郭富強(qiáng),張燕軍*,王瑞軍,李學(xué)武,張俊杰,徐冰冰,張家新,李金泉，2，3，4

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018;2. 農(nóng)業(yè)部肉羊遺傳育種重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3. 內(nèi)蒙古自治區(qū)動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018;4內(nèi)蒙古自治區(qū)山羊遺傳育種工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

中國山羊精液冷凍保存的研究是從20世紀(jì)80年代開始，至今尚未形成一套完整的山羊精液冷凍保存技術(shù)體系。由于山羊精子對低溫非常敏感，低溫抗打擊能力差，凍融后部分精子的結(jié)構(gòu)完整性被破壞，導(dǎo)致精子活力低，利用凍精人工授精后母羊受胎率低，不能應(yīng)用于實際生產(chǎn)當(dāng)中。為了提高精液凍融后精子的活力及精子結(jié)構(gòu)的完整性，學(xué)者們在精液冷凍保存稀釋液成分以及冷凍程序方面做了大量的研究。本文對山羊凍精技術(shù)的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為其進(jìn)一步研究提供一定的理論參考。

1 冷凍保護(hù)劑對精液凍融后品質(zhì)的影響

冷凍保護(hù)劑在精液冷凍保存中可以明顯提高精子凍融后的活率。

1.1 滲透性冷凍保護(hù)劑

滲透性冷凍保護(hù)劑可以通過精子細(xì)胞膜滲透到精子細(xì)胞內(nèi)部，一方面提高了精子細(xì)胞內(nèi)部滲透壓，防止精子細(xì)胞脫水而導(dǎo)致精子大量死亡；另一方面增加了精子細(xì)胞內(nèi)溶液濃度，從而降低了溶液的冰點，減少冰晶的形成，DMSO、甘油、乙二醇是目前最常用的滲透性冷凍保護(hù)劑。楊素芳等[1]研究發(fā)現(xiàn)，稀釋液中添加6%和7%的甘油凍后效果顯著好于3%和5%。甘油在常溫下對精子有毒害作用，不僅會損傷精子頂體，還會破壞某些酶，所以近年來學(xué)者們?yōu)榱藢ふ夷軌虼娓视偷睦鋬霰Ｗo(hù)劑做了很多研究。Najafi等[2]報道在以大豆卵磷脂為主的稀釋液中添加3%、5%和7%的乙二醇冷凍解凍后精子活率分別為52.0%、53.0%和56.2%，差異不顯著。席利萌等[3]研究表明，在稀釋液中添加3%和6%的乙二醇與6%的甘油都能明顯提高山羊精子凍融后品質(zhì)，其中3%乙二醇可以替代甘油。

1.2 非滲透性冷凍保護(hù)劑

卵黃、大豆卵磷脂以及一些糖類是目前普遍使用的非滲透性冷凍保護(hù)劑。由于非滲透性冷凍保護(hù)劑不能穿過細(xì)胞膜，提高了細(xì)胞膜外溶液濃度，導(dǎo)致細(xì)胞膜外滲透壓高于細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞內(nèi)的水分向外流失，減少了細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而可以減少精液冷凍過程中受到的損傷。但是其對精子也具有一定的毒副作用。山羊精漿中含有卵黃凝集酶，可以使卵黃中的卵磷脂水解為溶血卵磷脂和脂肪酸，溶血卵磷脂對精子有毒副作用，脂肪酸的釋放會使精液pH下降，對精液凍融后的品質(zhì)不利。卵黃是動物源性的冷凍保護(hù)劑，可能攜帶著病原微生物，存在生物安全隱患，所以近年來學(xué)者們試圖通過尋找植物源性的冷凍保護(hù)劑替代卵黃。大豆卵磷脂(Soybean lecithin,SL)來源于植物，作為一種非滲透性冷凍保護(hù)劑在國外已經(jīng)廣泛應(yīng)用在牛、馬、羊、犬等家畜精液冷凍保存中，在牛上已經(jīng)進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)。目前在山羊上冷凍保護(hù)劑主要還是以甘油、乙二醇、卵黃、大豆卵磷脂為主，添加量為甘油5%～7%，乙二醇3%～6%，卵黃10%～25%。國內(nèi)關(guān)于大豆卵磷脂作為羊精液冷凍保護(hù)劑的研究報道比較少，國外有文獻(xiàn)報道羊添加量最高為3.5%，Salmani等[4]研究發(fā)現(xiàn)，以卵黃為主的稀釋液凍后精子活率為66.89%、質(zhì)膜完整率為64.27%，而以大豆卵磷脂為主的稀釋液分別為63.71%和62.93%；Forouzanfar等[5]報道在羊精液稀釋液中添加1%大豆卵磷脂和20%卵黃都能夠提高精子凍后活力和存活率且差異不顯著；而 Najafi等[6]研究表明，在羊精液冷凍稀釋液中添加1.5%的大豆卵磷脂冷凍效果要比1%濃度好。

糖類可以和精子細(xì)胞膜磷脂結(jié)合，在細(xì)胞膜外形成保護(hù)膜，降低精子在冷凍過程中的損傷程度。單糖是一種小分子碳水化合物，可以滲透到細(xì)胞內(nèi)直接被細(xì)胞代謝為精子供能。雙糖不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，提高了細(xì)胞膜外滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)水分向外流失，從而減少了細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。多糖類物質(zhì)不僅能夠調(diào)節(jié)滲透壓，也是一種抗氧化劑。De Leeuw等[7]研究表明，在牛精液冷凍稀釋液中添加蔗糖可以顯著提高精子活率和頂體完整率，而添加相同濃度的海藻糖效果沒有蔗糖好。權(quán)國波等[8]則報道在云南半細(xì)毛羊精液冷凍稀釋液中添加100 mmol/L海藻糖凍融后精子活力為46.07%，與蔗糖相比顯著提高了凍融后精子的活力，頂體完整性蔗糖與海藻糖無顯著差異，但都可以明顯改善精子的頂體狀態(tài)。阿布力克木·提力瓦爾迪[9]報道含有蔗糖的多浪羊冷凍稀釋液解凍后精子活率顯著高于含有乳糖的稀釋液，其中添加4 g/mL蔗糖組解凍后精子活率為52%，顯著高于1.53和3.6 g/mL乳糖組。阿布力孜·吾斯曼等[10]研究的結(jié)果與上述一致，對野生盤羊與巴什拜羊雜交F1代的精液進(jìn)行冷凍保存，發(fā)現(xiàn)添加蔗糖的稀釋液精液凍融后精子活率為48.6%、畸形率11.20%、頂體完整率為58.4%,其效果比添加乳糖和只添加葡萄糖的稀釋液冷凍保存效果好。冷凍稀釋液中糖的種類會顯著影響精液凍融后品質(zhì)，目前一般添加的是單糖和雙糖。

2 抗氧化劑對精液凍融后品質(zhì)的影響

抗氧化劑分為酶類抗氧化劑和非酶類抗氧化劑，通過在精液冷凍稀釋液中添加合適劑量的抗氧化劑可以顯著提高精液凍后品質(zhì)。

2.1 酶類抗氧化劑對精液凍融后品質(zhì)的影響

2.2 非酶類抗氧化劑對精液凍融后品質(zhì)的影響

非酶類抗氧化劑非常多，學(xué)者們主要對番茄紅素(Lycopene，LP)、維生素C、褪黑素(MLT)、維生素E、α-硫辛酸(Alpha-Lipoic acid，ALA)以及一些植物多糖類在冷凍稀釋液中的作用進(jìn)行了大量研究。維生素E是一種常用的抗氧化劑，可以抑制氧自由基的形成，阻止細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護(hù)精子膜結(jié)構(gòu)完整性；還可以清除自由基，防止精子發(fā)生冷休克。李志軍等[14]在絨山羊精液稀釋液中添加0.8 mg/mL 維生素E后，精子凍融后的活率可達(dá)38.35%，顯著高于不添加組(32.86%)，凍融后精子畸形率為12.40%，顯著低于不添加組(15.03%)。權(quán)富生等[15]在薩能奶山羊稀釋液中添加維生素E顯著提高了精子凍后的頂體完整率，凍后活力有所提高，但是效果不顯著。而Vichas等[16]研究發(fā)現(xiàn)在羊稀釋液中添加α-生育酚對精液凍后活力和質(zhì)膜完整性沒有影響。Banday等[17]報道在羊精液冷凍稀釋液中添加 40 mmol/L?；撬峥梢燥@著提高精子凍后活力(66.66%)。Omur和Coyan[18]在美利奴羊精液稀釋液中添加甲硫氨酸(1 mmol/L) 、姜黃素(1和2 mmol/L) 、鞣花酸(1和2 mmol/L)，與對照組和其他各組相比，顯著提高了精子質(zhì)膜完整性和線粒體活性。綠茶提取物是存在于綠茶葉片中的一種活性成分，其中含有茶多酚(Green Tea Polyphenols, GTP)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有大量的酚羥基，可以提供大量的活潑氫使自由基滅活，使自身保持較高的穩(wěn)定性進(jìn)而清除細(xì)胞中的自由基以及抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高精子凍融后的品質(zhì)。Mehdipour等[19]在以大豆卵磷脂和甘油為主的稀釋液中添加綠茶提取物(10 mg/L)顯著提高了總運動精子數(shù)、直線前進(jìn)精子數(shù)、精子質(zhì)膜完整性、線粒體活性，同時也降低了精子的凋亡率以及MDA水平。番茄紅素具有很強(qiáng)的抗氧化性，是目前已知的最強(qiáng)抗氧化劑之一，也是類胡蘿卜素的一種，具有很強(qiáng)的清除自由基的能力，其抗氧化作用是β-胡蘿卜素的20倍、維生素E的100倍，在預(yù)防心腦血管疾病、抑制癌細(xì)胞擴(kuò)散、防止細(xì)胞DNA受到自由基損害、延緩衰老等方面有著重要的作用。王艷華等[20]在山羊精液冷凍稀釋液中添加1.0 mg /mL 番茄紅素顯著提高了精子凍后品質(zhì)，精子活率可達(dá)52.04%，SOD、CAT、GSH-Px的活性顯著高于對照組。李方舟等[21]研究結(jié)果表明，稀釋液中單獨添加及混合添加海帶多糖和枸杞多糖都能提高山羊精液凍后品質(zhì)。Toker等[22]將1 mmol/L半胱氨酸添加到羊稀釋液中，與對照組相比，顯著提高了精子活力和頂體完整率，降低了MDA水平。

通過在羊精液稀釋液中單獨添加以及混合添加合適劑量的抗氧化劑都可以顯著提高精子凍后品質(zhì)，但是不同抗氧化劑對不同品種羊的效果差異很大，還需要進(jìn)一步深入研究和分析其內(nèi)在的分子調(diào)節(jié)機(jī)制，從而更好地選擇合適的抗氧化劑來提高精子凍融后的品質(zhì)。

3 不同稀釋比例、平衡時間、冷凍-解凍程序?qū)簝鋈诤笃焚|(zhì)的影響

冷凍-解凍程序主要是指在精液稀釋、平衡之后到液氮冷凍保存這一段時間內(nèi)采用的冷凍操作方法以及解凍的水浴溫度與水浴時間，是精液冷凍保存技術(shù)中重要的一環(huán)，對精子凍后品質(zhì)的影響非常大。目前關(guān)于精液的稀釋倍數(shù)、平衡時間、平衡方法、熏蒸時間、解凍溫度等對精子凍后質(zhì)量的影響已經(jīng)有很多的研究報道。牧人等[23]報道山羊細(xì)管冷凍精液的效果顯著好于顆粒凍精，精子凍后活力可達(dá)54.1%。薛昌安[24]通過對山羊精液冷凍-解凍程序的優(yōu)化，采用兩步稀釋法、降溫平衡4.5 h、距離液氮面上方4 cm處熏蒸10 min投入液氮、37 ℃水浴中解凍30 s的方法明顯提高了精子凍后質(zhì)量，凍后活力可達(dá)43.3%。胡潤環(huán)[25]發(fā)現(xiàn)溫度接近4 ℃時，一步稀釋法和兩步稀釋法差異不大，當(dāng)室溫為15 ℃時，采用一步稀釋法凍后活率為30%，采用兩步稀釋法凍后活率可達(dá)45%，兩者差異顯著。一些研究者報道兩步稀釋法要好于一步稀釋法，因為甘油在常溫下對精子會產(chǎn)生一些毒副作用，而當(dāng)溫度下降到4 ℃時加甘油可以減輕對精子的損傷。胡日查等[26]通過采用一步稀釋法、4 ℃平衡2.5 h、38 ℃水浴中解凍30 s的方法精子凍后活率可達(dá)46.99%。許諾[27]采用1：1一步稀釋、隔水降溫2 h的方法，精子凍后活力可達(dá)45.67%，頂體完整率為76.19%，質(zhì)膜完整率為28.77%。Alcay等[28]將公羊精液按1：1比例稀釋后，在5 ℃平衡2 h，用液氮蒸汽冷凍精液，然后在37 ℃水浴中解凍30 s后精子活力可達(dá)53.67%，頂體損傷率為36.33%。Sangeeta[29]將稀釋好的精液裝入0.25 mL冷凍細(xì)管密封之后在4 ℃環(huán)境中平衡2 h，冷凍-解凍后精子活力為40.78%。而Moustacas等[30]報道將稀釋好的精液在5 ℃環(huán)境中平衡3 h，距離液氮面上方3 cm處熏蒸15 min，37 ℃水浴解凍30 s的精液品質(zhì)較差，解凍后精子活力僅為20.9%。Taghilou等[31]將精液1：1稀釋后在4 ℃平衡3 h后，放在含液氮的聚苯乙烯箱內(nèi)，在離液氮表面上方5 cm處熏蒸20 min冷凍精液，在37 ℃水浴中完全解凍后精子活率為43.8%，質(zhì)膜完整率為34.2%。

當(dāng)前研究者們對精液的稀釋比例主要是1:3和1:4，以一步稀釋法平衡2～3 h和兩步稀釋法平衡3～4.5 h為主，平衡溫度為4 ℃和5 ℃，液氮熏蒸時間為7～20 min，熏蒸高度為3～5 cm，解凍溫度為37～38 ℃水浴30 s。另有一些研究者將精液按1:1和1:2比例稀釋，采用40 ℃ 20 s、55 ℃ 6 s、55 ℃ 10 s等較高溫度解凍。采用高溫短時間的解凍方法能明顯提高精子的活率，但是使用高溫解凍精液容易造成精子全部死亡，所以控制合理的解凍時間非常重要。而平衡降溫速率與液氮熏蒸高度對于精液凍后品質(zhì)有極大的影響，目前主要使用水浴降溫和多層紗布包裹降溫兩種方法使精液在規(guī)定時間內(nèi)降到4～5 ℃。不同熏蒸高度對精液的冷凍速率不同，今后應(yīng)該加強(qiáng)程序冷凍儀的推廣及使用，研究出適合山羊精液冷凍最適的平衡降溫速率以及冷凍速率，切實提高山羊凍精品質(zhì)。

4 山羊冷凍精液在人工授精中的應(yīng)用

20世紀(jì)60年代中期，奶牛業(yè)開始使用冷凍精液進(jìn)行人工授精，逐步代替了液態(tài)保存的精液。目前，應(yīng)用牛冷凍精液進(jìn)行人工授精，效果已與鮮精無明顯差異。近年來，學(xué)者們用山羊冷凍精液進(jìn)行人工授精后受胎率低，與鮮精差異較大，所以不能用于商業(yè)化生產(chǎn)。Rekha等[32]用Tris-果糖-卵黃冷凍稀釋液將綿羊精液冷凍-解凍后對22只母羊進(jìn)行人工授精，3只懷孕，受胎率為13.6%。Salvador等[33]用山羊冷凍精液對551只母羊人工授精后受胎率為57.0%。Karatzas等[34]用山羊冷凍精液對635只母羊單次人工授精受胎率為44.9%。Govaere等[35]研究發(fā)現(xiàn)冷凍精液子宮角深部輸精的妊娠率顯著高于子宮體輸精妊娠率。Kumar和Nagvi[36]報道用冷凍精液子宮頸人工授精(TCAI)對綿羊產(chǎn)羔率有顯著影響，發(fā)情14 h和22 h后的母羊兩次受精后的產(chǎn)羔率為19.3%，而發(fā)情10 h后母羊單次受精的產(chǎn)羔率為10%,說明采用TCAI技術(shù)，母羊發(fā)情后人工授精的時間間隔與次數(shù)對產(chǎn)羔率有顯著影響。包牧仁等[37]采用子宮頸深部輸精法對比了使用冷凍精液和常溫精液人工授精后絨山羊的受胎率，結(jié)果表明，母羊在第一、第二情期利用凍精人工授精后的受胎率極顯著低于常溫精液人工授精后的受胎率；但是在第一、第二、第三情期使用凍精人工授精后受胎率與使用常溫精液人工授精后的受胎率差異不顯著。Dorado等[38]報道母羊在發(fā)情24 h內(nèi)用冷凍精液子宮頸人工授精后的受胎率為45.45%，發(fā)情時間在24～36 h內(nèi)人工授精后的受胎率為46.15%，發(fā)情時間大于36 h人工授精后受胎率為60%，結(jié)果表明母羊發(fā)情時間長短對受胎率沒有顯著影響，但是用凍精人工授精，適當(dāng)延長發(fā)情母羊的配種時間可以提高母羊受胎率。Kharche等[39]報道，用山羊冷凍精液對32只母羊人工授精后17只懷孕，受胎率為53.13%。Yotov等[40]采用子宮頸深部輸精法，用PMSG對山羊同期發(fā)情處理人工授精后的受胎率為60%，而自然發(fā)情母羊輸精后的受胎率為37%，兩者差異顯著。Anakkul等[41]報道腹腔鏡子宮內(nèi)人工授精比子宮頸人工授精的成功率更高。Martinezrojero等[42]在非繁殖季節(jié)對母羊做同期發(fā)情處理后，采用腹腔鏡子宮內(nèi)山羊冷凍精液輸精的受胎率為33.3%。Masoudi等[43]用冷凍精液對發(fā)情母羊進(jìn)行陰道、子宮頸和腹腔鏡子宮角人工授精，結(jié)果顯示，利用腹腔鏡人工授精的效果顯著好于其他兩種。Anakkul等[44]報道，山羊腹腔鏡單側(cè)子宮角人工輸精的受胎率可達(dá)56.67%。

當(dāng)前山羊冷配受胎率低的主要原因有四點：一是由于母羊子宮頸非常細(xì)，在輸精過程中不能達(dá)到理想的輸精深度；二是人工授精在輸精過程中會對母羊造成不良的刺激；三是由于目前山羊凍精質(zhì)量差且不穩(wěn)定；四是與配種技術(shù)員不規(guī)范的操作有關(guān)。目前應(yīng)用較多的是腹腔鏡子宮內(nèi)輸精和子宮頸輸精，腹腔鏡子宮內(nèi)輸精比較復(fù)雜，操作要求高，但是母羊人工授精后受胎率高；子宮頸輸精精液消耗量大，母羊受胎率低，但是由于成本低、操作簡單，在目前實際生產(chǎn)當(dāng)中應(yīng)用最廣泛。

5 展 望

山羊精液冷凍保存技術(shù)目前還處在發(fā)展當(dāng)中，精子凍后活率低、冷凍精液人工授精后受胎率低是制約其發(fā)展的根本原因。目前學(xué)者們對稀釋液成分和冷凍程序做了大量的研究，而對山羊精子凍融后的損傷機(jī)制沒有深入研究。今后應(yīng)該加強(qiáng)研發(fā)無動物源成分保存液、將性控技術(shù)與羊精液冷凍相結(jié)合。從山羊精子細(xì)胞水平深入到分子水平，從精子的超微結(jié)構(gòu)以及在輸精方法上進(jìn)行更深入細(xì)致的研究，找出山羊冷凍精液輸精受胎率低的原因，從而配制合適的稀釋液以及確定合理的冷凍程序。解決這個技術(shù)難題不僅能夠提高種公畜的利用率，便于開展國內(nèi)外種質(zhì)交流，而且將凍精技術(shù)應(yīng)用到實際生產(chǎn)中可以推動繁殖新技術(shù)的發(fā)展，也為中國山羊業(yè)進(jìn)一步發(fā)展提供理論依據(jù)和技術(shù)保障。