葛曉雯，朱 娜，姚家美，高 峰，曾海英，欒麗娟，紀(jì) 元，譚云山，侯英勇

淋巴瘤分為霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma/Hodgkin’s disease, HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma, NHL)。B細(xì)胞型非霍奇金淋巴瘤(B cell non-Hodgkin’s lymphoma, B-NHL)發(fā)病率占淋巴瘤的90%以上，其中彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)發(fā)病率占B-NHL的30%～60%[1-2]，常見于成人。DLBCL分為生發(fā)中心細(xì)胞(germinal center B-cell like, GCB)型和非生發(fā)中心細(xì)胞(non-germinal center B-cell like, non-GCB)型。CD27是腫瘤壞死因子受體超家族的一員，是相對(duì)分子質(zhì)量為5.5×104的Ⅰ型跨膜糖蛋白，與其配體CD70相互作用[3]，參與B細(xì)胞成熟過程，表達(dá)于記憶B細(xì)胞和產(chǎn)免疫球蛋白(Ig)的B細(xì)胞等細(xì)胞表面[3-4]。文獻(xiàn)報(bào)道其在多種B細(xì)胞淋巴瘤表面均有不同程度的表達(dá)[3]，但其表達(dá)的臨床意義仍不明確。本文采用免疫組化EnVision法檢測(cè)DLBCL組織中CD27等蛋白的表達(dá)，同時(shí)采用FISH技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織中MYC、BCL-2、BCL-6基因的重排情況，以進(jìn)一步明確CD27表達(dá)的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2015～2018年復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院確診且臨床資料完整的143例DLBCL作為研究對(duì)象。其中男性77例，女性66例?！?0歲者72例，>60歲者71例，中位年齡60歲。所有DLBCL均依據(jù)WHO(2008)診斷標(biāo)準(zhǔn)和2016年修訂標(biāo)準(zhǔn)[5]確診，并應(yīng)用Hans法則進(jìn)行分型，其中GCB型68例，non-GCB型75例。Ann Arbor分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期28例，Ⅲ期16例，Ⅳ期83例。國際預(yù)后指數(shù)(international prognostic index, IPI)評(píng)分：0分9例，1分29例，2分31例，3分37例，4分患25例，5分12例。HE、免疫組化均由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師閱片證實(shí)，F(xiàn)ISH結(jié)果由3名實(shí)驗(yàn)員分別計(jì)數(shù)，取其平均值。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(B2018-073R)。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 組織芯片經(jīng)切片后行HE染色及免疫組化EnVision染色。一抗包括CD20、PAX-5、CD10、BCL-6、BCL-2、MUM1、C-MYC、CD3、CD5、Ki-67等，購自北京中杉金橋公司，CD27抗體購自美國Proteintech公司。免疫組化試劑盒購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司，利用全自動(dòng)免疫組化染色儀(羅氏公司的BenchMark XT)進(jìn)行染色。結(jié)果判定：CD27陽性定位于細(xì)胞膜。>75%的細(xì)胞無著色為0分，>75%的細(xì)胞淺黃色著色為1分，>75%的細(xì)胞黃色著色為2分，>75%的細(xì)胞棕黃色著色為3分。0～1分為陰性，2～3分為陽性。

1.2.2FISH檢測(cè) 所用探針均購于美國雅培公司(Vysis BCL-2 Break Apart FISH Probe Kit、Vysis BCL-6 Break Apart FISH Probe Kit、Vysis MYC Break Apart FISH Probe Kit)。石蠟切片脫蠟后放入蒸餾水，在82 ℃的蒸餾水中預(yù)處理25～30 min，37 ℃胃蛋白酶(Sigma公司)溶液中消化后梯度乙醇脫水、風(fēng)干，利用Thermo Brite雜交儀(Abbott公司)按探針說明書提供的方法進(jìn)行操作。在熒光顯微鏡(BX5l，Olympus公司)下觀察。結(jié)果判定：正常細(xì)胞顯示2個(gè)紅色、2個(gè)綠色信號(hào)。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)探針屬性，紅、綠信號(hào)分離為陽性信號(hào)。在CD27免疫組化切片上劃出陽性區(qū)域，F(xiàn)ISH讀片時(shí)依據(jù)CD27陽性區(qū)域觀察該區(qū)域內(nèi)BCL-2、BCL-6和MYC基因的重排情況，以該區(qū)域內(nèi)腫瘤細(xì)胞平均出現(xiàn)15%陽性信號(hào)為陽性閾值。每個(gè)標(biāo)本由3名實(shí)驗(yàn)員分別計(jì)數(shù)，取其平均值。本實(shí)驗(yàn)未將“雙打擊”或“三打擊”高級(jí)別B細(xì)胞淋巴瘤病例納入研究對(duì)象。

1.3 隨訪隨訪以門診或電話方式進(jìn)行，所有患者隨訪5～57個(gè)月，隨訪內(nèi)容包括患者生活質(zhì)量、一般情況、近期復(fù)查等。總生存期(overall survival, OS)指自病理確診至因任何原因死亡的時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，DLBCL中CD27表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系行Pearson χ2檢驗(yàn)，若理論頻數(shù)T<5且T≥1，采用χ2檢驗(yàn)的連續(xù)校正公式，若理論頻數(shù)T<1，采用χ2檢驗(yàn)的Fisher精確概率法。生存分析采用Kaplan-Meier分析。以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DLBCL組織中CD27的表達(dá)CD27蛋白的表達(dá)定位于細(xì)胞膜，代表性FISH陽性結(jié)果見圖1。3種FISH探針陽性信號(hào)均為紅綠分離。本組實(shí)驗(yàn)中MYC、BCL-2和BCL-6基因易位發(fā)生率分別為8.4%、8.4%和25.2%，本實(shí)驗(yàn)未將“雙打擊”或“三打擊”高級(jí)別B細(xì)胞淋巴瘤病例納入研究對(duì)象。143例DLBCL中CD27的0分者27例(18.9%)，1分者70例(49.0%)，2分者32例(22.4%)，3分者14例(9.8%)(圖2)。按本實(shí)驗(yàn)0～1分定義為CD27陰性，2～3分定義為CD27陽性，CD27蛋白陽性者46例，陽性率為32.2%。

圖1 CD27在DLBCL中的表達(dá)，EnVision法：A.0分；B.1分；C.2分；D.3分；E.FISH檢測(cè)MYC基因重排陽性(箭頭)；F.FISH檢測(cè)BCL-2基因重排陽性(箭頭)；G.FISH檢測(cè)BCL-6基因重排陽性(箭頭)

圖2 CD27在DLBCL中的表達(dá)分布

2.2 DLBCL中CD27表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系χ2檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CD27陽性組中BCL-2基因重排陽性率(17.4%)明顯高于CD27陰性組(4.1%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CD27蛋白陰性組及CD27蛋白陽性組的患者年齡、性別、Hans分型、Ann Arbor分期、IPI評(píng)分、MYC基因重排及BCL-6基因重排等相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 DLBCL中CD27表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

*P<0.05；△連續(xù)性校正的χ2檢驗(yàn)

2.3 DLBCL組織中CD27蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系本組143例DLBCL患者隨訪5～57個(gè)月，其中46例CD27陽性患者中14例因疾病死亡，32例至隨訪結(jié)束仍生存；97例CD27陰性組患者中15例因疾病死亡，82例患者至隨訪結(jié)束仍生存。CD27陽性組患者病死率(30.4%，14/46)明顯高于CD27陰性組(15.5%，15/97)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.326，P=0.038)。CD27陽性組OS為(33.8±2.5)個(gè)月(95%CI=28.8～38.8個(gè)月)。CD27陰性組OS為(49.4±1.8)個(gè)月(95%CI=45.8～53.0個(gè)月)。Kaplan-Meier生存曲線示，CD27陽性者與陰性者的生存曲線差異有顯著性(χ2=4.485，P=0.034)，陽性組OS較短(圖3)。

圖3 CD27陽性組和CD27陰性組DLBCL患者的生存曲線

3 討論

CD27主要表達(dá)于記憶性B細(xì)胞、生發(fā)中心的B細(xì)胞、幼稚T細(xì)胞、記憶性T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等細(xì)胞表面[3]。正常淋巴組織中CD27表達(dá)于濾泡邊緣區(qū)和生發(fā)中心的B淋巴細(xì)胞，不表達(dá)于套區(qū)。CD27與其配體CD70結(jié)合后促進(jìn)T細(xì)胞的活化與增殖，誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞與記憶T細(xì)胞的分化與形成[3]。原始B細(xì)胞不表達(dá)CD27，然而當(dāng)B細(xì)胞受體被激活后，CD27可以長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)于B細(xì)胞表面，并且在B淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化等活動(dòng)中起重要作用。CD27蛋白也可以在B細(xì)胞淋巴瘤的細(xì)胞表面表達(dá)。有研究顯示廣泛的B細(xì)胞淋巴瘤表達(dá)CD27，如慢性淋巴細(xì)胞白血病/小淋巴細(xì)胞淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤、漿細(xì)胞瘤/多發(fā)性骨髓瘤、濾泡性淋巴瘤和彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤等[3]，前體B淋巴母細(xì)胞淋巴瘤/白血病未見CD27的表達(dá)。雖然CD27被認(rèn)為是幼稚和記憶B細(xì)胞的表面標(biāo)志物[6]，表達(dá)于淋巴瘤細(xì)胞表面時(shí)，不能提示其細(xì)胞來源。越來越多的研究證明，CD27表達(dá)與淋巴瘤細(xì)胞生存、免疫逃逸等密切相關(guān)。可溶性CD27(sCD27)在Waldenstr?m巨球蛋白血癥腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，應(yīng)用CD27配體CD70的單抗后，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制[7]。Jak等[8]研究發(fā)現(xiàn)慢性淋巴細(xì)胞白血病/小淋巴細(xì)胞淋巴瘤組織中通過CD70誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)數(shù)量增多，且這種Tregs不易凋亡，提示CD27/CD70通路能誘導(dǎo)腫瘤的免疫逃逸。本組143例DLBCL患者中，CD27蛋白陽性者46例，陽性率為32.2%，CD27陽性者與陰性者的Kaplan-Meier生存曲線差異有顯著性(χ2=4.485，P=0.034)，陽性組生存期較短，提示CD27高表達(dá)與DLBCL的不良預(yù)后有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)DLBCL患者中，MYC基因易位發(fā)生率約為14%，BCL-2基因易位發(fā)生率約為21%，而BCL-6基因易位發(fā)生率約為31%[9]。本組中MYC、BCL-2和BCL-6基因易位發(fā)生率分別為8.4%、8.4%和25.2%，略低于文獻(xiàn)報(bào)道的水平，可能與人群的地區(qū)差異及樣本量差異有關(guān)。根據(jù)WHO(2016)淋巴組織腫瘤分類[5]，將以往的介于Burkitt淋巴瘤與DLBCL形態(tài)之間的“灰區(qū)”淋巴瘤歸為高級(jí)別B細(xì)胞淋巴瘤，其中發(fā)生MYC、BCL-2和(或)BCL-6基因重排的高級(jí)別B細(xì)胞淋巴瘤劃分為新的獨(dú)立類型，稱為“雙打擊”或“三打擊”高級(jí)別B細(xì)胞淋巴瘤，其發(fā)生率為6%～13%[10]，而未發(fā)生者稱為高級(jí)別B細(xì)胞淋巴瘤，非特指型。目前有研究表明，發(fā)生MYC、BCL-2和(或)BCL-6基因重排的“雙打擊”或“三打擊”高級(jí)別B細(xì)胞淋巴瘤患者預(yù)后較差，不管臨床上給予任何治療方案，其中位生存期僅2個(gè)月～1.5年[11-13]。為了避免“雙打擊”或“三打擊”對(duì)患者預(yù)后的影響，本實(shí)驗(yàn)未將“雙打擊”或“三打擊”高級(jí)別B細(xì)胞淋巴瘤納入分析對(duì)象。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約65%的雙打擊淋巴瘤發(fā)生的是MYC和BCL-2易位，約14%的雙打擊淋巴瘤發(fā)生的是MYC和BCL-6易位[14]。BCL-2是抗凋亡的原癌基因，位于染色體18q21，編碼抗凋亡蛋白，可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)生染色體(14；18)(q32；q21)易位后，會(huì)導(dǎo)致BCL-2與IgH基因融合，使BCL-2蛋白異常高表達(dá)。已知BCL-2在多種腫瘤中過表達(dá)，并且與耐藥相關(guān)[15]。BCL-2蛋白表達(dá)與DLBCL患者腫瘤的Ann Arbor分期有關(guān)[16]。有研究顯示，BCL-2的過表達(dá)與DLBCL的不良預(yù)后有關(guān)[17]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)的BCL-2重排可以作為DLBCL患者OS較低的預(yù)后指標(biāo)[9,18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CD27陽性組BCL-2重排陽性率(17.4%)明顯高于CD27陰性組(4.1%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但本組實(shí)驗(yàn)樣本量有限，在大樣本中是否存在這樣的內(nèi)在聯(lián)系及其內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步更深入的探討。

DLBCL患者的預(yù)后隨著治療方案的優(yōu)化已經(jīng)取得了明顯的改善，但仍有約1/3的患者最終死于耐藥或疾病復(fù)發(fā)[19]，其耐藥的具體分子機(jī)制目前尚不明確。在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代，研究影響DLBCL預(yù)后的因素有助于對(duì)不同患者制定更具有針對(duì)性的精準(zhǔn)治療方案。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，CD27高表達(dá)與DLBCL的不良預(yù)后有關(guān)，CD27有望成為評(píng)估DLBCL預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物之一。