馬海平，許高新，王 曼，朱 軍

(1.長江大學(xué)附屬仙桃市第一人民醫(yī)院 藥學(xué)部，湖北 仙桃 433000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院 藥學(xué)部，湖北 十堰 442000)

利咽飲是湖北省仙桃市第一人民醫(yī)院的醫(yī)院制劑，收載于《湖北省醫(yī)院制劑規(guī)范(2011年版)》，是由金銀花、玄參、連翹、桔梗、胖大海、蟬蛻、木蝴蝶、甘草、薄荷腦共9味藥材提煉加工而成的中成藥，具有滋陰清熱、化痰利咽的功效[1]。利咽飲隸屬醫(yī)院制劑，當(dāng)前其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)只有關(guān)于其中薄荷腦含量氣相色譜法測定的相關(guān)報(bào)道[2]。而金銀花作為方中主藥，是利咽飲的主要有效成分之一，《湖北省醫(yī)院制劑規(guī)范(2011年版)》中僅對綠原酸進(jìn)行了薄層色譜鑒別，未對其含量進(jìn)行控制。為確保利咽飲的療效，本研究將對主藥金銀花的主要有效成分綠原酸進(jìn)行含量測定。

金銀花(LoniceraeJaponicaeFlos)是忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb)的干燥花蕊或初開的花[3]，具有清熱解毒、消癰散腫、抗菌消炎、免疫調(diào)節(jié)等作用[4]。金銀花中含有多種有機(jī)酸類成分[5]，綠原酸(chlorogenic，CG)是其中藥理活性最強(qiáng)的成分之一[6]，具有抗菌、抗病毒、抗氧化等藥理作用[7]?，F(xiàn)對金銀花的有效成分綠原酸進(jìn)行HPLC法含量測定，并預(yù)將綠原酸的含量作為控制利咽飲質(zhì)量的主要指標(biāo)。參考《中華人民共和國藥典》2015年版一部中收載的金銀花中綠原酸含量測定方法，調(diào)整流動相乙腈與0.4%磷酸的比例。當(dāng)流動相為乙腈-0.4%磷酸溶液9∶91時，利咽飲色譜圖中各峰分離度良好，出峰時間適宜，峰形良好。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

P1201型高效液相色譜儀(大連依利特)；UV230Ⅱ紫外-可見檢測器；AL204電子分析天平(梅特勒)，精確度1×10-5g；超聲波清洗器(KQ-50B)；pH計(jì)(上海雷磁PHSJ-3F)。

1.2 試劑

綠原酸對照品(上海源葉，批號Y24J7K16726，供含量測定用)；甲醇(色譜純，SIMARK)；乙腈(色譜純，SIMARK)；磷酸(分析純，天津天力)；水(純化水，自制)。

1.3 樣品

利咽飲3批(仙桃市第一人民醫(yī)院制劑室自制，250mL/瓶，批號20171203、20180201、20180611)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.4%磷酸水溶液(9∶91)，檢測波長為327 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，理論塔板數(shù)按綠原酸計(jì)算不低于1000。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取綠原酸對照品11.6 mg于25 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。精密量取上述對照品儲備液1 mL于25 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，作為對照品溶液(18.56 μg/mL)。

2.2.2 供試品溶液制備 精密量取利咽飲溶液2mL于25mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，臨用前用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μL，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件分析，綠原酸對照品及利咽飲供試品色譜圖如圖1、圖2所示。結(jié)果顯示，在與綠原酸對照品相同的保留時間處，利咽飲樣品出現(xiàn)相對應(yīng)的色譜峰且無其他雜峰出現(xiàn)，說明利咽飲中的其他成分對測定無干擾。

圖1 綠原酸對照品色譜

圖2 利咽飲色譜及出峰數(shù)據(jù)

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取不同體積的綠原酸對照品儲備液，加50%甲醇稀釋成9.28、13.92、18.56、23.20、55.68 μg/mL的溶液，分別按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，每個濃度的溶液進(jìn)樣2次，記錄色譜圖。以平均峰面積A為縱坐標(biāo)(Y)，以對照品質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A=19.27C+34.52，R2=0.999 0。結(jié)果表明，綠原酸在9.28～55.68 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，其峰面積與其質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取綠原酸對照品溶液10 μL，分別在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，對照品峰面積結(jié)果見表1，計(jì)算綠原酸對照品的平均峰面積為382.03，RSD=0.18%，結(jié)果表明對照品溶液精密度良好。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取上述供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作，分別于放置0 h、2 h、6 h、8 h、12 h后進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL，記錄色譜圖，測得綠原酸的峰面積結(jié)果見表2，計(jì)算綠原酸平均峰面積為408.01，RSD=1.01%，結(jié)果表明供試品溶液至少在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密吸取供試品溶液2 mL，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的配制方法配制6份，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖，供試品峰面積結(jié)果見表3，計(jì)算得綠原酸平均峰面積為420.71，RSD=1.35%(n=6)，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密移取已知綠原酸含量的同一批號的利咽飲(批號20171-203)2 mL于25 mL容量瓶中，再分別加入綠原酸對照品儲備液1 mL，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，臨用前用微孔濾膜過濾，如此平行配制6份，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)行分析，測定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果表明，平均回收率為99.06%，RSD為0.51%(n=6)，結(jié)果見表4。

表4 利咽飲加樣回收率試驗(yàn)

2.9 樣品測定

取3個批號的利咽飲(批號20171203、20180201、20180611)，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的配制方法，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，按外標(biāo)法計(jì)算含量，平均含量為(0.2320±0.0042)mg/mL。結(jié)果表明，不同批號的樣品中綠原酸的含量差異不大，RSD為1.7%，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，可準(zhǔn)確測定利咽飲中綠原酸的含量，結(jié)果見表5。

表5 利咽飲中綠原酸含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 檢測波長選擇

采用紫外全波長掃描，綠原酸對照品溶液及供試品溶液在327 nm處有最大吸收，靈敏度高，因此選擇在327 nm處檢測綠原酸。

3.2 流動相選擇

忍冬科植物金銀花屬我國來源廣泛、全國各地均有種植的中藥材之一。以其中含有的重要有效成分綠原酸作為主要質(zhì)量控制指標(biāo)之一，參考不同植物中綠原酸的含量測定方法[8-9]，再按照《中華人民共和國藥典》2015年版方法，選擇乙腈與0.4%磷酸水溶液作為流動相。結(jié)果表明，當(dāng)采用乙腈-0.4%磷酸溶液(12∶88)作為流動相時，綠原酸和其后兩個峰的分離度較差，結(jié)果見圖3；當(dāng)采用乙腈-0.4%磷酸溶液(10∶90)作為流動相時，綠原酸和其前面的峰分離度達(dá)不到要求，結(jié)果見圖4；當(dāng)采用乙腈-0.4%磷酸溶液(8∶92)作為流動相時，各峰出峰時間推遲，峰寬增加明顯，峰高降低顯著，柱效降低，綠原酸后兩個峰分離度較差，結(jié)果見圖5；當(dāng)采用乙腈-0.4%磷酸溶液(9∶91)作為流動相時，綠原酸在9.28～55.68 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，峰面積與其質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好，各峰出峰時間適宜，峰形良好，各峰分離度良好，結(jié)果見圖6。故實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-0.4%磷酸溶液(9∶91)作為流動相。

流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液(12∶88)

流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液(10∶90)

流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液(8∶92)

流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液(9∶91)

3.3 利咽飲口服液的質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)

隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，空氣質(zhì)量每況愈下，急慢性咽炎已經(jīng)成為困擾人們生活和學(xué)習(xí)的臨床多發(fā)病、高發(fā)病之一。與現(xiàn)代西醫(yī)相比，中醫(yī)作為我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，對急慢性咽炎的治療，療效更顯著，且副作用較小[10]，在臨床上應(yīng)用廣泛。

利咽飲在湖北省仙桃市第一人民醫(yī)院多年臨床實(shí)踐中取得了良好的治療效果，是治療急慢性咽炎[11]的有效中成藥之一。其具有滋陰清熱、化痰利咽的功效，可用于緩解風(fēng)熱病邪所致的咽噪口干、失音、聲啞等癥狀的治療。方中金銀花與連翹清熱、瀉火、解毒，能消咽喉之腫；玄參清熱涼血滋陰降火，能滋潤咽喉；桔梗與胖大海宣肺祛痰、利咽解毒，能開嗓祛痰。諸藥合用，共奏滋陰清熱、化痰利咽之功效。金銀花作為利咽飲的主要有效成分之一，可用于各種熱病，屬于中醫(yī)清熱解毒的良藥之一，對熱毒瘡癰、咽喉腫痛之證療效顯著[12]。綠原酸是金銀花的主要藥理活性成分之一[13]，在《湖北省醫(yī)院制劑規(guī)范(2011年版)》中，僅對綠原酸進(jìn)行了薄層色譜鑒別，未對其含量進(jìn)行控制。目前中藥中綠原酸的含量測定方法有HPLC法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、紫外分光光度法及高效毛細(xì)管電泳法等[14]，而HPLC法測定的結(jié)果最為準(zhǔn)確，且具有重復(fù)性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。因此，為確保利咽飲的療效，本研究建議將HPLC法測定綠原酸的含量作為其質(zhì)量控制的主要指標(biāo)。

4 結(jié)論

本文建立的利咽飲中綠原酸含量測定方法，經(jīng)方法學(xué)研究表明，具有簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)，該法可作為利咽飲口服液質(zhì)量控制的主要指標(biāo)，為利咽飲口服液的質(zhì)量評價奠定基礎(chǔ)。