徐 革， 于 洋， 楊 曼， 于泳浩

膿毒癥是一種嚴重的全身炎癥反應綜合征，主要表現(xiàn)為炎癥分子過度釋放、微靜脈白細胞積聚增多、微血栓形成和微血管收縮，進而導致多器官功能衰竭[1]。許多膿毒癥患者表現(xiàn)出認知障礙，稱為膿毒癥相關腦?。⊿AE）[2]。SAE的病理生理機制非常復雜，已有研究表明其與腦損傷有關，其中血腦屏障損傷是其主要原因之一[2-4]。研究表明，吸入氫氣或攝入富氫水對預防膿毒癥和其所致器官（包括肝、腸、肺和腦）損害有防治作用[5-8]。核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）及其下游信號通路在氫氣治療膿毒癥機制中有重要作用[9-10]。本研究旨在通過野生型及Nrf2基因敲除小鼠膿毒癥模型探討Nrf2在氫氣治療膿毒癥所致SAE中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 兔單克隆抗體VE鈣黏蛋白（1∶1000, Cat#ab205336,），兔多克隆抗體 ZO-1（1∶1000, Cat#ab216880）均購自英國Abcam公司；鼠單克隆抗體β-actin（1∶2000, Cat#A5441），EB（Cat#E2129）均購自美國Sigma公司；山羊抗鼠抗體（1∶5000，Cat#31430），山羊抗兔抗體（1∶5000，Cat#31466），ECL化學發(fā)光液（Cat#34577）均購自美國Invitrogen公司，復方利多卡因乳膏（Cat#H20063466，北京紫光），高純氫氣發(fā)生器（CGH-300，天津同普分析儀器科技有限公司，中國），TF-1氣體流量計（Yutaka Engineering，日本），氫氣濃度檢測器（HY-ALERTA手持探測器500型；H2掃描，Valencia，CA），電泳儀（DYY-6C，中國北京六一公司）；垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽均購自美國Bio-Rad公司；化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（FluorChem FC3，Protein Simple公司，美國）。

1.2 實驗動物 本實驗已獲天津醫(yī)科大學實驗動物管理委員會批準。SPF級健康成年雌性野生型（WT）和Nrf2敲除型（Nrf2-/-）C57BL/6J小鼠各152只（6～8周齡，20～25 g體重）購自南京君科生物工程有限公司，動物合格證號：SYXC（寧）2018-005。所有動物在受控環(huán)境（溫度21～23℃、濕度50%～60%、光暗循環(huán)12∶12小時）中用標準食物和足量水籠養(yǎng)（每籠5只小鼠）。

1.3 模型制備 采用盲腸結(jié)扎穿刺法（CLP）制備小鼠膿毒癥模型：用2%戊巴比妥鈉溶液（50 mg/kg）麻醉動物，俯臥消毒。切開皮膚，通過腹部中線切口（約1cm）顯露盲腸。盲腸在回盲瓣下1/4處用外科縫線結(jié)扎，用20G消毒針穿刺。將小腸內(nèi)容物擠出約0.3 mL，然后將盲腸返回腹腔，縫合腹膜和皮膚。術后采用復方利多卡因乳膏減輕疼痛。術后即刻皮下注射單劑量抗生素（西司他丁，0.5 mg/小鼠）。假手術組除盲腸結(jié)扎、穿刺外，均采用相同的治療方法。

1.4 動物分組及H2治療方法 將WT和Nrf2-/-小鼠各152只按隨機數(shù)字表法分為4×2組（WT小鼠4組，Nrf2-/-小鼠4組）：假手術組、假手術+氫氣組、膿毒癥模型組、氫氣治療組。術后1 h和6 h，H2處理組（假手術+氫氣組和氫氣治療組）的小鼠被放在一個帶有入口和出口的樹脂盒中，給予2%氫氣處理60 min。H2由TF-1氣體流量計進行調(diào)控，以4 L/min的速率與空氣混合。箱子中的H2濃度由氫氣濃度檢測器持續(xù)監(jiān)測，并在整個治療過程中保持在2%的濃度。假手術組和膿毒癥組小鼠僅吸入空氣。

1.5 小鼠存活情況觀察 在假手術或CLP術后24 h，每組隨機挑選20只小鼠觀察并計算各組的7天存活率。

1.6 EB外滲法檢測血腦屏（BBB）通透性 假手術或CLP術后24 h，每組隨機挑選4只小鼠麻醉，經(jīng)尾靜脈注射溶于生理鹽水濃度為2%的EB，劑量為3 mL/kg，擴散2 h，生理鹽水灌注后處死小鼠。取大腦皮質(zhì)，分別稱重，用甲酰胺（1 mL）勻漿，37℃孵育48 h，離心后，用分光光度計檢測上清液在625 nm處的光密度（OD）值。在線性標準曲線的基礎上，定量各樣本的EB值（μg/g濕重）。

1.7 Western blotting法檢測小鼠皮層黏附連接蛋白（VE-cadherin）和緊密連接蛋白（ZO-1）的水平 脫臼處死小鼠，開顱分離切取大腦皮層，勻漿離心后取上清。將等量蛋白（50μg）加入SDS上樣緩沖液中，100 ℃恒溫加熱5 min使其變性。經(jīng)SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后并用以下蛋白質(zhì)的主要抗體檢測：VE-cadherin、ZO-1和β-actin。在4℃漂洗過夜后，加入山羊抗鼠抗體或山羊抗兔抗體，37 ℃孵育1 h。洗滌后滴入ECL化學發(fā)光液，用Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)進行掃描和拍照。靶蛋白的表達水平由靶帶與β-actin帶的灰度值之比來反映。

1.8 Morris水迷宮檢測小鼠認知功能 各組余10只小鼠于術后第4天至第10天行Morris水迷宮實驗評價小鼠認知功能。水迷宮（Haslings公司，美國）為直徑150 cm、高50 cm黑色圓柱形水池，池壁上以4個等距點將水池平均分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ象限，在第Ⅰ象限中央放置一圓形隱藏平臺，直徑10 cm,低于水面1 cm。水池周圍設有參照物且保持不變，在水中加入白色染料拌勻。水溫保持在25 ℃。定位航行實驗：連續(xù)7天，4次/天，每次將小鼠從不同象限面向池壁放入池中，記錄小鼠找到平臺的時間（逃避潛伏期）。當超過90 s小鼠還未尋到平臺，記為90 s并引導小鼠上臺，停留10 s?？臻g探索實驗：定向航行實驗結(jié)束后，立即將平臺撤去，第Ⅰ象限作為入水點，記錄小鼠90 s內(nèi)穿越平臺次數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行分析，計數(shù)資料以例（%）表示，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示。多組比較采用單因素方差分析，組間進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。用時序檢驗（Long-rank Test）比較小鼠7天存活率，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 H2對WT和Nrf2-/-膿毒癥小鼠存活率的影響 與假手術組相比，膿毒癥組WT和Nrf2-/-型小鼠的7天存活率均顯著降低（均P＜0.01）。吸入2%H2后，氫氣治療組的WT小鼠存活率顯著升高（P＜0.01）。在Nrf2-/-小鼠中，氫氣治療組和膿毒癥模型組間的小鼠存活率無顯著差異（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠7天存活率比較

2.2 H2對WT和Nrf2-/-膿毒癥小鼠EB外滲量的影響 與假手術組比，膿毒癥模型組WT和Nrf2-/-型小鼠的EB外滲量均顯著升高（P＜0.01）。吸入2% H2后，氫氣治療組WT小鼠的EB外滲量較膿毒癥模型組顯著降低（P＜0.01）。在Nrf2-/-小鼠中，氫氣治療組和膿毒癥模型組間的小鼠EB外滲量無顯著差異（P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組小鼠EB外滲量的比較

2.3 H2對WT和Nrf2-/-膿毒癥小鼠逃避潛伏期的影響 與假手術組相比，膿毒癥模型組WT和Nrf2-/-型小鼠造模后第6天起逃避潛伏期均顯著延長（P＜0.01）。吸入2%H2后，氫氣治療組WT小鼠逃避潛伏期較膿毒癥模型組顯著降低（P＜0.01）。在Nrf2-/-小鼠中，氫氣治療組和膿毒癥模型組間的小鼠逃避潛伏期無顯著差異（P＞0.05）。見圖3。

圖3 各組小鼠定位航行實驗中逃避潛伏期的比較

2.4 H2對WT和Nrf2-/-膿毒癥小鼠穿越平臺次數(shù)的影響 與假手術組相比，膿毒癥模型組WT和Nrf2-/-型小鼠造模后第10天穿越平臺次數(shù)均顯著減少（P＜0.01）。吸入2% H2后，膿毒癥+氫氣治療組WT小鼠較膿毒癥模型組穿越平臺次數(shù)顯著增多（P＜0.01）。在Nrf2-/-小鼠中，氫氣治療組和膿毒癥模型組小鼠穿越平臺次數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。見圖 4。

圖4 各組小鼠穿越平臺次數(shù)的比較

2.5 各組小鼠大腦皮質(zhì)VE-cadherin和ZO-1表達與假手術組相比，膿毒癥模型組WT和Nrf2-/-型小鼠大腦皮質(zhì)VE-cadherin水平及ZO-1水平均顯著降低（P＜0.05）。吸入2%H2后，氫氣治療組WT小鼠皮質(zhì)VE-cadherin水平及ZO-1水平顯著升高（P＜0.05）。在Nrf2-/-小鼠中，氫氣治療組和模型組間VE-cadherin及ZO-1水平無顯著差異（P＞0.05）。見圖5～7。

圖5 蛋白免疫印跡法檢測各組小鼠皮質(zhì)VE-cadherin和ZO-1表達水平

圖6 各組小鼠大腦皮質(zhì)VE-cadherin/β-actin水平的比較

圖7 各組小鼠大腦皮質(zhì)ZO-1/β-actin水平的比較

3 討論

膿毒癥是一種由多種感染因子引起的嚴重全身炎癥反應綜合征[1]。既往認為膿毒癥可通過損傷血腦屏障進而導致腦損傷，表現(xiàn)為認知障礙和行為缺陷，即SAE[3,11]。課題組既往研究表明，H2能有效預防膿毒癥和SAE，并能減輕膿毒癥引起的認知障礙[8,12]。CLP模型是一種被廣泛認可和應用于膿毒癥研究的動物模型[13]。本項研究結(jié)果顯示H2對嚴重膿毒癥引起的BBB損傷及SAE有保護作用，且Nrf2在其中發(fā)揮重要作用。

研究表明BBB損傷是SAE的主要原因之一[4]。BBB破壞可導致血管源性/細胞衍生的腦水腫、組織代謝失衡、興奮性毒性、周圍巨噬細胞和淋巴細胞浸潤、促進炎癥反應和抑制神經(jīng)修復，從而影響相應腦的功能，導致長期認知功能障礙[11,14]。本研究檢測EB外滲量以反映BBB的損傷程度。血管外EB外滲量與BBB損傷呈正相關，在WT和Nrf2-/-小鼠中模型組均高于假手術組。H2治療可降低膿毒癥所致WT小鼠腦組織EB外滲量，但不能降低Nrf2-/-小鼠腦組織EB外滲量。在認知評估方面，吸入氫氣降低了WT膿毒癥小鼠的逃避潛伏期，增加了平臺穿越次數(shù)，但H2沒有相應降低Nrf2-/-膿毒癥小鼠的逃避潛伏期，增加平臺穿越次數(shù)。結(jié)果表明，在WT小鼠中，H2可提高膿毒癥小鼠存活率，并通過保護BBB減輕SAE，而對Nrf2-/-小鼠則無此作用。

本實驗進一步研究了H2對BBB的保護作用機制。BBB的通透性與血管內(nèi)皮細胞間緊密連接蛋白變化有關[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膿毒癥WT和Nrf2-/-小鼠皮層中黏附相關蛋白VE-cadherin和緊密連接蛋白ZO-1表達降低。在WT小鼠中，氫氣治療組小鼠皮質(zhì)中的VE-cadherin和ZO-1水平均高于模型組，但在Nrf2-/-小鼠中則未出現(xiàn)類似結(jié)果。這些數(shù)據(jù)表明膿毒癥可以損傷緊密連接蛋白和黏附相關蛋白，使BBB的通透性增加，導致BBB的破壞，從而引起認知損傷，而H2可以逆轉(zhuǎn)WT小鼠的BBB破壞。

上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)H2對Nrf2缺陷的膿毒癥小鼠無明顯保護作用。Nrf2是一種亮氨酸拉鏈（BZIP）轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào)節(jié)抗氧化蛋白的水平并保護細胞免受氧化損傷，被廣泛認為是多器官保護劑[15]。在氧化應激或其他刺激下，Nrf2可以被激活并從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核，并結(jié)合到ES基因來控制抗氧化劑的表達和激活，包括SOD和CAT，以及II期基因，包括血紅素加氧酶-1（HO-1）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）和NAD（P）H奎寧氧化還原酶[6,8]。結(jié)果表明，H2對Nrf2缺陷型膿毒癥小鼠無明顯的腦保護作用。證明Nrf2通路參與并調(diào)節(jié)了H2對膿毒癥和SAE的保護作用。