王嬋娟 崔 蕾 李偉京 趙曉曦 高 超 吳敏媛 王天有 李志剛

在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)中，T細(xì)胞ALL(T-ALL)占10%～15%，其早期誘導(dǎo)死亡率高，緩解后易復(fù)發(fā)，預(yù)后明顯較前體B細(xì)胞ALL差[1]。定量監(jiān)測微小殘留病(MRD)水平有助于精確評估ALL患兒的復(fù)發(fā)風(fēng)險，指導(dǎo)治療方案和化療強(qiáng)度的調(diào)整，實施個體化精準(zhǔn)治療[2]。免疫球蛋白(Ig)和T細(xì)胞受體(TCR)合稱淋巴細(xì)胞抗原識別受體，在干細(xì)胞向淋巴細(xì)胞分化過程中，Ig/TCR原先分隔的胚系基因片段V、(D)、J發(fā)生重排，所形成的連接區(qū)序列可作為腫瘤特異性的標(biāo)志來追蹤MRD[3]。Ig/TCR基因重排模式在T-ALL與B前體ALL中不同，T-ALL中MRD水平及其對預(yù)后的意義與B前體ALL相比也有一定的差異[4]。本研究采用歐洲BIOMED-2協(xié)作組提出的標(biāo)準(zhǔn)化Ig/TCR基因重排PCR擴(kuò)增體系[5,6]，對兒童T-ALL初診時抗原受體基因重排進(jìn)行檢測，以獲取患兒特異性Ig/TCR基因克隆性重排的基因序列信息，為檢測MRD提供理論依據(jù)，并探討了Ig/TCR基因重排情況與患兒臨床特征的關(guān)系。

1 方法

1.1 知情同意和倫理 患兒家長在診斷和治療T-ALL時簽署知情同意書。本研究方案通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院(我院)倫理委員會審批(審批號：2019-k-99)。

1.2 病例納入標(biāo)準(zhǔn) ①我院2005年1月1日至2008年12月31日收治的初治T-ALL患兒；②患兒在我院生物樣本庫中有足量臨床檢查剩余的初診骨髓樣本(≥ 1×107個細(xì)胞)可行Ig/TCR基因重排及SIL-TAL1融合基因檢測。

1.3 病例排除標(biāo)準(zhǔn) ①確診T-ALL后未按照既定方案治療者；②入我院前曾在其他醫(yī)院接受化療者。

1.4Ig/TCR基因重排及SIL-TAL1融合基因檢測

1.4.1 骨髓單個核細(xì)胞DNA的提取 抽取患兒骨髓2 mL，用紅細(xì)胞裂解液(美國BD公司)分離單個核細(xì)胞，凍存于-80℃冰箱待用。采用血DNA提取試劑盒(安徽優(yōu)晶生物工程有限公司)提取基因組DNA。紫外分光光度計檢測提取DNA的質(zhì)量并進(jìn)行定量，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 多重PCR方法擴(kuò)增克隆性Ig/TCR基因重排 采用BIOMED-2協(xié)作組建議的多重PCR體系[6]擴(kuò)增初診骨髓單個核細(xì)胞基因組DNA，篩選克隆性TCRB、TCRG、TCRD和IgH基因重排，設(shè)11個平行PCR管(表1)。PCR擴(kuò)增體系：12.5 μL反應(yīng)體系，含5×Gold Buffer(英國AB基因公司)2.5 μL，MgCl 21.5 mmol·L-1，上下游引物各2.5 pmol，Taq DNA聚合酶(北京大學(xué)第一醫(yī)院卜定方教授惠贈)0.25 U，DNA模板 100 ng。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性7 min， 95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。陰性對照為在我院血液科病房住院的非白血病患兒外周血單個核細(xì)胞提取的DNA和水。

1.4.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染色，目的片段處出現(xiàn)單一條帶且邊緣清晰者為單克隆基因重排；2個條帶為雙等位基因或雙克隆基因重排；≥3個條帶考慮為寡克??；條帶邊緣模糊者為多克??；無條帶或條帶極弱者為陰性。目的片段大小見表1。

1.4.4 DNA序列測定及連接區(qū)分析 按1.4.2中的PCR擴(kuò)增體系和條件，反應(yīng)總體積擴(kuò)大至50 μL，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司采用ABI PRISM3730型測序儀進(jìn)行純化測序。將DNA序列輸入IMGT 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(http://imgt.cines.fr)，分析白血病患兒的特異性結(jié)合部位Ig/TCR重排靶基因序列。

表1 多重PCR方法擴(kuò)增克隆性Ig/TCR基因重排的類型

1.4.5SIL-TAL1融合基因的檢測 用Trizol試劑(美國Invitrogen 公司)按照說明書提取患兒初診時骨髓樣本中的單個核細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA純度和濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司)將2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用逆轉(zhuǎn)錄多重巢式聚合酶鏈反應(yīng)方法檢測樣本中的白血病特異性融合基因SIL-TAL1，方法和引物參照文獻(xiàn) [8]。

1.5 T-ALL的治療和早期治療反應(yīng)評估 我院2005年1月1日至2008年4月1日首次入院的初診T-ALL病例，采用我院BCH-2003 ALL方案治療，2008年4月1日至2008年12月31日收治的初診病例采用中國兒童白血病協(xié)作組CCLG-ALL2008方案治療。T-ALL根據(jù)危險度評估[7]予中危或高危方案治療。

1.6 隨訪 患兒停藥后每半年至1年來我院隨訪，隨訪內(nèi)容包括外周血細(xì)胞分析和免疫功能檢查。本研究隨訪截止日期為2018年12月31日，根據(jù)門診或住院病歷記錄判斷其是否發(fā)生不良事件(包括復(fù)發(fā)、死亡、第二腫瘤)，如無這些不良事件發(fā)生，通過電話隨訪其預(yù)后情況。①骨髓復(fù)發(fā)：第一次完全緩解后骨髓中原始及幼稚淋巴細(xì)胞≥25%。②CNS復(fù)發(fā)：初診時無CNS受累或初診時為腦膜白血病而之后腦脊液呈陰性的患兒，在治療過程中腦脊液中原始及幼稚淋巴細(xì)胞>5個/μL，或完全緩解后出現(xiàn)顱神經(jīng)損傷或腦組織受累。③睪丸白血病復(fù)發(fā)：完全緩解后組織活檢提示原始或幼稚淋巴細(xì)胞浸潤。④聯(lián)合復(fù)發(fā)：髓外復(fù)發(fā)同時骨髓中原始及幼稚淋巴細(xì)胞≥5%。⑤長期緩解標(biāo)準(zhǔn)：患兒停藥后無復(fù)發(fā)、死亡、第二腫瘤等事件的發(fā)生。

1.7 資料采集 ①患兒入院時的年齡、性別、初診時WBC、免疫表型、融合基因SIL-TAL1的檢測情況、危險度；②治療方案及早期治療反應(yīng)；③初診和復(fù)發(fā)時的Ig/TCR基因重排檢測結(jié)果；④隨訪情況和預(yù)后。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS16.0 for windows軟件包(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)進(jìn)行分析。采用精確概率法χ2檢驗比較陽性組與陰性組在臨床、生物學(xué)特征方面及早期治療反應(yīng)的差異。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 共52例T-ALL兒童進(jìn)入本文分析，男37例(71.2%)；入院時中位年齡8.0(1.8～16.0)歲；初診時WBC中位數(shù)140.5(2.7～667.1)×109·L-1。所有病例均經(jīng)臨床、骨髓形態(tài)、組織化學(xué)染色、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)確診和分型。

中危38例(73.1%)、高危14例(26.9%)。采用BCH-2003 ALL方案治療40例，采用CCLG-ALL2008方案治療12例。第8 d強(qiáng)的松反應(yīng)好39例(75.0%)、差13例(25.0%)；第33 d緩解率90.4%(47/52)；第33 d MRD共檢測48例，<10-4為10例(19.2%)、～10-2為23例(44.2%)、 ≥10-2為15例(28.8%)；第78 d MRD 共檢測43例，<10-3為36例(69.2%)、 ≥10-3為7例(13.5%)。

中位隨訪時間為136.3(1.2～171.7)個月，長期完全緩解38例(73.1%)、 復(fù)發(fā)10例(19.2%)，其他原因死亡4例(7.7%)。

52例中，SIL-TAL1融合基因陽性14例(26.9%)。

2.2Ig/TCR基因重排在兒童T-ALL中的檢測情況

2.2.1 克隆性Ig/TCR基因重排的發(fā)生率 94%(49/52)兒童T-ALL中TCRB、TCRG、TCRD和IgH4種Ig/TCR基因重排至少檢出1種，3例患兒4種重排均未檢出，88%(46/52)至少檢出2種重排。TCR基因重排中TCRB、TCRG、TCRD基因重排的發(fā)生率分別為85%(44例)、85%(44例)和38%(20例)，其中27例(52%)檢出3種TCR重排，44例(85%)檢出2種TCR重排，5例(10%)檢出1種TCR重排。TCRB和TCRG均陽性42例(81%)；TCRB和TCRD均陽性、TCRG和TCRD均陽性患兒均為16例(31%)。IgH重排跨系表達(dá)陽性11例(21%)，91%(10/11)的IgH重排陽性患兒同時為TCRD重排陽性，1例IgH重排陽性的患兒TCRD重排為陰性，P<0.001。

在44例TCRB重排陽性患兒中，61%(26/44)為單克隆，27%(12/44)為雙克隆/雙等位基因重排，12%(5/44)為寡克隆。TCRG重排中，27%(12/44)為單克隆，68%(30/44)為雙克隆/雙等位基因重排，5%(2/44)為寡克隆。TCRD重排中單克隆占70%(14/20)，其余30%為雙克隆/雙等位基因重排。11例IgH重排陽性患兒中82%(9/11)為單克隆，雙克隆/雙等位基因重排和寡克隆各1例。

2.2.2Ig/TCR基因重排類型和胚系片段使用情況 在49例Ig/TCR基因重排陽性患兒中，共檢出180種克隆性基因重排，包括66種TCRB重排、74 種TCRG重排、26種TCRD重排和14種IgH重排，見表2。

表2 Ig/TCR基因重排在兒童T-ALL中的類型和胚系片段情況

66個TCRB克隆中，完全性Vβ-(Dβ)-Jβ重排占62% (41/66)，不完全性Dβ-Jβ重排占38%(25/66)。TCRB完全重排中，共檢出24種Vβ片段， Vβ15、Vβ18、Vβ19、Vβ28和 Vβ7-2都較常見；D片段中Dβ1與Dβ2使用頻率分別為49%和44%，有7%的完全重排未使用Dβ片段。在TCRB不完全重排中，Dβ1、Dβ2分別占52%和48%。不論是TCRB完全重排還是不完全重排，Jβ2都比Jβ1使用頻繁，其中Jβ2.1、Jβ2.3和 Jβ2.7使用均較多(均為15%)，其次為Jβ1. 2(14%)，未發(fā)現(xiàn)Jβ2.4和 Jβ2.6的使用。

在檢出的74個TCRG克隆中，以VγⅠ-Jγ1.3/2.3檢出率最高(69%)，其次為VγⅡ-Jγ1.3/2.3(21%)、VγⅢ-Jγ1.3/2.3(7%)和VγⅠ-Jγ1.1/2.1(3%)。Vγ片段中VγⅠ家族使用最頻繁(72%)，包括Vγ3(22%)、Vγ2(15%)、Vγ5(15%)、Vγ4(12%)、Vγ8(8%)；VγⅡ家族(Vγ9)檢出率為22%；VγⅢ家族(Vγ10)為6%；未檢出VγⅣ家族。

檢出的26個TCRD克隆中以Vδ-Jδ完全重排為主(66%)，其中以Vδ1-Jδ1重排最常見(27%)，檢出少見的Jδ3重排2例。不完全重排Dδ2- Dδ3、Dδ2-Jδ1和Vδ2-Dδ3的發(fā)生率依次為19%、11%和4%。

14種IgH基因重排中包括12個(86%)DH-JH不完全重排和2個(14%)VH-DH-JH完全重排。DH片段使用頻率最多的為DH6-19和DH7-27(均為21%)，還有DH1-1、DH1-7、DH1-20、DH1-26、DH2-21、DH4-4和DH5-18等。JH片段使用頻率依次為JH4(50%)、JH1(21%)、JH3(17%)、JH5 (8%)和JH6(8%)，未檢出JH2。

2.2.3Ig/TCR基因重排的連接區(qū)特點(diǎn) 表3顯示，TCRDVδ-Jδ完全重排連接區(qū)插入的核苷酸數(shù)中位數(shù)為23.0 b p，Vδ3'端和Jδ5'端刪除的核苷酸數(shù)中位數(shù)分別為1.5 bp和1.0 bp；TCRG重排連接區(qū)序列較小，插入核苷酸中位數(shù)為7.0 bp。TCRB完全重排與不完全重排在Dβ-Jβ連接部位核苷酸的插入和刪除數(shù)目相近。IgH的完全性VH-DH-JH重排連接區(qū)插入核苷酸數(shù)(N1區(qū)中位數(shù)10.5 bp和N2區(qū)中位數(shù)14.0 bp)高于不完全DH-JH重排(中位數(shù)9.0 bp)。

2.2.4 初診與復(fù)發(fā)時Ig/TCR基因重排模式比較 10例復(fù)發(fā)患兒中6例檢測了復(fù)發(fā)時的Ig/TCR基因重排模式，4例Ig/TCR基因重排模式(基因重排類型、胚系片段使用情況及連接區(qū)序列)與初診時完全一致，2例改變。1例復(fù)發(fā)時TCRD單克隆基因重排消失，TCRB和TCRG基因重排保持不變。另1例復(fù)發(fā)時1個TCRBDβ-Jβ不完全重排消失，另1個Vβ-(Dβ)-Jβ和TCRG重排與初診時完全相同。

2.3Ig/TCR基因重排與T-ALL患兒臨床生物學(xué)特征的關(guān)系 表4顯示，TCRB基因重排陽性和陰性患兒中高危組比例分別為20.5%(9/44)和62.5%(5/8)，P=0.025。TCRB或TCRG基因重排陽性患兒的第33 d緩解率為89.4%(42/44)，陰性患兒為10.6%(5/8)，P=0.022。TCRB或TCRG基因重排陽性患兒第78天MRD水平(≥10-3)為10.8%(4/37)，陰性患兒為50.0%(3/6)，P=0.045。

表3 Ig/TCR基因重排連接區(qū)核苷酸插入、刪除情況(核苷酸中位數(shù)，bp)

表4 兒童T-ALL中Ig/TCR基因重排與臨床生物學(xué)特征的相關(guān)性(n )

SIL-TAL1融合基因陽性率在11例IgH重排陽性患兒中為0，在41例IgH重排陰性患兒中為34.1%(14/41)，P=0.025。

3 討論

在T細(xì)胞分化過程中，TCRD、TCRG基因相繼發(fā)生重排并表達(dá)TCRγδ，或接下來發(fā)生TCRB重排和TCRD缺失，TCRA基因重排通常發(fā)生于T細(xì)胞發(fā)育晚期，隨后可能出現(xiàn)TCRαβ表達(dá)[9,10]。由于胚系基因片段數(shù)量多，連接區(qū)核苷酸的隨機(jī)插入與刪除，導(dǎo)致重排后的核苷酸序列極富多樣性。白血病是惡性增殖性克隆性疾病，每個患者體內(nèi)的白血病細(xì)胞都具有各自特異的基因重排序列，這一特定的序列可作為該惡性克隆的分子標(biāo)志[11]。TCRA的胚系基因片段數(shù)量眾多，且基因重排方式復(fù)雜，一般不作為MRD監(jiān)測的標(biāo)志。此外，Ig家族中的IgH基因重排在T-ALL中存在跨系表達(dá)[12]，而IGL和IGK則鮮有報道。因此，本研究選擇TCRB、TCRG、TCRD和IgH基因重排進(jìn)行檢測。

TCRB基因重排不僅見于TCRαβ+T-ALL中，在多數(shù)TCRγδ+T-ALL中也可發(fā)生。本研究中TCRB基因重排在兒童T-ALL中檢出率為85%，與國外報道(70%～90%)相近，胚系片段使用情況與文獻(xiàn)一致[13]。TCRB連接區(qū)插入和刪除核苷酸數(shù)目變化較大，序列多樣性豐富，加上胚系片段數(shù)量眾多，使得MRD檢測具有較高的敏感度和特異性，90%以上T-ALL中MRD檢測的定量范圍可達(dá)到10-4 [14]。因此，TCRB基因重排是T-ALL MRD檢測理想的分子標(biāo)志。

TCRG基因重排也是T-ALL的主要標(biāo)志之一，本研究中85%病例有TCRG重排，68%病例檢測到2個TCRG重排，以VγⅠ-Jγ1.3/2.3重排發(fā)生頻率最高(69%)。不同國家的研究對于兒童T-ALL中TCRG重排檢出率為60%～90%，且重排模式也有差異。歐洲和印度的研究顯示TCRG重排中以VγⅠ-Jγ1.3/2.3為主要重排類型(55%～60%)，與本研究相似，而巴西報道則以VγⅡ-Jγ1.3/2.3重排最多見(46%)[15-17]。因而抗原受體基因重排在ALL中的表達(dá)模式可能存在種族和地區(qū)的差異。但是由于TCRG胚系基因種類較少，連接區(qū)多樣性有限，導(dǎo)致在定量PCR過程中產(chǎn)生較高的背景擴(kuò)增，降低了檢測的敏感度。在一些以TCRG為標(biāo)志進(jìn)行MRD的研究中，只有67%的T-ALL中定量范圍達(dá)到10-4，在前體B-ALL中僅為21%，因而限制了其在MRD檢測中的應(yīng)用[18]。TCRD基因重排主要發(fā)生于TCRγδ+ALL及未成熟T-ALL中，本研究顯示TCRD以Vδ-Jδ完全重排為主，Vδ-Jδ連接區(qū)序列核苷酸插入數(shù)目較多，因而比較適于MRD的定量檢測。IgH基因重排在T-ALL中以DH-JH不完全重排為主，可以作為TCR重排檢測的有益補(bǔ)充。

本研究還對6例患兒初診和復(fù)發(fā)時抗原受體基因重排模式進(jìn)行比較，大多數(shù)保持穩(wěn)定，無克隆消失，未見新增克隆。在2例患兒中，均各有1個重排消失(分別為TCRD重排和Dβ-Jβ不完全重排)，考慮為該重排所代表的克隆被化療消滅所致，也可能是發(fā)生克隆演化。這2例患兒中的其他2個基因重排均保持不變。因此在MRD檢測中，對于每例患者建議同時檢測至少2個Ig/TCR靶分子，以減少假陰性率[19]。

本研究還對Ig/TCR基因重排與T-ALL患兒臨床生物學(xué)特征進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)TCRB或TCRG基因重排陽性患兒的第33 d緩解率高于重排陰性患兒，第78 d MRD水平明顯低于重排陰性患兒，TCRB基因重排陽性患兒中高危組比例明顯低于TCRB陰性患兒。本文發(fā)現(xiàn)IgH重排與SIL-TAL1融合基因相關(guān)，SIL-TAL1陽性患兒均未檢出IgH重排；既往本課題組研究發(fā)現(xiàn)，SIL-TAL1陽性T-ALL患兒具有診斷時外周血WBC水平較高、對早期強(qiáng)化治療反應(yīng)性較差的臨床特點(diǎn)。

一些研究顯示，Ig/TCR重排在ALL中的表達(dá)模式存在種族、地區(qū)、年齡、免疫表型和基因型的差異。歐洲BIOMED-2協(xié)作組于2003年提出標(biāo)準(zhǔn)化Ig/TCR基因重排PCR擴(kuò)增體系，為不同實驗室間的結(jié)果比較提供了有利條件。本文采用該體系的PCR 引物擴(kuò)增Ig/TCR基因重排，絕大多數(shù)(94%)兒童T-ALL中存在至少1種Ig/TCR基因重排，88%的患兒具有兩種重排。每個患兒都具有特異性的連接區(qū)序列，可作為兒童T-ALL治療中監(jiān)測MRD的指標(biāo)。

綜上所述，T-ALL初診時Ig/TCR基因重排模式特點(diǎn)的分析顯示，克隆性基因重排的胚系片段使用和連接區(qū)序列極具多樣性，分析T-ALL兒童初診時Ig/TCR基因重排的DNA序列信息，有助于進(jìn)一步行MRD檢測標(biāo)志物的篩選。