梁蓓蕾 逯宜 李蘊(yùn)聰 劉瑞瑞

復(fù)合樹脂由于色澤美觀、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于口腔臨床各種牙體缺損修復(fù)和美容修復(fù)之中[1]，但因其自身理化性質(zhì)制約及聚合收縮引起的結(jié)構(gòu)缺陷，容易在細(xì)菌及其產(chǎn)物的作用下發(fā)生降解，導(dǎo)致修復(fù)體出現(xiàn)邊緣滲漏、繼發(fā)齲乃至脫落失敗[2]。許多學(xué)者曾嘗試在復(fù)合樹脂中添加抗菌劑對(duì)其改性來解決這一問題[3-4]。

納米氧化鋅(nano-ZnO)作為一種新型多功能無機(jī)納米材料，具有優(yōu)良的抗菌性能，同時(shí)兼具納米晶粒的優(yōu)點(diǎn)，其抗菌性能較普通氧化鋅更加出色，已經(jīng)成為無機(jī)抗菌劑研究的熱點(diǎn)之一[5-6]。本實(shí)驗(yàn)將nano-ZnO作為無機(jī)填料的一部分加入復(fù)合樹脂中，通過對(duì)其即刻抗菌性能的測(cè)定及及其抗菌機(jī)制的初步探索，研究nano-ZnO抗菌改性復(fù)合樹脂的可能性，為進(jìn)一步研究探索具有抗菌性能的樹脂提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 雙酚A 雙甲基丙烯酸縮水甘油酯/雙甲基丙烯酸二縮三乙二醇酯(Bis-GMA/TEGDMA)混合物、硅烷化處理的無機(jī)填料、光引發(fā)劑樟腦醌(CQ)、胺促進(jìn)劑(DMAEMA)(Esstech公司，美國(guó))；納米氧化鋅(17 nm,北京博宇高科新材料技術(shù)有限公司)；變形鏈球菌(UA159，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院檢驗(yàn)科)；腦心浸液培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)；鋅(Zn)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning公司，美國(guó))。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 電子天平(Denver公司,美國(guó))；可見光固化燈(Spectram，Dentsply公司，美國(guó))；酶標(biāo)儀(BMG公司，德國(guó))；超純水儀(Millipore公司，美國(guó))；高壓蒸汽滅菌鍋(上海博訊公司)；無菌操作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；MGC厭氧培養(yǎng)罐及厭氧產(chǎn)氣袋(三菱公司，日本)；漩渦混合器(Vortex QL-901，江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；微量加樣器(Eppendorf公司，德國(guó))。

1.2 樣本的制備與分組

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)所用復(fù)合樹脂均在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行配制。實(shí)驗(yàn)組復(fù)合樹脂所含填料由nano-ZnO與硅烷化處理的無機(jī)填料兩部分組成，其添加總量均恒定為70%，依照填料中nano-ZnO所占比例不同設(shè)置3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組(nano-ZnO添加量依次為1%、5%、10%)，空白對(duì)照組填料中不含nano-ZnO。

1.2.2 復(fù)合樹脂的制備 稱取混合樹脂體系(Bis-GMA/TEGDMA)(BGT)，避光條件下加入光引發(fā)體系(CQ和DMAEMA添加量均為1%)，均勻混合后按照實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的填料(表1)，攪拌均勻后避光保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 復(fù)合樹脂各組分組成比例Tab 1 The proportion of modified composite resin

1.2.3 樣本的制備 制作內(nèi)徑 10 mm、厚度2 mm的金屬模具，按照實(shí)驗(yàn)分組分別使用各組對(duì)應(yīng)樹脂制備試件，每組6 個(gè)，充分光固化后脫模，37 ℃條件下浸泡于無菌三蒸水中24 h備用，實(shí)驗(yàn)前使用無菌水反復(fù)沖洗并用70%乙醇溶液消毒擦拭試件表面，無菌水再次沖洗后干燥備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 抗菌性能測(cè)定 取一定量復(fù)蘇后的變形鏈球菌，加入腦心浸液培養(yǎng)基中37 ℃厭氧培養(yǎng)18～20 h(N2：85%，CO2：5%，H2：10%)。將已消毒備用的試件分別放入每孔加有入1.8 ml腦心浸液培養(yǎng)基和0.2 ml菌液的24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后將試件取出，放置于加有10 ml腦心浸液培養(yǎng)基的試管中，劇烈震蕩1 min，充分洗脫試件表面黏附的細(xì)菌。洗脫液倍比稀釋后，接種于腦心浸液瓊脂平板上，厭氧培養(yǎng)24～48 h，以平板上菌落數(shù)為30-300的平板為準(zhǔn)進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，按照下述公式計(jì)算抗菌率。

r(%)=[(b-c)/b]×100%

r:抗細(xì)菌率(%);b:空白對(duì)照試件組的平均菌落數(shù)(CFU/片);c:nano-ZnO改性光固化復(fù)合樹脂試件組的平均菌落數(shù)(CFU/片)。

1.3.2 鋅離子釋放量的測(cè)定 為測(cè)定各組光固化復(fù)合樹脂的鋅離子釋放量，將各組樣本浸泡于裝有4 ml無菌三蒸水的試管中，37 ℃保存，于24 h時(shí)取浸析液，依照鋅(Zn)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明，取10 μl待測(cè)樣本依次與160 μl試劑一、40 μl試劑二進(jìn)行混合，并在37 ℃條件下進(jìn)行孵育。使用560 nm波長(zhǎng)分別于2 次混合后測(cè)定其吸光度值A(chǔ)1，A2，按照下述公式計(jì)算鋅離子濃度，再按照溶液體積計(jì)算相應(yīng)時(shí)期的鋅離子釋放量。

鋅離子濃度(mol/L)=C標(biāo)準(zhǔn)×ΔA測(cè)定/ΔA標(biāo)準(zhǔn)

ΔA=A2-A1

其中，C標(biāo)準(zhǔn)和A標(biāo)準(zhǔn)均為試劑盒中所含鋅離子標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定結(jié)果。

為去除無菌三蒸水中可能含有的離子物質(zhì)所造成的誤差，實(shí)驗(yàn)計(jì)算所得鋅離子釋放量需減去相同劑量無菌三蒸水樣品所得結(jié)果的均值才能作為實(shí)際鋅離子釋放量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過單因素方差分析(one-way ANOVA)比及LSD-t檢驗(yàn)(Fisher's least significant test)多重比較分析各組之間的差異，P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 改性復(fù)合樹脂的即刻抗菌率

不同nano-ZnO添加量改性復(fù)合樹脂的即刻抗菌率如表2所示。各組復(fù)合樹脂樣品培養(yǎng)所得變形鏈球菌菌落生長(zhǎng)情況如圖1所示。

由于1%ZnO組抗菌率數(shù)值過低，為評(píng)估其是否具有抗菌作用，使用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較其與空白組間菌落個(gè)數(shù)的差異，結(jié)果顯示1%ZnO組與空白組間菌落計(jì)數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.408，P=0.692)，可以認(rèn)為nano-ZnO的添加量為1%時(shí)，復(fù)合樹脂未被賦予額外的抗菌性能。

表2 各組nano-ZnO改性復(fù)合樹脂的即刻抗菌率Tab 2 The immediate antibacterial rate of nano-ZnO modified composite resin

注：不同右上標(biāo)數(shù)字序號(hào)表示：不同nano-ZnO添加量改性復(fù)合樹脂組間即刻抗菌率之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

2.2 改性復(fù)合樹脂鋅離子釋放量

各組nano-ZnO添加量改性復(fù)合樹脂浸析液所得鋅離子釋放量如圖2所示。不同nano-ZnO添加量改性復(fù)合樹脂浸析液中鋅離子釋放量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，已有許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注到nano-ZnO的優(yōu)點(diǎn)并對(duì)其應(yīng)用進(jìn)行深入探索。研究[5-7]證實(shí)nano-ZnO抗菌劑對(duì)口腔常見致病菌有較強(qiáng)的抑制殺滅作用，作為根管封閉劑，取得了較普通ZnO封閉劑更明顯的根尖封閉療效；曹香林等[8]研究了以nano-ZnO作為填料組分的熱凝樹脂基托的抗菌性能及機(jī)械性能，結(jié)果顯示在一定的添加劑量?jī)?nèi)，樹脂基托對(duì)變形鏈球菌的抗菌作用隨nano-ZnO含量的提高而逐漸增強(qiáng)；Toledano等[9-11]發(fā)現(xiàn)用含nano-ZnO的粘接劑處理脫礦牙本質(zhì)表面能提高其與樹脂的即刻粘接強(qiáng)度，降低混合層膠原的降解，并具有促進(jìn)齲損組織再礦化的潛力；Tavassoli Hojati等[12]嘗試將nano-ZnO添加在流動(dòng)樹脂當(dāng)中，并證明nano-ZnO可以使流動(dòng)樹脂具備一定的抗菌性能，并且能夠提高流動(dòng)樹脂的粘接強(qiáng)度及部分機(jī)械性能。如上所述，nano-ZnO已在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用，本試驗(yàn)結(jié)果也表明，加入nano-ZnO確實(shí)能夠使復(fù)合樹脂具有抑制變形鏈球菌生長(zhǎng)的能力，且這一抑制能力隨著nano-ZnO含量的增加而逐漸提高。

A:對(duì)照組；B：1% ZnO;C:5% ZnO;D:10% ZnO圖1 各組復(fù)合樹脂即刻抗菌性能測(cè)定的變形鏈球菌菌落生長(zhǎng)情況A:Control;B：1% ZnO;C:5% ZnO;D:10% ZnOFig 1 The growth of Streptococcus mutans colonies in the groups

圖2 各組nano-ZnO改性復(fù)合樹脂浸析液鋅離子釋放量(10-2 μmol)Fig 2 The amount of zinc ions(10-2 μmol) released from the nano-ZnO modified composite resin of each group

目前nano-ZnO的抗菌機(jī)制雖然尚不明確，但有許多學(xué)者認(rèn)為nano-ZnO能夠緩慢的釋放出Zn2+，可以依靠異種電荷間的相互吸引結(jié)合到細(xì)菌表面，破壞細(xì)胞膜的生物性能，抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖；同時(shí)，過剩的Zn2+也穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，與細(xì)菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)，DNA等發(fā)生反應(yīng)，妨礙細(xì)菌的正常功能活動(dòng)及代謝從而達(dá)到抗菌的目的。當(dāng)前細(xì)菌被殺滅之后，Zn2+又會(huì)從細(xì)菌中游離出來，與其他細(xì)菌發(fā)生接觸，再次通過以上機(jī)制發(fā)揮抗菌作用[13-15]。本試驗(yàn)表明，在水溶液體系中，含有nano-ZnO作為填料組分的復(fù)合樹脂均可以檢測(cè)到鋅離子的釋放，同即刻抗菌率所得結(jié)果相同，其釋放量也隨nano-ZnO添加量的增加而增加，這從側(cè)面表明Zn2+的釋放是nano-ZnO重要的抗菌機(jī)制之一。

在實(shí)際臨床操作中，窩洞預(yù)備常無法將病損中的細(xì)菌完全去除干凈，微滲漏建立的通道也使口腔內(nèi)的微生物能夠自由進(jìn)出，然而復(fù)合樹脂相較于其他牙科材料更容易黏附和聚集細(xì)菌。通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明使用nano-ZnO改性復(fù)合樹脂，可以賦予其抗菌活性，對(duì)牙體-充填體界面及充填體表面的細(xì)菌發(fā)揮抑制作用，降低繼發(fā)齲產(chǎn)生的可能性，為臨床新型抗菌牙科材料的研發(fā)提供了必要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其長(zhǎng)效性及更深層次的抗菌機(jī)制的探討還需進(jìn)一步的研究及努力。