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舒血寧注射液中蛋白質(zhì)的含量測定研究

2020-07-01 14:56李玉彩李響明王文鵬孫勝斌
亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥 2020年5期
關(guān)鍵詞:舒血寧光度白蛋白

李玉彩,李響明*,王文鵬,孫勝斌

(1.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司,河北 石家莊 051430;2.中藥注射劑新藥技術(shù)開發(fā)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,河北 石家莊 051430)

中藥注射劑作為傳統(tǒng)中藥的創(chuàng)新劑型,具有高生物利用度、作用迅速的特點(diǎn),在治療急重癥方面具有很大的優(yōu)勢。隨著臨床的廣泛使用,不良反應(yīng)與安全性等問題隨之引起了人們的關(guān)注[1-2],蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)可能是引起其不良反應(yīng)的重要影響因素之一。

由銀杏葉提取物制得的注射液,主要含有總黃酮類和內(nèi)酯類化合物[3]。銀杏葉提取物具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)的作用,在臨床上應(yīng)用廣泛[4-5]。一般來說,在中藥注射液生產(chǎn)中已經(jīng)去除了絕大多數(shù)的蛋白類物質(zhì),除另有規(guī)定外,依照中國藥典,制劑的蛋白質(zhì)定性檢查應(yīng)符合要求[6]。舒血寧注射液在生產(chǎn)中應(yīng)用醇沉、水沉、柱層析等精制工藝可去除大部分雜質(zhì),制劑按中國藥典方法檢查蛋白質(zhì)應(yīng)該符合規(guī)定,不過關(guān)于舒血寧注射液制劑中殘留蛋白質(zhì)定量測定的方法鮮有報(bào)道。

目前常用的檢測蛋白質(zhì)的方法有磺基水楊酸法、福林酚(Lowry)法、凱氏定氮法、體積排阻色譜(SEC)法、考馬斯亮藍(lán)法等[7]?;腔畻钏岱╗6]是自2000年版《中國藥典》以來沿用至今的定性檢查,以是否出現(xiàn)渾濁作為合格的依據(jù),此方法操作簡單,但靈敏度不高,偶爾出現(xiàn)假陽性結(jié)果[8-9]。福林酚(Lowry)法易受還原物質(zhì)、酚類、枸櫞酸、硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等的干擾。凱氏定氮法可最終測出含氮量,但含氮量與蛋白質(zhì)的換算需要系數(shù),測定結(jié)果受產(chǎn)品中氨基酸的影響,且方法操作過程較為繁瑣、費(fèi)時(shí),在測定過程中還會(huì)有大量有毒有害氣體產(chǎn)生,危害環(huán)境與健康??捡R斯亮藍(lán)法在檢測時(shí)受干擾較少,此方法利用溶液顏色的差異進(jìn)行比色測定,適用于蛋白類的定量分析,并且檢測的重復(fù)性好、精密度高、線性關(guān)系好,尤其適用于蛋白質(zhì)的微量分析[10-14]。

1 材料

1.1 儀器與試劑

TU-1950紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);CPA225D電子天平(德國賽多利斯);考馬斯亮藍(lán)G250(分析純);乙醇(分析純);磷酸(分析純)。

1.2 樣品與對照品

舒血寧注射液為市售產(chǎn)品,分別標(biāo)稱為A、B、C三個(gè)廠家。對照品血清白蛋白(牛)(批號140619-201723,購于中國食品藥品檢定研究院)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

取血清白蛋白(牛),加水溶解定容至量瓶中,配制成1 mg/mL的牛血清白蛋白溶液。精密量取5 mL溶液置50 mL量瓶中,加水定容至刻度搖勻,即得對照品溶液。

2.2 波長的選擇

取對照溶液加酸性染色劑混勻后在400~800 nm范圍內(nèi)全波長掃描,結(jié)果顯示在596.2 nm波長處有最大吸收。供試品溶液同法測定,在595 nm處有吸收度值。因此測定波長選擇在595 nm處。見圖1。

圖1 對照品溶液400~800 nm波長范圍內(nèi)掃描結(jié)果

2.3 線性范圍考察

分別精密量取對照品溶液0、1.0、2.0、4.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL,置10 mL量瓶中,加水定容至刻度搖勻。分別精密量取1 mL置具塞試管中,加5 mL酸性染色液,混勻,立即在595 nm處測定吸光度,同時(shí)以0號管作為空白。以吸光度值為縱坐標(biāo),以牛血清白蛋白濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,牛血清白蛋白在范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,見表1。

表1 線性范圍

2.4 精密度試驗(yàn)

取本品按前述方法連續(xù)測定6次,計(jì)算6次的吸光度值RSD。結(jié)果RSD為0.53%,表明系統(tǒng)精密度良好。

2.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品按前述方法,混勻后分別放置0、2、4、6、8、10 min后測定,計(jì)算6次吸光度值的RSD為0.98%,說明樣品與酸性染色液混勻后在室溫放置10 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 回收率試驗(yàn)

量取舒血寧注射液各0.5 mL,分別加入對照品,搖勻后制成低、中、高三個(gè)濃度的供試品溶液,按前述方法同法操作,計(jì)算回收率。結(jié)果顯示,回收率為96.97~100.0%,RSD<2%,表明所用方法準(zhǔn)確性好。見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取本品按前述方法平行處理6份,分別測定吸光度,RSD為0.42%,表明系統(tǒng)的重復(fù)性良好。

2.8 樣品測定

取9批舒血寧注射液,精密吸取14 mL,按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法,自“加入5 mL酸性染色液”起,依法測定吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出本品中蛋白質(zhì)的含量,計(jì)算,即得。結(jié)果見表3。

表3 樣品中蛋白質(zhì)的測定結(jié)果

3 討論

本研究共檢測了3個(gè)廠家共9批含銀杏葉提取物的注射液成品,結(jié)果顯示蛋白質(zhì)的含量均在0.1 mg/mL左右,含量較低,與使用中國藥典2015年版中磺基水楊酸法定性檢查結(jié)果一致,均為澄清,未出現(xiàn)渾濁。蛋白質(zhì)水平偏低,可能與藥用部位為葉,用稀乙醇提取、又經(jīng)過柱層析等精制工藝處理有關(guān)[15]。因此,舒血寧注射液產(chǎn)品中殘留微量的蛋白質(zhì)。而3個(gè)廠家的產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量仍有一定差別,應(yīng)該與產(chǎn)品的投料方式[4]、精制工藝有關(guān)。為了更好地保障臨床用藥安全,降低不良反應(yīng)發(fā)生率,生產(chǎn)企業(yè)要持續(xù)優(yōu)化工藝,不斷提升產(chǎn)品質(zhì)量水平,結(jié)合國家規(guī)定的注射液產(chǎn)品中蛋白質(zhì)的含量限度進(jìn)行生產(chǎn)。

本研究建立了一種簡單、可靠,可用于檢測舒血寧注射液中蛋白質(zhì)含量的方法。此方法靈敏度高,對設(shè)備要求較低,結(jié)果準(zhǔn)確,對提升產(chǎn)品質(zhì)量具有重要的參考意義,對其他注射液中蛋白質(zhì)類雜質(zhì)的限量檢查亦有借鑒作用。

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