楊 波， 劉小方

膽管癌是一種病死率極高的高度侵襲性膽道惡性腫瘤，它起源于膽管上皮細(xì)胞，起病隱匿，進(jìn)展迅速，早期診斷困難，對常規(guī)放射治療和化療不敏感，手術(shù)切除率低，術(shù)后復(fù)發(fā)率高[1-3]。臨床上大多數(shù)膽管癌患者在確診時已屬于晚期，這與其早期即發(fā)生腫瘤浸潤遷移以及高度侵襲性有關(guān)[4]。因此，研究其致病機(jī)制，尋找新的診斷及治療方法尤為重要。

MicroRNA(微小RNA，miRNA)是一種約包含21～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，作為基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，在各種生物過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括代謝、細(xì)胞增殖、凋亡、分化、轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞信號傳導(dǎo)[5-6]。miR-133作為其中一個亞型，廣泛參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[7]。近年來多項(xiàng)研究結(jié)果表明多種miRNA在膽管癌中異常表達(dá)，在癌細(xì)胞的遷移侵襲中發(fā)揮重要作用[8-9]。

本研究旨在通過研究MicroRNA-133在膽管癌QBC939細(xì)胞系中的表達(dá)，進(jìn)一步探討MicroRNA-133對膽管癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 高糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Corning公司，Trizol試劑盒購自上海普飛生物科技有限公司，M-MLV試劑盒購自美國Promega公司，實(shí)時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，MicroRNA PCR引物購自武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司，miR-133抑制物（AntimiR-133a-5p）、無關(guān)miRNA寡核苷酸均購于廣州銳博生物科技有限公司，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國賽默飛世爾公司，Transwell小室購于美國Costar公司，基質(zhì)膠Matrigel購于美國BD公司。

1.2 細(xì)胞及其培養(yǎng) 膽管癌細(xì)胞株QBC939購自上海吉凱基因公司，用高糖DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、2 mmol/LL-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素)，在37 ℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。選擇收集對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞樣本RT-PCR分析 細(xì)胞樣本用Trizol試劑盒提取細(xì)胞中總RNA，使用M-MLV試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄得cDNA，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR儀檢測miR-133表達(dá)量。根據(jù)Hsa-miR-133基因信息，運(yùn)用Primer 5.0分別設(shè)計引物，以U6作內(nèi)參基因（序列見表1）。每個樣本重復(fù)檢測3次。目的基因的相對表達(dá)量采用2－ΔΔCt值表示。根據(jù)RT-PCR結(jié)果，選擇miR-133b、miR-133a-3p、miR-133a-5p不同成熟體中表達(dá)最高的成熟體進(jìn)行后期的干擾實(shí)驗(yàn)。

表1 實(shí)時熒光定量PCR引物序列

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞分為3組，分別是（1）干擾組：Anti-miR-133a-5p轉(zhuǎn)染組；（2）陰性對照組：轉(zhuǎn)染無關(guān)序列組；（3）空白對照組：自然生長組。干擾組及陰性對照組分別給予Anti-miR-133a-5p和無關(guān)miRNA寡核苷酸，運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑Lipofection 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法參照說明書。轉(zhuǎn)染后48～72 h收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 熒光定量RT-PCR檢測 轉(zhuǎn)染后收集各組細(xì)胞進(jìn)行檢測，檢測基因包括miR-133a-5p、酪氨酸激酶（c-met）。收集各組細(xì)胞使用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，使用M-MLV試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄得cDNA，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR儀檢測miR-133a-5p、c-met基因在各組中的表達(dá)量。所用miR-133a-5p RT引物、U6 RT引物同前，U6用作內(nèi)參決定相關(guān)miRNA的表達(dá)水平。目的c-met基因,上游引物序列為：5’-CAGCTCATAGGTAG AGCAAAGAAAGGGTGGGAT-3’,下游引物序列為：5’-AGCTATTACAATCCAAATATTGCCGTTTC ATAAAT-3’，內(nèi)參GAPDH基因，上游引物序列為5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物序列為：5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’,目的基因的相對表達(dá)量采用2－ΔΔCt值表示。

1.6 Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移與侵襲 在遷移實(shí)驗(yàn)測定中，取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，胰酶消化，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并接種于Transwell小室（美國Costar公司）的上室中，下室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液500 μL，溫育24 h后收集小室，用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，4%多聚甲醛固定30 min，然后用0.1%結(jié)晶紫染色30 min。使用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞，各組隨機(jī)選取5個視野于顯微鏡下拍照并計數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

在侵襲實(shí)驗(yàn)測定中，用基質(zhì)膠Matrigel（美國BD公司）與無血清培養(yǎng)基以1：5稀釋包被Transwell小室底部膜的上室面。取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，胰酶消化，將5×104個細(xì)胞重懸于無血清培養(yǎng)基并置于上室中，下室中加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)液600 μL，溫育48 h后收集小室，用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，4%多聚甲醛固定30 min，然后用0.1%結(jié)晶紫染色30 min。使用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞。各組隨機(jī)選取5個視野于顯微鏡下拍照并計數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用GraphPad Prism6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。多組之間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果

2.1.1 miR-133不同成熟體的表達(dá) RT-PCR檢測 miR-133b、miR-133a-3p、miR-133a-5p 在QBC939細(xì)胞中的表達(dá)量分別為0.74±0.07、0.99±0.12、1.00±0.06， 與 miR-133b，miR-133a-3p相比，miR-133a-5p的表達(dá)量最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1），所以選擇miR-133a-5p進(jìn)行后期的干擾實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同成熟體miR-133b、miR-133a-3p、miR-133a-5p在膽管癌QBC939細(xì)胞中的表達(dá)(aP＜0.05)

2.1.2 抑制miR-133a-5p表達(dá)后對膽管癌QBC939細(xì)胞中miR-133a-5p、c-met表達(dá)的影響 miR-133a-5p在干擾組膽管癌QBC939中的相對表達(dá)量為0.70±0.08，顯著低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。腫瘤相關(guān)基因c-met在干擾組膽管癌QBC939細(xì)胞中的相對表達(dá)量為0.09±0.02，顯著低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖 2。

圖2 miR-133a-5P、c-met分別在干擾組、陰性對照組、空白對照組中的表達(dá)情況（aP＜0.05，aaP＜0.01）

2.2 Transwell小室法遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 遷移實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果 干擾組、陰性對照組和空白對照組穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)分別為（69.5±8.3）、（110.0±5.3）和（109.3±11.2）個，與陰性對照組和空白對照組相比，干擾組穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，圖 3)。

圖3 Transwell小室檢測miR-133a-5p對膽管癌QBC939細(xì)胞遷移能力的影響(aaP＜0.01)

2.2.2 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果 同一批處理的細(xì)胞在鋪Matrigel侵襲小室實(shí)驗(yàn)中呈現(xiàn)了相同的趨勢，干擾組、陰性對照組和空白對照組穿過鋪有Matrigel小室膜的細(xì)胞數(shù)分別為（19.3±3.3）、（65.3±2.6）和（83.0±5.3）個，與陰性對照組和空白對照組相比，干擾組的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見圖4。

圖4 Transwell小室檢測miR-133a-5p對膽管癌QBC939細(xì)胞侵襲能力的影響(P＜0.01)

3 討論

MicroRNAs是一類廣泛存在于真核生物中的高度保守的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平起作用并調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過程，并且miRNA的上調(diào)或下調(diào)可影響各種蛋白質(zhì)的表達(dá)，通過促進(jìn)增殖和侵襲參與腫瘤發(fā)生[10]。研究表明，一些miRNA積極參與與致癌作用相關(guān)的重要過程，并在許多人類癌癥中異常表達(dá)并作為致癌基因發(fā)揮作用[11-12]。而且中醫(yī)藥也可參與調(diào)控miRNA在腫瘤中的作用，有報道m(xù)iR-7介導(dǎo)養(yǎng)正散結(jié)湯含藥血清靶向于EGFR調(diào)控胃癌MKN-45細(xì)胞的增殖和凋亡[13]。姜黃素可通過調(diào)節(jié)miR-133a-3p靶向負(fù)性調(diào)控MMP15的表達(dá)而抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲并且誘導(dǎo)凋亡[14]。ciRS-7競爭性結(jié)合miR-7上調(diào)FAK的表達(dá)從而促進(jìn)宮頸癌的増殖、侵襲及遷移，而中藥單體紫草素可通過抑制FAK通路抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[15]。中西醫(yī)聯(lián)合治療晚期非小細(xì)胞肺癌的差異miRNA表達(dá)譜中，包括miR-21-5p、miR-182-5p、miR-382-5p在內(nèi)的差異miRNAs有望成為中西醫(yī)聯(lián)合治療晚期非小細(xì)胞肺癌療效監(jiān)測和預(yù)測分子標(biāo)記物[16]。華蟾素可能通過Fas、caspase-3 mRNA的表達(dá)上調(diào)促進(jìn)膽管癌細(xì)胞QBC939凋亡[17]。隨著miRNA在中醫(yī)藥防治癌癥研究中的應(yīng)用不斷擴(kuò)大，miRNA調(diào)控機(jī)制為中醫(yī)藥治療癌癥的分子機(jī)制研究提供了一個新的視角,也為臨床中西醫(yī)結(jié)合研究及治療癌癥提供可行的思路和理論依據(jù)。因此，MicroRNAs可能成為腫瘤診斷和預(yù)后評估的生物標(biāo)記物。

膽管癌是一種高度惡性的腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)不斷增加[18]。由于其發(fā)病隱匿，早期發(fā)生的區(qū)域淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是其預(yù)后不良的主要原因之一[19]。為了確定新的治療策略，有必要了解膽管癌發(fā)展的機(jī)制。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些miRNA的異常表達(dá)與膽管癌的發(fā)展相關(guān)，如miR-21[20]、miR-122[21]、miR-144[22]等。此外本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR-224在體外有對膽管癌細(xì)胞抗凋亡及促進(jìn)增殖的作用[23]。而microRNA-133與多種疾病的發(fā)生發(fā)展和腫瘤的遷移侵襲有關(guān)，在原發(fā)性肝癌[24]中，miR-133a的過表達(dá)可通過TGF-β/ Smad3信號通路抑制肝癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲。在膽囊癌[25]中，miR-133a-3p直接負(fù)調(diào)控重組信號結(jié)合蛋白Jκ（RBPJ）的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖以及遷移和侵襲能力。在胰腺癌[26]中，miR-133a通過負(fù)調(diào)節(jié)泛素特異性蛋白酶39（USP39）的表達(dá)發(fā)揮抑癌作用。在胃癌[7]中，miR-133a通過下調(diào)ERBB2及其下游信號分子p-ERK1/2和p-AKT的表達(dá)來抑制胃癌細(xì)胞的增殖。

膽管癌的轉(zhuǎn)移性是影響其治療和預(yù)后的一大主要原因，而細(xì)胞的遷移和侵襲是判斷其轉(zhuǎn)移能力的一個關(guān)鍵表型[27]。有研究表明，腫瘤的遷移侵襲過程涉及多種miRNA的表達(dá)異常[28]。本研究將實(shí)驗(yàn)對象選擇為miRNA-133（序列為：上游：5’-UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG-3’， 下游 5’-UAAACCAAGGUAAAAUGGUCGA-3’），利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)測定分析miR-133及其不同成熟體在膽管癌QBC939細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中miR-133a-5p的表達(dá)量最高。使用特異抑制劑（Anti-miR-133a-5p）轉(zhuǎn)染膽管癌QBC939細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)膽管癌QBC939細(xì)胞中內(nèi)源性miR-133a-5p表達(dá)量明顯降低，說明在膽管癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染特異性抑制劑后可以抑制內(nèi)源性的miR-133a-5p的表達(dá)。隨后檢測miR-133a-5P對膽管癌細(xì)胞遷移侵襲的影響，發(fā)現(xiàn)miR-133a-5p表達(dá)量明顯降低后，膽管癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力均受到明顯抑制，說明抑制miR-133a-5p的表達(dá)能明顯抑制膽管癌細(xì)胞的遷移和侵襲，因此miR-133a-5p的低表達(dá)可以明顯改善膽管癌的惡性表型。從而說明miR-133a-5p在膽管癌遷移侵襲過程中發(fā)揮著類似癌基因的重要調(diào)控作用。但其具體參與和誘導(dǎo)遷移侵襲進(jìn)程的分子作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)論證和深入研究。

c-met是肝細(xì)胞生長因子（HGF）的受體，前期研究發(fā)現(xiàn)其在膽管癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮很重要的作用，與HGF結(jié)合后，c-met催化結(jié)構(gòu)域中的Tyr-1234和Tyr-1235殘基被磷酸化并且受體被激活[29]。一旦被激活，c-met激活多個下游信號傳導(dǎo)途徑（例如PI3K/Akt和MEK/ERK途徑），通過這些下游途徑，HGF/c-met控制許多重要的細(xì)胞反應(yīng)，包括腫瘤細(xì)胞增殖、分化和遷移[30]。在膽管癌細(xì)胞中，c-met信號傳導(dǎo)在啟動侵襲和觸發(fā)轉(zhuǎn)移中起重要作用[29]。研究表明miRNA作為一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，可對腫瘤相關(guān)基因c-met進(jìn)行調(diào)控，從而影響腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[31]。本實(shí)驗(yàn)中利用RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)抑制膽管癌QBC939細(xì)胞系中miR-133a-5P后，腫瘤相關(guān)基因c-met表達(dá)也明顯降低，說明在膽管癌QBC939細(xì)胞系中miR-133a-5P對于c-met表達(dá)可能有調(diào)控作用，目前尚不能確定c-met是miR-133a-5P的直接作用靶點(diǎn)，因此miR-133a-5P如何影響c-met表達(dá)的具體調(diào)控機(jī)制，在未來的研究中需要進(jìn)一步深入探討。

綜上，miR-133a-5p在膽管癌中的表達(dá)上調(diào)，而抑制miR-133a-5p的功能可以抑制膽管癌的遷移侵襲能力，并減弱癌基因c-met的表達(dá)，提示miR-133a-5p有可能成為膽管癌診斷的一個新的分子標(biāo)記物，有希望成為臨床基因靶向治療的新作用靶點(diǎn)以及膽管癌預(yù)后評估的一項(xiàng)新指標(biāo)。