侯美辰，張英杰，李 旭，姜 爽，樊 磊，史 丹，王曉波*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六七醫(yī)院，遼寧 大連 116021；3.大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧 大連 116044)

復(fù)方黃黛片是由雄黃為君藥、青黛為臣藥、丹參和太子參為佐使藥組成的復(fù)方片劑。在臨床上對急性早幼粒細(xì)胞白血病有良好的治療效果，可達(dá)到98.6%的完全緩解率。在體外研究實(shí)驗(yàn)中，主要以復(fù)方黃黛片中的單味藥雄黃或聯(lián)合青黛作用于K562、HL-60細(xì)胞的研究，不能很好體現(xiàn)復(fù)方黃黛片各組分融合后對白血病細(xì)胞的作用。本研究運(yùn)用血清藥理學(xué)的方法，采取“半體內(nèi)”的過程將復(fù)方黃黛片制成復(fù)方黃黛片含藥血清作用于HL-60細(xì)胞，以更加準(zhǔn)確地闡述復(fù)方黃黛片對早幼粒白血病細(xì)胞的凋亡作用，為中藥復(fù)方制劑作用于體外實(shí)驗(yàn)提供新途徑。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和細(xì)胞株的來源

雄性SD大鼠(清潔級)40只，鼠重200～240 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2015-0001。人白血病細(xì)胞HL-60購自上海中科院細(xì)胞庫。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器

Accuri C6流式細(xì)胞儀(美國Bio-Rad公司)，Multiskan Mk3酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)，IX71倒置式熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，Amersham Imager 600(美國GE公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)主要藥品和試劑

復(fù)方黃黛片(產(chǎn)品批號：180401，天長億帆制藥有限公司)，CCK-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)，Calcein-AM/PI活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，Hoechst 33258細(xì)胞核染液(碧云天生物技術(shù)研究所)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 含藥鼠血清的制備

①配制復(fù)方黃黛片混懸液：稱5 g羧甲基纖維素鈉，再量取1 000 mL dd H2O定容，制成0.5%羧甲基纖維素鈉試劑。70片復(fù)方黃黛片，去膜衣研缽磨粉，700 mL 0.5%羧甲基纖維素鈉試劑溶解，超聲混勻30 min，4 ℃保存；②實(shí)驗(yàn)分組、灌胃方法及采集血樣：SD大鼠重約200～240 g，隨機(jī)分為10只對照組(0.5%羧甲基纖維素鈉試劑)、30只實(shí)驗(yàn)組(復(fù)方黃黛片混懸液)，按照人和大鼠的體表面積進(jìn)行換算，大鼠每100 g給藥1 mL，配制藥液濃度。連續(xù)灌胃3天，每天2次。第3天末次灌胃1 h后，大鼠每克給藥0.007 mL 20%烏拉坦，腹主動脈取血，放置4 ℃冰箱2 h，5 000 r·min-14 ℃離心10 min，取血清存-80 ℃冰箱；③濃縮含藥血清：取血清及其3倍量甲醇混合，渦流混合器充分混勻40 s，4 ℃ 10 000 r·min-1離心10 min，取上清液分裝，氮?dú)獯蹈梢后w得到干粉，培養(yǎng)基溶解干粉，制備的含藥血清4 ℃保存。

2.2 含藥鼠血清對HL-60細(xì)胞的影響

2.2.1 光鏡下HL-60細(xì)胞形態(tài) HL-60細(xì)胞培養(yǎng)于10%小牛血清1640細(xì)胞培養(yǎng)液，37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中連日孵育細(xì)胞。觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，培養(yǎng)細(xì)胞至對數(shù)生長期，接種細(xì)胞密度5×105個/mL于6孔板中，分別加入含藥血清0、10、20、40 μL，添加培養(yǎng)液使每孔溶液體積為1.5 mL，砷最終作用細(xì)胞濃度0、10、20、40 μg·L-1。24 h對照組和實(shí)驗(yàn)組拍照，分析細(xì)胞生長狀態(tài)。

2.2.2 CCK-8法測細(xì)胞增殖 觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，培養(yǎng)細(xì)胞至對數(shù)生長期，接種細(xì)胞密度5×104個/mL于96孔板中，分別加入含藥血清0、0.625、1.25、2.5、5、10 μL，添加培養(yǎng)液使每孔溶液終體積為100 μL，每個濃度設(shè)計(jì)6個復(fù)孔，避免邊緣效應(yīng)，邊緣每孔添加100 μL無菌PBS，砷最終作用細(xì)胞濃度0、10、20、40、80、160 μg·L-1。24 h后加10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)3 h酶標(biāo)儀測定450 nm處每孔吸光度。

細(xì)胞生長抑制率(%)=[(對照組吸光度-給藥組吸光度)/(對照組吸光度-空白組吸光度)]×100%

2.2.3 Hochest/Calcein-AM/PI熒光染色 取1 mL Hochest染液、1 μL Calcein-AM染液、1 μL PI染液混勻，避光現(xiàn)用現(xiàn)配。細(xì)胞培養(yǎng)接板同“2.2.1”法。24 h后1 500 r·min-1離心3 min，PBS洗3次，去上清；1 mL PBS重懸細(xì)胞，吸120 μL混合液，37 ℃水浴避光孵育20 min，1 500 r·min-1離心3 min，PBS洗3次，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)。

2.2.4 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡 細(xì)胞培養(yǎng)接板同“2.2.1”法。5 h后1 000 r·min-1離心5 min，去上清冷PBS沖散細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min，重復(fù)兩次，1×Binding Buffer打散細(xì)胞，取100 μL加5 μL Annexin V-FITC，室溫避光10 min，加5 μL PI，室溫避光5 min，加390 μL PBS，流式細(xì)胞儀測定。

2.2.5 Western Blot測定凋亡蛋白 細(xì)胞培養(yǎng)接板同“2.2.1”法。提取不同給藥濃度的蛋白結(jié)合1×loading，制膠上樣電泳，轉(zhuǎn)膜牛奶封閉，孵育一抗過夜，PBST洗3次，二抗孵育1 h 30 min，PBST洗3次，顯影液上機(jī)測定。

2.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 使用軟件SPSS統(tǒng)計(jì)17.0版本對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整理，通過單樣本t檢驗(yàn)、配對t檢驗(yàn)分析各組數(shù)據(jù)，各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果來自3次重復(fù)平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)值以(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，計(jì)算分析所得P<0.05時，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 含藥血清砷濃度測定

250 μL血清、4 mL濃鹽酸和濃硝酸混合溶液(濃鹽酸∶濃硝酸=1∶3)于平底試管，恒溫加熱板220 ℃消解，dd H2O定容5 mL定容瓶，電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測砷的濃度，測定砷濃度為10 μg·L-1。

3.2 含藥血清對HL-60細(xì)胞凋亡的影響

3.2.1 含藥血清對HL-60生長的影響 圖1中含藥血清中砷濃度為0 μg·L-1時可見HL-60細(xì)胞成圓形，細(xì)胞生長形態(tài)略緊密，細(xì)胞邊緣清晰完整，細(xì)胞形態(tài)大小較均一，可見較好的細(xì)胞活性。隨著給藥濃度依次增加，細(xì)胞生長趨勢越來越松散，細(xì)胞邊緣模糊甚至破碎，部分細(xì)胞形態(tài)比正常細(xì)胞胞體變大，含藥血清濃度越大對細(xì)胞生長抑制程度越大。

圖1 不同濃度含藥血清對HL-60細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響(μg·L-1)

3.2.2 CCK-8法檢測HL-60細(xì)胞增殖結(jié)果 24 h后CCK-8法測定不同含藥血清對HL-60細(xì)胞抑制率為1.25%、8.74%、47.45%、68.11%、75.62%，如圖2所示。

圖2 不同濃度含藥血清作用于HL-60細(xì)胞CCK-8法抑制率結(jié)果

3.2.3 Hochest/Calcein-AM/PI熒光染色結(jié)果 Hochest染細(xì)胞核DNA激發(fā)藍(lán)色熒光；Calcein-AM透過活細(xì)胞，激發(fā)綠色熒光；PI通過受損細(xì)胞膜結(jié)合DNA激發(fā)紅色熒光。含藥血清濃度的增加，活細(xì)胞的綠色熒光數(shù)量上逐漸減少，熒光強(qiáng)度減弱；紅色熒光增多增強(qiáng)，如圖3所示。

圖3 不同濃度含藥血清作用于HL-60細(xì)胞染料Hochest/Calcein-AM/PI染色結(jié)果(μg·L-1)

3.2.4 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡結(jié)果 Annexin V-FITC/PI雙染HL-60細(xì)胞，5 h空白組細(xì)胞存活率為91.4%。隨著含藥血清濃度增大，HL-60細(xì)胞總凋亡率依次升高，如圖4所示。

圖4 不同濃度含藥血清作用于HL-60細(xì)胞Annexin V-FITC/PI雙染的凋亡結(jié)果

3.2.5 Western Blot凋亡蛋白結(jié)果 Bax蛋白給藥組與對照組相比表達(dá)呈上升趨勢，Bcl-2蛋白表達(dá)呈下降趨勢，凋亡標(biāo)志性蛋白Caspase 3、Caspase8蛋白表達(dá)逐一降低，Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 8蛋白表達(dá)逐一上升，與對照組相比具有顯著性差異，如圖5、圖6所示。

圖5 不同濃度含藥血清作用于HL-60細(xì)胞凋亡蛋白Bax，Bcl-2表達(dá)0.05，**P<0.01)

圖6 不同濃度含藥血清作用于HL-60細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3，8，Cleaved Caspase-3，8表達(dá)

4 討論

憑借黃世林教授多年對中外文獻(xiàn)的研究，受到張從正理論“治病先去邪，邪去而元?dú)庾詮?fù)”的啟發(fā)，從而確立了“扶正祛邪”的治則，選取青黛、雄黃、丹參和太子參為配伍處方的制劑，命名為復(fù)方黃黛片[1]。復(fù)方黃黛片中雄黃是君藥，研究表明雄黃具有抗腫瘤作用，并已成功地應(yīng)用于急性和慢性粒細(xì)胞白血病的治療[2-4]。青黛為臣藥，其有效成分為靛玉紅，可以有效抑制K562細(xì)胞、HL-60細(xì)胞的增殖[5-6]，靛玉紅少數(shù)發(fā)明也為白血病專利[7]，臨床數(shù)據(jù)更證實(shí)了其治療慢性粒細(xì)胞白血病有很好的療效[8]。丹參、太子參為佐使藥，用其可緩解術(shù)后白細(xì)胞減少癥狀，丹參酮ⅡA是有效成分，可抑制白血病細(xì)胞生長[9]。

以復(fù)方黃黛片法(RIF)為主，治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)患者，復(fù)發(fā)率低，無復(fù)發(fā)生存率較高，其緩解后治療方案有效可行[1，10-11]。RIF對APL治療及其肝功能異常等不良反應(yīng)和全反式維甲酸法(ATRA)、三氧化二砷法(ATO)臨床效果相當(dāng)，但RIF對于凝血功能異常發(fā)生率明顯低于ATRA、ATO[12-13]。砷劑應(yīng)用于兒童APL治療期的血砷濃度在有效范圍內(nèi)，停藥時砷濃度達(dá)高峰，停藥后逐步降低，停藥半年與治療前水平相同，砷劑在APL治療中具有安全可靠性[14]。復(fù)方黃黛片屬于砷劑，是治療白血病的方法之一，當(dāng)復(fù)方黃黛片納入醫(yī)保目錄后，復(fù)方黃黛片相較于注射用砷劑治療APL性價(jià)比更高[15]。RIF與ATO相比療效沒有顯著性差異，RIF可以使PML-RARα基因持續(xù)陰性，RIF維持治療效果較好。肝腎功能損害沒有顯著性差異，但RIF比ATO不良事件發(fā)生率低，RIF可以不住院治療，比ATO藥物費(fèi)用低[16]，RIF優(yōu)于ATO，同時也減輕患者在化療期間的不適感，提高患者對RIF治療方案的依從性[17]。RIF比ATRA完全緩解(CR)率稍高，CR時間稍長，顯示出更好的安全性，改善了生活質(zhì)量并降低患者的醫(yī)療成本[18]。

中藥治療相對緩和，但復(fù)方中藥成分比較復(fù)雜，直接作用于細(xì)胞沒有經(jīng)歷體內(nèi)藥物入血過程沒有說服性，因此，應(yīng)用含藥血清藥理學(xué)方法進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。日本學(xué)者Hiroko Iwama等[19]在1987年完善了血清藥理學(xué)的概念，上世紀(jì)90年代王喜軍[20]研究得出“中藥血清藥物化學(xué)研究方法”。本實(shí)驗(yàn)制復(fù)方黃黛片含藥血清作用于急性粒白血病細(xì)胞并觀察對其的影響。由“3.1”可知，血清砷濃度為10 μg·L-1。作用于HL-60細(xì)胞24 h后光鏡觀察，細(xì)胞胞體變大，細(xì)胞邊緣模糊甚至破裂，給藥濃度變大數(shù)目變少。24 h后加CCK-8溶液，CCK-8溶液中含有WST-8，與細(xì)胞線粒體中的脫氧酶作用下結(jié)合1-Methoxy PMS生成黃色Formazan，活細(xì)胞越多生成的黃色產(chǎn)物越多，OD值越大。CCK-8試劑隨給藥濃度上升，OD值降低，藥物對細(xì)胞抑制率增強(qiáng)。Hochest/Calcein-AM/PI混合液染HL-60細(xì)胞，Hochest透過完整細(xì)胞染細(xì)胞核DNA，激發(fā)藍(lán)色熒光；Calcein-AM透過活細(xì)胞細(xì)胞膜與內(nèi)在酯酶脫AM基團(tuán)，Calcein激發(fā)綠色熒光；PI通過受損細(xì)胞膜結(jié)合DNA雙螺旋，激發(fā)紅色熒光。含藥血清濃度增加，活細(xì)胞綠色熒光數(shù)量逐漸減少，熒光強(qiáng)度減弱；紅色熒光增多增強(qiáng)。Annexin V-FITC/PI雙染HL-60細(xì)胞，活細(xì)胞中細(xì)胞膜脂質(zhì)內(nèi)側(cè)存在磷脂酰絲氨酸，細(xì)胞凋亡早期脂膜內(nèi)側(cè)外翻，AnnexinV與磷脂酰絲氨酸結(jié)合，檢測細(xì)胞早期凋亡，PI透過不完整的細(xì)胞膜，凋亡中晚期和死亡細(xì)胞PI易侵入，總凋亡率隨給藥濃度增加而升高。血清濃度增加凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-8表達(dá)上調(diào)，Bcl-2、Caspase-3和Caspase-8表達(dá)下調(diào)。表明復(fù)方黃黛片含藥血清劑量增多，濃度升高，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡程度明顯提高，抑制HL-60細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)。

5 結(jié)論

①復(fù)方黃黛片制成混懸劑，灌胃大鼠得含藥血清，取250 μL血清，消解后H2O定容5 mL定容瓶，電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀測定砷的濃度10 μg·L-1；②不同濃度作用于HL-60細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)，通過光鏡觀察、CCK-8法、Hochest/Calcein-AM/PI染色法、Annexin V-FITC/PI雙染法、Western Blot法，含藥血清濃度增加，誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡程度增強(qiáng)；③復(fù)方黃黛片可以通過血清藥理學(xué)方法制備成含藥血清作用于體外實(shí)驗(yàn)，解決了中藥組方直接作用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)溶液的不穩(wěn)定性和結(jié)果的不確定性。