'(F)和5'-GCGCGGCCGCTGATGGCTGTT GTCTTTT-3'(R)。構(gòu)建pcDNA3.1-NTS載體，引物: 5'-CCCTCGAGATGATGGCAGGAATGAAAATC-3'(F)和5'-GGGGTACCTCAGTAGTAGTAAGAACCTCTT TTGAGTTG-3'(R)。

1.3 EEC的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

在37 ℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)EEC細(xì)胞系，并提供含有10 %胎牛血清的DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)液(Gibco) 。將pcDNA3.1-NTS、pcDNA3.1-TES及pcDNA3.1分別轉(zhuǎn)染至EEC，收集轉(zhuǎn)染 24 h后的細(xì)胞用于細(xì)胞凋亡的檢測(cè)試驗(yàn)；收集轉(zhuǎn)染 48 h 后的細(xì)胞用于Western Blot試驗(yàn)。

1.4 Real-time PCR 和Western Blot檢測(cè)

用Trizol(Invitrogen) 等提取細(xì)胞RNA；使用StarScript II第一鏈cDNA合成試劑盒 (Genstar) 獲取互補(bǔ)DNA；使用2×RealStar Power SYBR Mixture(Genstar)進(jìn)行qPCR，Ct值通過 CFX Connect實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad)，并使用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。 以下引物用于檢測(cè)NTS mRNA水平：5'-TCAGTAAGGCAAGTGTTC-3'(F)和5'-CCATCTAAGGCAGCAGGA-3'(R)。

使用RIPA緩沖液(Heart)提取收集的EEC蛋白，并通過SDS-PAGE分離。NTS一抗來自BBI(D121026)。caspase-8、P38 MAPK和β-actin一抗和二抗購(gòu)自Beyotime。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

通過胰蛋白酶收集轉(zhuǎn)染24 h 后的細(xì)胞，1 000 r/min 離心10 min，用預(yù)冷的 PBS 沖洗2 次，經(jīng)Annexin V-FITC / PI細(xì)胞凋亡試劑盒(Multi Sciences)處理，使用流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur)檢測(cè)。重復(fù)3次。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過t檢驗(yàn)進(jìn)行差異比較，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鑒定NTS、TES基因

對(duì)NTS和TES基因CDS區(qū)域序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1，克隆片段大小與NTS基因CDS區(qū)全序列(513 bp)以及TES基因 CDS 區(qū)全序列(1 266 bp)相符。

2.2 檢測(cè)NTS和TES過表達(dá)載體效率

pcDNA3.1-NTS、pcDNA3.1-TES和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染EEC后提取RNA和蛋白質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果見圖2。由圖2A、2B可知，pcDNA3.1-NTS與pcDNA3.1-TES轉(zhuǎn)染EEC后，NTS與TESmRNA表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；Western Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pcDNA3.1-NTS轉(zhuǎn)染后的NTS蛋白量顯著高于pcDNA3.1組(P<0.05)，pcDNA3.1-TES過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后的TES蛋白量顯著高于pcDNA3.1組(P<0.05)(圖2C、2D)。由此可見，過表達(dá)載體pcDNA3.1-NTS和pcDNA3.1-TES構(gòu)建成功，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 NTS和TES過表達(dá)對(duì)EEC凋亡的影響

流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果見圖3。與pcDNA3.1相比，pcDNA3.1-NTS 組EEC的凋亡率顯著減低，由43.60% 下降到 34.79%(P<0.05)，pcDNA3.1-TES組EEC凋亡率也同樣顯著下降，由43.60%下降到34.52%(P<0.05)，表明NTS和TES過表達(dá)抑制EEC凋亡。

2.4 過表達(dá)NTS、TES對(duì)EEC凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

為探究NTS、TES對(duì)EEC凋亡作用的分子機(jī)理，通過Western Blot試驗(yàn)檢測(cè)了NTS、TES對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)標(biāo)志性蛋白的影響，包括caspase-8和P38 MAPK，結(jié)果如圖4所示。與對(duì)照組pcDNA3.1相比，pcDNA3.1-NTS、pcDNA3.1-TES中Caspase-8的蛋白表達(dá)量都極顯著降低(P<0.01)；兩個(gè)過表達(dá)組中p38的蛋白表達(dá)量和磷酸化的p38水平都顯著高于空載體pcDNA3.1組(P<0.05)。由此可知，過表達(dá)NTS、TES對(duì)Caspase-8有抑制作用，而對(duì)p38有促進(jìn)作用。

2.5 NTS過表達(dá)對(duì)TES表達(dá)的影響

將pcDNA3.1-NTS載體轉(zhuǎn)染到EEC后，經(jīng)RT-qPCR和Western blot檢測(cè)，TESmRNA和TES蛋白水平見圖5。與pcDNA3.1組相比較，當(dāng)NTS過表達(dá)時(shí)，TES的mRNA極顯著降低，僅為pcDNA3.1組的1/10左右(圖5A)，TES的蛋白質(zhì)表達(dá)水平也降低至一半左右(圖5B)。由此可知，過表達(dá)基因NTS在mRNA及蛋白水平上都可抑制TES的表達(dá)。

2.6 TES過表達(dá)對(duì)NTS表達(dá)的影響

如圖6所示，將pcDNA3.1-TES轉(zhuǎn)染至EEC后，NTS的mRNA水平?jīng)]有明顯變化(P>0.05)(圖6A)，但是NTS的蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)(圖6B)，說明TES過表達(dá)對(duì)NTS表達(dá)有抑制作用。

3 討 論

凋亡是一種細(xì)胞程序性死亡的生理過程。細(xì)胞凋亡可有多種因素調(diào)控發(fā)生。除一些細(xì)胞外因素可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，相關(guān)凋亡基因通過多種凋亡信號(hào)通路也可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程。細(xì)胞凋亡相關(guān)基因可分為促進(jìn)凋亡基因(如C-myc、P53、Fas等)和抑制凋亡基因(如Bcl-2等)兩種?，F(xiàn)有研究中對(duì)于細(xì)胞凋亡過程調(diào)控多種細(xì)胞生長(zhǎng)的作用有較深的研究，但對(duì)其具體的調(diào)控機(jī)理仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞系中TES過表達(dá)激活 Caspase-8從而激活其所參與的凋亡通路[13]；Li 等[14]研究發(fā)現(xiàn)TES激活p38的作用從而抑制結(jié)直腸癌的進(jìn)一步的發(fā)生過程；研究發(fā)現(xiàn)NTS可促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞增殖；NTS與結(jié)腸癌等惡性腫瘤有極其密切的聯(lián)系[15]。目前對(duì)NTS和TES的研究多集中于單個(gè)基因的功能，且主要集中在癌癥方面[16-17]，其中NTS和TES之間的相互作用及其對(duì)EEC凋亡作用的研究未見有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，NTS和TES的過表達(dá)對(duì)EEC凋亡有抑制作用，增加p38的表達(dá)，而抑制Caspase-8的表達(dá)。通過 Real-time PCR和Western Blot等試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)NTS過表達(dá)顯著抑制TES在mRNA 和蛋白水平的表達(dá)，而TES過表達(dá)對(duì)NTSmRNA表達(dá)水平無(wú)顯著影響，但可以顯著抑制NTS蛋白水平的表達(dá)，由此可知，NTS和TES在EEC 中存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，但NTS和TES的這種負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用是否具有普遍性，在其它組織或細(xì)胞中是否也同樣存在需要更多的研究證明。

4 小 結(jié)

過表達(dá)NTS和TES都對(duì)EEC凋亡具有顯著抑制作用，對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-8和p38的調(diào)控作用相同，增加p38的表達(dá)，而抑制Caspase-8的表達(dá)；在EEC中NTS和TES存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，在mRNA和蛋白水平NTS過表達(dá)顯著抑制TES的表達(dá)，而TES過表達(dá)也會(huì)抑制NTS 蛋白表達(dá)，但對(duì)其mRNA水平無(wú)顯著影響。