王延乾，甘 泉

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院 皮膚科，河南 新鄉(xiāng)453000)

銀屑病屬于一種常見的免疫介導(dǎo)性皮膚病，以皮膚出現(xiàn)鱗屑、紅斑為主要特征，以淋巴細胞浸潤、角質(zhì)細胞異常增生、細胞因子分泌異常為主要病理表現(xiàn)[1]。目前對其治療仍無特效藥物，主要是進行對癥治療，以改善患者臨床表現(xiàn)為主。治療銀屑病的西藥主要包括糖皮質(zhì)激素、維生素D3類、維A酸、蒽林及免疫抑制劑等，尋求有效藥物對銀屑病的治療意義重大。白藜蘆醇(resveratrol，RSV)是一種多酚類物質(zhì)，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、心血管保護、神經(jīng)保護及抗衰老等作用[2]。有研究顯示[3]，其對多種皮膚病有預(yù)防、治療作用，能通過改善氧化應(yīng)激指標(ROS、MDA)改善銀屑病模型小鼠的癥狀。不過，是否有其他發(fā)揮治療作用的途徑值得深入探討。本研究旨在探討白藜蘆醇對銀屑病樣模型小鼠皮損的影響及可能的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Balb/c小鼠(雄性)60只，體質(zhì)量17～20 g，9周齡，從上海西普爾生物公司購買，許可證編號：SCXK(滬2013-0002)。室溫下正常喂養(yǎng)。

1.2 儀器與試藥

全自動染色機、PCR儀器、光學(xué)顯微鏡等由日本Olympus公司提供；白藜蘆醇由碧云天生物研究所提供，質(zhì)量分數(shù)≥98%；甲氨蝶呤片由上海信宜制藥公司生產(chǎn)，批號：20171208；咪喹莫特乳膏(5%)由四川明欣制藥公司生產(chǎn)，批號：20171112；DAB顯色液由北京中杉金橋生物公司提供；CD3+、CD11c+單克隆抗體、CGRP多克隆抗體、增殖細胞核抗原(PCNA)抗體由Abcam提供；NK-1R、SP、NPY單克隆抗體由Immunoway提供；BCA定量試劑盒、PCR試劑盒購自北京博奧森生物公司。

1.3 造模分組及給藥

根據(jù)冉立偉等[4]的制備方法進行銀屑病小鼠造模：麻醉小鼠(給予戊巴比妥鈉腹腔注射，劑量80 mg/kg)，背部去毛備皮(面積3 cm×2 cm)，單籠飼養(yǎng)。采用隨機數(shù)字表法將備皮的小鼠分為對照組、模型對照組、陽性對照組(甲氨蝶呤)、低劑量組(白藜蘆醇10 mg/kg)、高劑量組(白藜蘆醇20 mg/kg)，各12只。對照組小鼠在備皮處用凡士林適量涂抹，1次/d，其他各組小鼠備皮處給予咪喹莫特乳膏(5%)62.5 mg，1次/d；造模同時，低、高劑量組分別給予白藜蘆醇10 mg/kg、20 mg/kg，腹腔注射，1次/d；陽性對照組給予甲氨蝶呤片溶液1 mg/kg灌胃，1次/d。各組均連續(xù)用藥7 d。

1.4 銀屑病模型小鼠疾病嚴重程度及皮損面積評分(PASI)

用數(shù)碼相機每日拍照，觀察小鼠鱗屑、紅斑、浸潤情況，每日進行PASI評分(包括鱗屑、紅斑、浸潤，每項均為0～4分)。

1.5 小鼠皮損處組織形態(tài)變化

造模7 d后，取小鼠背部皮膚置于福爾馬林中，2 d后脫水，用石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下對小鼠皮膚病理情況進行觀察。在400倍鏡下，將每個標本選切片6張，并在每張中隨機測量6處表皮層厚度(表皮角質(zhì)層至基底層間的垂直厚度)，以觀察表皮層的增厚狀況。

1.6 小鼠皮損浸潤等指標檢測

制備石蠟切片(厚度：5 μm)，用免疫組化法(IHC法)對CD3+、PCNA表達進行檢測，用免疫熒光法(IF法)對CD11c+樹突狀細胞(DC)、NK-1R、CGRP表達進行檢測。每個標本隨機取6個視野，用IPP6.0分析系統(tǒng)對圖像進行分析，記錄IOD值。

1.7 小鼠皮損組織P物質(zhì)(SP)、神經(jīng)肽Y(NPY)蛋白表達檢測

采用Westem Blot法進行檢測：取小鼠皮損組織進行裂解提取總蛋白，用BCA法進行蛋白定量。對蛋白樣品進行電泳，然后濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上面，封閉后在室溫條件下輕搖30 min，根據(jù)說明書依次加一抗、二抗、洗膜，膠片曝光后顯影及定影。用Image J軟件讀取IOD值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料用((x±s)表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠皮損紅斑、鱗屑及浸潤情況及PASI評分

經(jīng)肉眼觀察，對照組小鼠皮膚粉嫩、光滑，無改變；其他各組在2、3天時開始有皮損，紅色斑點漸漸擴大到片狀，有鱗屑、浸潤出現(xiàn)。與模型對照組同期比較，從第3天開始用藥組PASI評分明顯降低，以陽性對照組及大劑量組降低更明顯，P<0.05。見圖1、圖2。

圖1 各組小鼠第7天后皮損情況

注：與模型對照組比較，aP<0.05；與小劑量組比較，bP<0.05

2.2 小鼠表皮組織形態(tài)

HE染色結(jié)果顯示，對照組小鼠皮膚表皮層相對較薄，模型對照組則明顯增厚，并出現(xiàn)角化過度、角化不全，基底細胞核有較多分裂象，炎性細胞浸潤較重；陽性對照組、低劑量組及高劑量組與模型對照組比較，表皮相對較薄，出現(xiàn)角化不全細胞相對較少，基底細胞核分裂也不明顯，浸潤也較輕。7天后，模型對照組表皮層厚度明顯高于對照組，P<0.05;用藥組表皮層厚度均明顯低于模型對照組，以陽性對照組、高劑量組改善更明顯，P<0.05。見圖3、圖4。

圖3 各組小鼠皮損組織HE染色(×400)

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型對照組比較，bP<0.05；與低劑量組比較，cP<0.05

圖4 小鼠在7 d后表皮層厚度分析

2.3 各組小鼠7天后皮損組織中CD11c+DC、CD3+及PCNA表達情況

7天后，模型對照組CD11c+DC、CD3+及PCNA表達均明顯高于對照組(P<0.05)；用藥組CD11c+DC、CD3+及PCNA表達均明顯低于模型對照組，以陽性對照組、高劑量組降低更明顯(P<0.05)。見表1。

2.4 各組小鼠7天后皮損組織中NK-1R、CGRP表達情況

7天后，模型對照組NK-1R、CGRP表達均明顯高于對照組，P<0.05；用藥組NK-1R、CGRP表達均明顯低于模型對照組，以陽性對照組、高劑量組降低更明顯(P<0.05)。見表2和圖5、圖6。

組別nCD11c+DC(IOD)CD3+(個)PCNA(個)對照組12151.56±30.285.71±0.2926.12±7.89模型對照組122058.24±1135.21a21.71±2.23a92.12±9.87a陽性對照組12426.36±125.67bc11.71±1.49bc68.54±15.47bc低劑量組12524.69±147.62b16.15±1.98b75.51±16.21b高劑量組12422.74±126.24bc10.05±1.68bc66.17±15.38bc

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型對照組比較，bP<0.05；與低劑量組比較，cP<0.05。

表2 各組小鼠7d后皮損組織中NK-1R、CGRP表達情況

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型對照組比較，bP<0.05；與低劑量組比較，cP<0.05。

注：IF×200;其在真皮層分布，陽性表達呈現(xiàn)綠色熒光

注：IF×200;其分布與血管密切聯(lián)系，表達于皮下及真皮組織，陽性表達呈現(xiàn)紅色熒光

2.5 各組小鼠皮損組織中SP、NPY蛋白表達

與對照組比較，模型組NPY蛋白表面明顯升高，P<0.05；與模型對照組比較，用藥組NPY蛋白表達明顯降低，以陽性對照組、高劑量組降低更明顯，P<0.05；與對照組比較，模型對照組及用藥組SP表達均明顯升高，P<0.05;模型對照組與用藥組SP表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05。見圖7、圖8。

注：①對照組；②模型對照組；③陽性對照組；④低劑量組；⑤高劑量組

3 討論

銀屑病是一種炎癥性、以T淋巴細胞活化異常為主要表現(xiàn)的免疫性疾病[5]。臨床上一般用咪喹莫特制造銀屑病小鼠模型，甲氨蝶呤則屬于一種免疫抑制劑，常作為實驗研究的陽性對照用藥。銀屑病發(fā)病機制較復(fù)雜，大多研究認為其發(fā)病與神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)相關(guān)[6]。有資料顯示[7]，T淋巴細胞免疫激活主要以樹突狀細胞(DC)活化作為先導(dǎo)，也就是說，在銀屑病發(fā)生的過程中，DC位于上游環(huán)節(jié)，DC異?；罨瘜?dǎo)致發(fā)生“細胞因子風(fēng)暴”，使IL-1β、IL-6、IL-7、IL-12、IL-23等細胞因子釋放增加，從而導(dǎo)致銀屑病的纏綿與反復(fù)。本研究結(jié)果顯示，使用白藜蘆醇治療的低、高劑量組小鼠在用藥后PASI評分、皮損處表皮層厚度均明顯降低，且以大劑量組改善更明顯，由此提示，白藜蘆醇對銀屑病有一定的治療作用，且有一定濃度依賴性。

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型對照組比較，bP<0.05；與低劑量組比較，cP<0.05

DC除與細胞因子有關(guān)外，還可能與多種神經(jīng)肽有關(guān)。在皮膚中，神經(jīng)肽除了由神經(jīng)纖維釋放外，角質(zhì)形成細胞、樹突狀細胞均能夠直接釋放神經(jīng)肽。NK-1R能促進DC發(fā)生免疫刺激，DC又能促進NK-1R表達，并與神經(jīng)調(diào)節(jié)中的適應(yīng)性免疫及固有的免疫機制關(guān)系密切[8]。NK-1R為SP的作用受體，二者結(jié)合能夠增強DC抗原的提呈作用[9]，維持DC的存活，促進DC釋放IL-12等細胞因子。本研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇低、高劑量組小鼠皮損組織中NK-1R、CD11c+樹突狀細胞、CD3+T淋巴細胞表達均明顯低于模型對照組，由此推測，白藜蘆醇通過DC-NK-1R/SP-細胞因子軸降低角質(zhì)形成細胞的增殖(本研究顯示，用藥組小鼠PCNA表達明顯降低)及淋巴細胞的浸潤，從而發(fā)揮治療作用。

CGRP是一種內(nèi)源性血管擴張劑，由37個氨基酸所組成，其主要參與炎癥細胞的募集，在皮膚的炎癥、免疫發(fā)展中起著重要的作用。動物及人體中除了外周神經(jīng)及中樞神經(jīng)組織中能表達CGRP外，角質(zhì)形成細胞也存在CGRP表達，CGRP對角質(zhì)形成細胞的增殖有促進作用。有研究證實[10]，CGRP能加重皮膚瘙癢及炎癥的發(fā)展，其受體在銀屑病組織中均呈現(xiàn)高表達。本實驗結(jié)果顯示，白藜蘆醇低、高劑量組小鼠炎癥反應(yīng)較輕，表皮增殖不明顯，表皮層相對較薄，這可能與白藜蘆醇對CGRP、NK-1R下調(diào)有關(guān)。

NPY含有36個氨基酸，其可參與皮膚炎癥反應(yīng)，影響相關(guān)細胞因子分泌。在免疫/炎癥反應(yīng)中，NPY能夠募集DC，從而發(fā)揮促炎作用。本實驗結(jié)果顯示，白藜蘆醇低、高劑量組小鼠NPY蛋白表達明顯比模型對照組低，且以高劑量組NPY蛋白表達降低更明顯，由此推測，白藜蘆醇可能通過減少NPY表達，進而降低DC在皮損處募集發(fā)揮作用。本實驗結(jié)果還顯示，除對照組SP表達相對較低外，其他各組SP表達差異不明顯，這提示，白藜蘆醇對SP表達作用不明顯，但此結(jié)果仍需進一步研究來證實。

綜上所述，白藜蘆醇能明顯減輕淋巴細胞浸潤，降低表皮細胞異常增殖，改善銀屑病模型小鼠皮損的癥狀。其可能是通過調(diào)節(jié)NK-1R、CGRP、NPY表達發(fā)揮治療作用。