王德鑫， 齊 峰， 劉一鳴

叉頭盒O類（Forkhead box protein O，F(xiàn)oxO）轉(zhuǎn)錄因子屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器叉頭家族，該家族具有一個(gè)被稱為“叉頭盒”的DNA結(jié)合域，由FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6共4個(gè)成員組成[1]。FoxO參與多種細(xì)胞過程，如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡和對活性氧的抵抗等[2]。有研究顯示，這些轉(zhuǎn)錄因子作為腫瘤抑制因子發(fā)揮重要作用[3]。且FoxO3和FoxO4在乳腺癌和前列腺癌等多種實(shí)體腫瘤中呈現(xiàn)差異表達(dá)，并與腫瘤的臨床病理特征和患者預(yù)后存在相關(guān)性[4-5]。

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，然而其確切發(fā)病的分子機(jī)制尚不十分清楚[6-7]。且部分患者術(shù)后常常多次復(fù)發(fā)，是導(dǎo)致治療失敗和患者死亡的重要原因。因此，在分子機(jī)制上探討膀胱癌發(fā)生的分子機(jī)制、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和預(yù)后分子標(biāo)志物是目前研究的熱點(diǎn)[8]。本研究采用生物信息學(xué)方法探討FoxO3在膀胱癌中表達(dá)、相關(guān)生物學(xué)功能和信號通路，以及與患者生存期的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 FoxO3基因表達(dá)水平分析 在癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫（TCGA）中分析FoxO3基因mRNA在膀胱癌患者腫瘤組織和對應(yīng)正常膀胱組織中的相對表達(dá)水平，在TCGA數(shù)據(jù)庫中檢索“膀胱癌”和“FoxO3基因”，檢索物種為人類，并分析FoxO3基因mRNA表達(dá)水平是否與患者臨床病理特征及患者預(yù)后存在相關(guān)性。

1.2 FoxO3基因及相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/cgi/input.pl)[9]對FoxO3及相關(guān)基因編碼蛋白進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，物種選擇人，作用蛋白不少于50個(gè)，相互作用關(guān)系置信度大于0.7。

1.3 基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析 采用David數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能富集和和信號通路分析。GO功能富集包括細(xì)胞定位富集、分子功能富集和生物學(xué)過程富集，并采用氣泡圖進(jìn)行表示，反映相關(guān)基因的功能、基因技術(shù)、基因比例及P值。

1.4 生存分析 根據(jù)FoxO3基因基因mRNA表達(dá)中位數(shù)將膀胱癌分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，Cox回歸模型log-rank檢驗(yàn)比較高、低表達(dá)組膀胱癌患者的總生存期（OS）和無疾病進(jìn)展生存期（DFS）有無差異，并計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比（Hazard ratio, HR）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 差異表達(dá)、蛋白網(wǎng)路等采用在線軟件分析，hub基因篩選采用cytocscape進(jìn)行，生存數(shù)據(jù)采用Cox回歸模型的log-rank檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FoxO3基因在膀胱癌組織中的表達(dá) 與對應(yīng)的正常膀胱組織比較，F(xiàn)oxO3基因在膀胱癌組織中的表達(dá)顯著降低（圖1A），而FoxO3表達(dá)水平在不同膀胱癌分期中無明顯差異（圖1B）。

2.2 PPI分析及hub基因篩選 STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建FoxO3蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖2A），F(xiàn)oxO3蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中共有51個(gè)蛋白和587個(gè)相互作用關(guān)，各蛋白平均相互作用指數(shù)為23，網(wǎng)絡(luò)中各個(gè)蛋白富集明顯。Cytoscape篩選蛋白網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因（hub基因），F(xiàn)oxO3、TP53、AKT1、FoxO1、FoxO4、CTNNB1、MAPK3、MAPK1、SIRT1和STAT3為蛋白網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因（圖2B）。10個(gè)關(guān)鍵基因相互作用關(guān)系緊密（圖2C），且呈現(xiàn)明顯的聚類表達(dá)（圖2D）。

2.3 功能富集 FoxO3編碼蛋白主要定位于細(xì)胞核，分子生物學(xué)功能主要為酶和蛋白結(jié)合，生物學(xué)過程主要為信號調(diào)控。而相關(guān)信號通路主要富集于癌癥相關(guān)信號通路如PI3K-Akt 信號通路等，見圖3。

2.4 相關(guān)性分析 FoxO3基因表達(dá)與FoxO3B基因表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.94,P＜0.05），而與TIMM16基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.43,P＜0.05），見圖4。

2.5 生存分析Log-rank檢驗(yàn)顯示FoxO3低表達(dá)組膀胱癌患者的總生存期（HR=1.4,P=0.029）和無疾病進(jìn)展生存期（HR=1.5,P=0.015）顯著高于高表達(dá)組膀胱癌患者，見圖5。

圖1 FoxO3基因在膀胱癌組織中的表達(dá)及其與患者臨床分期的關(guān)系

圖2 FoxO3基因PPI分析及hub基因篩選

圖3 FoxO3基因及網(wǎng)絡(luò)蛋白功能富集和信號通路分析

圖4 與FoxO3基因表達(dá)相關(guān)基因的散點(diǎn)圖

圖5 FoxO3基因表達(dá)水平與膀胱癌患者預(yù)后的生存曲線

3 討論

膀胱癌是發(fā)病率僅次于前列腺癌的第二種泌尿生殖道惡性腫瘤，每年新發(fā)病例超過33萬例，死亡人數(shù)超過3萬例[10]。膀胱癌發(fā)生與吸煙、暴露在芳香胺中以及腫瘤家族史密切相關(guān)[11]。首次診斷為非肌肉浸潤性膀胱癌的患者中，80%的患者預(yù)后較好，但此類患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)仍然很高，且部分患者反復(fù)復(fù)發(fā)后可進(jìn)展為肌肉浸潤性膀胱癌[12]。另外有20%的膀胱癌患者腫瘤侵犯基層和漿膜層，預(yù)后較差，死亡率較高[13]。

雖然其確切機(jī)制尚不清楚，但膀胱癌發(fā)生發(fā)展與染色體異常、表觀遺傳變化以及多基因表達(dá)異常有關(guān)。FoxO3是FoxO轉(zhuǎn)錄因家族重要成員之一，F(xiàn)oxO3受P13KPKB/c-Akt信號通路調(diào)節(jié)，該信號通路磷酸化可導(dǎo)致FoxO失活，從而導(dǎo)致FoxO3表達(dá)水平降低。多篇文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)oxO3在多種腫瘤包括前列腺癌[14]、結(jié)直腸癌、胰腺癌等[15]腫瘤組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，且與患者的預(yù)后存在一定的關(guān)系。還有研究認(rèn)為FoxO3高表達(dá)與肝癌的化療抵抗有關(guān)[16]。因此，F(xiàn)oxO3可能在多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中發(fā)揮重要作用。

FoxO3在膀胱癌中的表達(dá)、生物學(xué)功能、信號通路及其與患者預(yù)后關(guān)系的研究報(bào)道不多。Wang等[17]采用免疫組化方法探討了FoxO3和FoxO4表達(dá)與膀胱癌臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。研究認(rèn)為FoxO3和FoxO4的表達(dá)與膀胱癌患者的臨床病理學(xué)特征和預(yù)后有關(guān)[17]。本研究采用生物信息學(xué)方法檢索TCGA數(shù)據(jù)庫中關(guān)于FoxO3在膀胱癌患者癌組織和正常膀胱組織中的表達(dá)水平并進(jìn)行比較，結(jié)果提示FoxO3在膀胱癌組織中表達(dá)水平明顯下調(diào)，而這種下調(diào)水平在不同分期的膀胱癌組織中是一致的，說明FoxO3下調(diào)是膀胱癌早期事件，且不隨疾病的進(jìn)展而改變。研究還認(rèn)為FoxO3編碼蛋白主要定位于細(xì)胞核，分子生物學(xué)功能主要為酶和蛋白結(jié)合，生物學(xué)過程主要為信號調(diào)控。而相關(guān)信號通路主要富集于癌癥相關(guān)信號通路如PI3K-Akt信號通路等。上述分子功能和信號通路符號膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。提示FoxO3可能成為膀胱癌靶向藥物研發(fā)的潛在靶點(diǎn)。生存分析提示，F(xiàn)oxO3低表達(dá)組膀胱癌患者的總生存期（HR=1.4,P=0.029）和無疾病進(jìn)展生存期（HR=1.5,P=0.015）顯著高于高表達(dá)組，說明FoxO3高表達(dá)是膀胱癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，F(xiàn)oxO3可能成為膀胱癌患者預(yù)后的分子標(biāo)志物。