王娜娜，王岳君，馮天一，黃偉超，章俊生，孟 剛,3

胃癌是全球第二大腫瘤相關(guān)性致死因素[1]。根治性手術(shù)是治療胃癌的主要方法，但胃癌患者初期癥狀隱匿，超過半數(shù)患者在疾病進(jìn)展期時(shí)被確診。侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌患者復(fù)發(fā)和死亡的主要原因。長(zhǎng)期以來腫瘤微環(huán)境一直被認(rèn)為在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[2]；在腫瘤微環(huán)境的眾多因素中，炎癥介質(zhì)與腫瘤的進(jìn)展關(guān)系密切[3]。由于IL-8是腫瘤微環(huán)境的重要組分，也是維持癌細(xì)胞干性的關(guān)鍵細(xì)胞因子，趨化因子與其受體相互作用與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)[4]。目前，關(guān)于IL-8的受體CXCR1在胃癌組織中表達(dá)的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)收集141例胃癌患者的臨床病理資料，初步探討CXCR1在胃癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系，旨在提高臨床和病理醫(yī)師的認(rèn)識(shí)水平。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2015～2019年安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院存檔的行胃癌根治性切除標(biāo)本141例，所有病例均為首發(fā)，并經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為胃癌，術(shù)前均未行放、化療等抗腫瘤治療。另收集癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁>5 cm正常胃黏膜標(biāo)本作為對(duì)照?；颊吣挲g26～85歲，中位年齡67歲，男性102例，女性39例。所有組織標(biāo)本均經(jīng)石蠟包埋，每張切片厚3 μm，備用。臨床分期(TNM)：T1/2，N0：26例；T1/2，N+：5例；T3/T4a，N0：22例；T3/T4a，N+：82例；T4b，M+：6例。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2 方法選取胃癌組織和癌旁正常胃黏膜組織的存檔蠟塊，3 μm厚連續(xù)切片。免疫組化采用MaxVision兩步法染色，一抗IL-8RA(CXCR1)(鼠單克隆抗體B-1，1 ∶300)購自Santa Cruz公司，CK(鼠單克隆抗體，AE1/AE3)及其余相關(guān)試劑均購自福州邁新公司。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，組織內(nèi)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等作為陽性內(nèi)對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷所有切片均采用數(shù)字掃描儀轉(zhuǎn)換成數(shù)字切片，免疫組化染色由兩位病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行半定量評(píng)分[5]，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，對(duì)陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度和所占百分比進(jìn)行評(píng)分。CXCR1陽性著色定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，以中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等作為陽性內(nèi)對(duì)照。(1)按腫瘤細(xì)胞陽性染色強(qiáng)度計(jì)分：未著色為0分，淡黃色為1分，中等棕黃色2分，深棕褐色為3分；(2)按腫瘤細(xì)胞著色的百分比計(jì)分：無陽性細(xì)胞為0分，≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，>80%為4分；將上述兩項(xiàng)評(píng)分結(jié)果相乘：<3分為陰性，≥3分為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)CXCR1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)特點(diǎn)和與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，分類變量采用頻率描述。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌旁正常胃黏膜及胃癌組織中CXCR1的表達(dá)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CXCR1在癌旁正常胃黏膜組織表達(dá)較弱或不表達(dá)，表達(dá)于嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞表面和部分胃癌細(xì)胞表面，其陽性率與腫瘤的分化程度有關(guān)。胃癌組織高+中分化組陽性率為36.5%，明顯低于低分化組(64.1%)(P=0.001 1，圖1)。

2.2 胃癌組織中CXCR1的表達(dá)141例胃癌有脈管侵犯組織中，CXCR1陽性者63例(61.8%)；明顯高于無脈管內(nèi)侵犯的胃癌組(25.6%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 1)。本組采用免疫組化MaxVision兩步法和HE染色，鏡下可見CXCR1、CK在胃癌脈管內(nèi)癌栓或胃癌組織中表達(dá)時(shí)常伴中性粒細(xì)胞簇的存在，且中性粒細(xì)胞的形態(tài)有差異(圖2)。

2.3 胃癌中CXCR1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系141例胃癌組織中，CXCR1陽性73例(51.78%)，CXCR1陰性68例(48.22%)；CXCR1表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)；與胃癌分化(P=0.001 1)、腫瘤浸潤深度(P=0.017 0)、脈管侵犯(P=0.000 1)、神經(jīng)侵犯(P=0.000 1)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.000 1)、TNM分期(P=0.004 1)均有關(guān)(表1)。

3 討論

CXCR1基因組首先由Holmes等[6]成功克隆。人類CXCR1基因定位于染色體2q35，包含2個(gè)外顯子與1個(gè)長(zhǎng)約1.7 kb的內(nèi)含子，包含1個(gè)糖基化N-端和1個(gè)具有7次跨膜域的G蛋白偶聯(lián)受體[7]。CXCR1在機(jī)體內(nèi)主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞表面，當(dāng)有外來病原體入侵時(shí)，炎癥組織釋放IL-8等趨化因子，經(jīng)血液循環(huán)與中性粒細(xì)胞表面的CXCR1/2結(jié)合，從而趨化中性粒細(xì)胞遷移至炎癥發(fā)生部位吞噬和殺滅病原體[8]。IL-8與其受體的結(jié)合可導(dǎo)致多個(gè)主要下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活，其中包括：磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT，磷脂酶C(PLC)/蛋白激酶C(PKC)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，Rho家族GTP酶和Janus激酶(JAK)等，從而在多方面促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展[9]。有研究表明[10]，CXCL8/CXCR1除具有免疫調(diào)節(jié)作用外，還能影響腫瘤的微環(huán)境、調(diào)節(jié)腫瘤血管形成。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，關(guān)鍵在于腫瘤細(xì)胞的增殖、黏附、遷移、血管生成和免疫逃避的能力[11]。CXCR1/2受體在卵巢癌、肝細(xì)胞癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌、鼻咽癌、乳腺癌等腫瘤中均高表達(dá)，且與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成有關(guān)[12-15]，分析表明腫瘤細(xì)胞可分泌大量IL-8，與自身或其他腫瘤細(xì)胞表面的CXCR1/2受體結(jié)合，從而促進(jìn)腫瘤組織的血管生成、腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞可以受到某些趨化因子的趨化作用而發(fā)生遷移，該性質(zhì)類似于某些炎細(xì)胞的特性，如中性粒細(xì)胞；Bi等[16]研究表明，腎癌組織細(xì)胞分泌的IL-8，可促進(jìn)腫瘤間質(zhì)干細(xì)胞的遷移，人類多種腫瘤的發(fā)生涉及到上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchy-mal transition, EMT)[17]，目前其具體的機(jī)制尚不清楚。

圖1 A.CXCR1在癌旁正常胃黏膜組織中呈陰性，MaxVision兩步法；B.CXCR1在部分高分化胃癌組織中呈陰性，MaxVision兩步法；C.CXCR1在部分中分化胃癌組織中呈陽性，MaxVision兩步法；D.CXCR1在部分低分化胃癌組織中呈陽性，MaxVision兩步法 圖2 A.胃癌脈管內(nèi)癌栓及周圍散在的腫瘤細(xì)胞中CXCR1呈細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)陽性，MaxVision兩步法；B.胃癌脈管內(nèi)癌栓及脈管周圍大量散在的腫瘤細(xì)胞中CK呈陽性，MaxVision兩步法；C.胃癌脈管內(nèi)癌栓旁伴大量中性粒細(xì)胞浸潤；D.腫瘤周圍中心粒細(xì)胞核形態(tài)多樣，呈分葉狀、圓形或不規(guī)則

表1 胃癌組織中CXCR1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

本組141例胃癌組織中，CXCR1在正常胃黏膜組織中不表達(dá)，其表達(dá)于嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和部分胃癌組織及腫瘤相關(guān)間質(zhì)細(xì)胞表面；CXCR1陽性者占51.78%(73/141)，CXCR1陰性患者占48.22%(68/141)；CXCR1表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)，與胃癌分化(P=0.001 1)、腫瘤的浸潤深度(P=0.017 0)、脈管侵犯(P=0.000 1)、神經(jīng)侵犯(P=0.000 1)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.000 1)、TNM分期(P=0.004 1)有關(guān)，均提示CXCR1在胃癌的浸潤和轉(zhuǎn)移中起一定作用，與在其他腫瘤[11-14]中的表達(dá)和作用的研究結(jié)果一致。

本組實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，CXCR1在胃癌脈管內(nèi)癌栓或胃癌組織中表達(dá)，常伴中性粒細(xì)胞簇的存在，且中性粒細(xì)胞的形態(tài)有差異。有研究報(bào)道[18]，中性粒細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中可被誘導(dǎo)分化為N1和N2兩種亞型，其中N1型核在形態(tài)上呈分葉核，細(xì)胞毒性作用強(qiáng)，表達(dá)和分泌更多的促炎因子，能夠趨化和誘導(dǎo)更多CD8+T細(xì)胞到達(dá)腫瘤部位，而抑制腫瘤的進(jìn)展；而N2型在形態(tài)上細(xì)胞核分葉少，呈圓形或不規(guī)則，細(xì)胞毒性相對(duì)較弱，表達(dá)和分泌促炎因子較少，而VEGF等促進(jìn)血管新生的因子增多，具有明顯的促腫瘤作用。巴賽爾大學(xué)等[19]機(jī)構(gòu)科學(xué)家研究表明腫瘤細(xì)胞會(huì)利用中性粒細(xì)胞來增強(qiáng)癌癥的轉(zhuǎn)移能力。因此，作者推測(cè)腫瘤組織或中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞表面表達(dá)CXCR1，與腫瘤微環(huán)境的主要成分IL-8相互作用，引起主要下游相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。

綜上所述，胃癌組織中CXCR1表達(dá)與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)，對(duì)胃癌組織中CXCR1表達(dá)與炎癥因子的相互作用分析，為開發(fā)抑制胃癌轉(zhuǎn)移的新型藥物提供參考。