林秀鴻，陳鑫穎，江睿軒，沈陳沂，何才姑

(福建中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122)

國際糖尿病聯(lián)盟(International Diabetes Federation，IDF)2017年12月最新數(shù)據(jù)顯示，全球的糖尿病患者已達4.25億人，相當(dāng)于每11個成年人中就有1個人患有糖尿病，糖尿病(發(fā)病率為8.8%)的形勢嚴(yán)峻。而Ⅱ型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)占糖尿病的95%，是主要的流行形勢。盡管各種降血糖藥物以及胰島素對血糖調(diào)節(jié)的效果很好，不少患者的病情仍然持續(xù)進展并出現(xiàn)各種并發(fā)癥。T2DM主要的發(fā)病機制是胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能損傷[1]，但是僅僅胰島素抵抗并不會導(dǎo)致T2DM，據(jù)研究T2DM病人β細(xì)胞數(shù)量減少，說明胰島β細(xì)胞功能損傷在T2DM的病理過程中起重要作用。因此，研究胰島β細(xì)胞的增殖與凋亡機制成為防治糖尿病的重要途徑。

T2DM是臨床上常見的內(nèi)分泌疾病，以“三多一少”(多飲、多尿、多食及身體消瘦)為主要特征。中醫(yī)稱Ⅱ型糖尿病為“消渴”，臨床上胃熱陰虛型較多見，常用滋陰清熱的方法來進行治療，故常運用玉女煎加減[2]。《景岳全書》中記載的經(jīng)方“玉女煎”在臨床上廣泛用于治療糖尿病并獲得較為滿意的效果，且對糖脂代謝也有一定的影響，但目前玉女煎對胰島β細(xì)胞的作用以及如何減緩糖尿病的病情研究很少，對增殖和凋亡的調(diào)節(jié)機制不太明確。因此，本實驗對玉女煎含藥血清對胰島β細(xì)胞株INS-1增殖和凋亡的影響進行相關(guān)研究，現(xiàn)報告如下。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 動物及細(xì)胞株 SPF級Wistar雄性大鼠50只，8周齡，體質(zhì)量180～220 g，購自上海斯萊克動物實驗有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK(滬)2007～0005，合格證號：0063771。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心屏障系統(tǒng)。大鼠胰島β細(xì)胞株INS-1，購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.1.2 藥物的制備 玉女煎來自《景岳全書》，60 kg成年人每日劑量：生石膏15 g、熟地黃30 g、麥冬6 g、知母4.5 g、牛膝4.5 g。按體表面積，大鼠每日每千克體重的劑量約為人的6.25倍。按量稱取玉女煎各組分，加水1 000 mL，浸泡2 h，武火煮開，文火煎煮50 min，將藥液倒出，加水500 mL，二次煎煮15 min，將藥液倒出并與第1次藥液混合，濃縮成0.625 g生藥/mL的混懸液，4 ℃保存。

1.1.3 含藥血清的制備 SPF級Wistar大鼠50只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，分兩組，30只大鼠用玉女煎灌胃(6.25 g·kg-1·d-1)，其余20只大鼠用生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃6 d，末次灌胃1 h后，20%烏拉坦麻醉(0.5 mL/100 g)，腹主動脈取血，4℃靜置6 h后離心，3 500 rpm，15 min，吸取血清，56 ℃滅活，0.22 μm濾膜過濾后分裝。

1.1.4 細(xì)胞培養(yǎng) RPMI1640培養(yǎng)液中添加10%的胎牛血清、1%的青霉素和鏈霉素以及50 μmol的β-巰基乙醇，在飽和濕度、37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d更換培養(yǎng)液，細(xì)胞貼壁生長至70%～80%時，0.25%胰酶消化、傳代。

1.2 試劑與儀器

RPMI1640培養(yǎng)液(美國gibco公司，批號：8118164)；MTT試劑(瑞士羅氏，批號：11465007001)；DPBS(美國gibco公司，批號：8118006)；胎牛血清(美國gibco公司，批號：1982158C)；ELx800酶標(biāo)儀(美國 BioTek公司)，流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

2 方法

2.1 生長曲線的測定

在96孔板中接種密度為1.5×105/mL，5個復(fù)孔，用MTT法分別測定第1天至第8天的A590值。

2.2 MTT檢測細(xì)胞的增殖

用0.25%胰酶消化細(xì)胞，稀釋至密度為1×105/mL，接種至96孔板，每組做5個復(fù)孔。當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，分別用5%、10%、15%和20%的玉女煎含藥血清干預(yù)，對照組用20%生理鹽水含藥血清。用MTT法進行檢測，分別測量藥物作用24 h、48 h和72 h后對INS-1細(xì)胞增殖情況，重復(fù)實驗3次。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

在6孔板中接種細(xì)胞密度為1×105/mL，分別加濃度為5%、10%、20%的玉女煎含藥血清，同時做空白對照以及生理鹽水含藥血清對照。

3 結(jié)果

3.1 INS-1細(xì)胞株生長曲線

INS-1細(xì)胞株在第1～2天處于生長滯留期，在第3天進入對數(shù)生長期，第7天進入平臺期，故INS-1細(xì)胞對數(shù)生長期為第3～6天，見圖1。

圖1 INS-1細(xì)胞株生長曲線

3.2 MTT檢測細(xì)胞增殖情況

藥物干預(yù)24 h后，5%、10%和15%的玉女煎含藥血清均可顯著促進細(xì)胞增殖(P<0.05)，干預(yù)48 h和72 h后，只有10%組繼續(xù)顯著促進細(xì)胞增殖(P<0.05)。其余各組差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

組別含藥鼠血清(%)例數(shù)A590對照組24h2031.26±0.24對照組48h2031.86±0.21對照組72h2032.18±0.30玉女煎24h2015103331.21±0.301.57±0.11?1.95±0.10?531.80±0.27?玉女煎48h2031.79±0.401531.87±0.251032.04±0.03?531.91±0.14玉女煎72h2032.18±0.161532.28±0.301032.56±0.30?532.08±0.28

注：與同時點對照組比較，*P<0.05。

3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況

與對照組比較，藥物作用24 h和48 h后，玉女煎各組顯著抑制細(xì)胞凋亡(P<0.01或P<0.05)，并且與玉女煎24 h 10%組比較，玉女煎48 h 10%組抑制凋亡作用更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2、圖2。

組別含藥鼠血清(%)例數(shù)凋亡率(%)對照組24h20331.610±3.87對照組48h20332.793±5.72

續(xù)表2

組別含藥鼠血清(%)例數(shù)凋亡率(%)玉女煎24h玉女煎48h201052010533333318.893±5.02?20.775±3.65?11.786±5.63?20.695±8.25?13.095±3.87?△13.360±4.05?

注：與相同時點對照組比較，*P<0.01，P<0.05；與玉女煎24 h 10%組比較，△P<0.05。

注：A、B.陰性對照～不加染料；C.對照組；D.玉女煎24 h(20%)；E.玉女煎24 h(10%)；F.玉女煎24 h(5%)；G.玉女煎48 h(20%)；H.玉女煎48 h(10%)；I.玉女煎48 h(5%)。

圖2 給藥24 h、48 h后流式細(xì)胞術(shù)檢測INS-1凋亡情況

4 討論

從接種1×104/孔的96孔板細(xì)胞生長曲線結(jié)果可知INS-1細(xì)胞前2天生長緩慢，從第3天進入對數(shù)生長期，第7天進入平臺期。因此，在后續(xù)檢測細(xì)胞增殖和凋亡時均在第3天給藥，此時最能檢測玉女煎含藥血清對該細(xì)胞的作用。

據(jù)研究，胰島β細(xì)胞數(shù)量減少和功能失調(diào)決定了T2DM發(fā)生發(fā)展的進程[3-4]。目前，我國已成為世界上Ⅱ型糖尿病患者人數(shù)最多的國家[4]。而研制安全有效、價格低廉的防治糖尿病的藥物已成為研究熱點和難點[5-8]。近年來，中醫(yī)藥在防治Ⅱ型糖尿病方面已取得明顯進展[2]。靈芝提取物FYGL能促進胰島β細(xì)胞增殖且能誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞損傷[9]；地骨皮醇提液對高糖損傷的胰島β細(xì)胞有保護作用[10]。

玉女煎具有清胃熱、滋腎陰之功效。在現(xiàn)代藥理研究中，君藥知母、臣藥熟地黃及使藥牛膝分別具有改善Ⅱ型糖尿病癥狀、解熱、抗炎作用。君藥知母能夠降低血糖，改善胰島素抵抗，降低血脂，拮抗動脈粥樣硬化[11-13]。雙苯吡酮類是知母中重要的化合物，而芒果苷和新芒果苷是知母中主要的雙苯吡酮類成分，芒果苷是知母中主要的抗炎、抗病毒和抗氧化成分[14]，芒果苷和新芒果苷還有降血糖和改善Ⅱ型糖尿病癥狀的作用[15]。臣藥地黃中含有苷類、黃酮類等化學(xué)成分[16]，黃酮類化合物是一類重要的含氧雜環(huán)天然有機化合物，具有抗炎、抗菌的作用；一些苷類化合物能夠有效地降低血糖，改善血脂水平[17]。使藥牛膝中小檗堿是其中的化學(xué)成分之一[18]，可以改善葡萄糖的攝取和利用，減少脂肪的生成、糖原分解和糖異生的水平[17]。同時，牛膝中的三萜及蛻皮甾酮具有可抑制由藥物引起的血糖升高、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、強心等作用[19-21]。

由本研究可知，10%玉女煎含藥血清作用24 h、48 h、72 h均能促進細(xì)胞增殖，5%和15%含藥血清作用24 h促進細(xì)胞增殖；玉女煎含藥血清各組作用24 h均能顯著抑制細(xì)胞凋亡，10%組作用48 h后，繼續(xù)抑制細(xì)胞凋亡。雖然玉女煎含藥血清能有效促進INS-1細(xì)胞增殖并減少其凋亡，但其抑制凋亡和促進增殖的分子機制，以及通過什么信號通路調(diào)節(jié)，這些都有待進一步實驗闡明。