唐麗明， 李婉華， 宋 寧， 張桂賢， 劉大衛(wèi)

慢性膽汁淤積是由多種肝臟疾病引起膽汁流形成、分泌和排泄障礙的一種病理狀態(tài)。長期慢性膽汁淤積可導(dǎo)致肝內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)、膽管細胞和肝細胞漸進性破壞，并誘發(fā)膽管反應(yīng)，激活肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)并使之過度增生，分泌過量膠原，并逐步進展為肝纖維化、膽汁性肝硬化和終末期肝病[1-3]。綠原酸(chlorogenic acid)是茵陳的主要有效成分之一，屬于苯丙素類化合物，具有廣泛的藥理作用，特別是具有確切的保肝利膽作用[4]。文獻報道，綠原酸對多種動物肝損傷模型均有顯著保護作用，例如具有減輕肝損傷和消除黃疸作用[5-6]。

本實驗通過α-異硫氰酸萘酯（ANIT）多次灌胃給藥制備慢性膽汁淤積大鼠肝纖維化模型，應(yīng)用高、低劑量綠原酸進行預(yù)防給藥，旨在觀察綠原酸對慢性膽汁淤積模型大鼠膽汁淤積、膽管增生及膠原增生等病理改變的影響，探索其具體防治機制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康成年SPF級Wistar大鼠40只, 雄性，體質(zhì)量（220±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號11400700330105。

1.2 主要試劑與儀器 α-ANIT購于美國Alfa Aesar公司；熊去氧膽酸（UDCA）購于德國Dr.Falk公司；綠原酸購于美國Sigma公司；天狼星紅-苦味酸染液購于北京索萊寶公司；α-SMA抗體購于美國Abcam公司。EG1150H型包埋機、RM2235/2245切片機、ASP300脫水機、DM400B正置顯微鏡及DM750P型偏振光顯微鏡均為德國Leica公司產(chǎn)品，TBA2000-FR全自動生化分析儀為日本東芝公司產(chǎn)品。

1.3 動物分組、造模及給藥方法 將40只大鼠隨機分為5組：對照組、模型組、UDCA組、綠原酸低劑量組和綠原酸高劑量組，每組8只。除對照組外，其余各組以ANIT（80 mg/kg）灌胃5周，每周3次，制備慢性膽汁淤積模型，同時UDCA組、綠原酸低劑量組和綠原酸高劑量組，分別給予UDCA（90 mg/Kg）、綠原酸（50 mg/Kg和100 mg/Kg）灌胃，每日1次，連續(xù)5周。ANIT以食用植物油溶解，均為每日給藥前配置。

1.4 標(biāo)本采集及處理 5周實驗結(jié)束后，將大鼠用3%戊巴比妥麻醉后開腹，經(jīng)腹主動脈取血，制備血清。取部分肝組織用中性甲醛固定，另取部分肝組織液氮凍存。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 大鼠血清肝功能檢測 采用全自動生化分析儀檢測大鼠血清中TBIL、DBIL、IBIL、ALP水平。

1.5.2 大鼠肝組織HE染色 將經(jīng)10%中性福爾馬林固定的肝組織，常規(guī)石蠟包埋, 4 μm厚連續(xù)切片, HE染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察、攝片。

1.5.3 大鼠肝組織天狼星紅-苦味酸染色及膠原表達定量分析 病理切片經(jīng)脫蠟處理，以0.1%（W/V）天狼星紅-飽和苦味酸溶液在室溫下染色1h，蒸餾水沖洗、Mayer蘇木精復(fù)染和1%鹽酸分化，蒸餾水堿化后脫水、封片。將染色后切片在偏振光顯微鏡下觀察、攝片。在偏振光照射下，I型膠原蛋白顯示為黃紅色，Ⅲ型膠原顯示為綠色。采用Image-Pro Plus 6圖像分析軟件計算膠原熒光平均積分光密度（integrated optical density, IOD）值。

1.5.4 Western blot 檢測肝組織α-SMA表達 定量稱取肝組織加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，冰浴下組織勻漿，15000 r/min，4℃離心10 min，取上清液，BCA法進行蛋白定量，SDA-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉，分別孵育一抗抗體α- SMA（1:1000）及 α-tubulin（1:5000）4℃過夜，洗膜，室溫下分別孵育羊抗兔二抗（1:8000）、羊抗鼠二抗（1:1000）1 h，洗膜，加入ECL發(fā)光液于化學(xué)發(fā)光分析儀中曝光。以α-tubulin為標(biāo)準(zhǔn)化參考物，采用Image J軟件測量各條帶灰度值，定量分析α-SMA蛋白譜帶的相對強度。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清肝功能指標(biāo)結(jié)果 與對照組比，模型組大鼠血清中TBIL、DBIL、IBIL、ALP水平均顯著升高（均P＜0.01），顯示慢性膽汁淤積造成肝功能損傷；與模型組比，綠原酸高、低劑量組以及UDCA組血清TBIL、DBIL、IBIL水平顯著降低（P＜0.05），ALP有下降趨勢，但差異無顯著性（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠血清肝功能指數(shù)比較

2.2 各組大鼠肝組織病理組織學(xué)觀察 光鏡下觀察顯示，對照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞索排列整齊，呈放射狀，無炎性細胞浸潤，肝細胞無變形和壞死，匯管區(qū)正常，無膽管及纖維增生；模型組顯示肝細胞索排列紊亂、模糊，匯管區(qū)慢性炎性細胞浸潤明顯，匯管區(qū)膽管增生、擴張顯著；綠原酸高、低劑量組及UDCA組肝慢性炎性反應(yīng)及匯管區(qū)膽管增生反應(yīng)顯著減輕，見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織病理組織學(xué)結(jié)果（HE，×100）

2.3 大鼠肝組織天狼星紅-苦味酸染色及膠原定量結(jié)果 天狼星紅-苦味酸染色顯示，正常組大鼠肝組織膠原表達稀少，而模型組匯管區(qū)膠原表達顯著增強，偏振光下以亮紅黃色的粗纖維狀I(lǐng)型膠原為主；與模型組比，綠原酸高、低劑量組以及UDCA組肝組織膠原染色顯著均減輕，偏振光下以呈綠色的細纖維狀I(lǐng)II型膠原為主。膠原熒光定量結(jié)果顯示，模型組IOD值（3452. 8±437.2）顯著高于對照組（21.3±5.8）（P＜0.001）；與模型組比，綠原酸高劑量組（467.2±95.4）、低劑量組（401.7±55.6）以 及UDCA組（1145.6±137.5）IOD值顯著降低（均P＜0.01），見圖2、圖3。

圖2 大鼠肝組織膠原表達結(jié)果

圖3 各組大鼠肝組織天狼星紅-苦味酸染色偏振光下熒光IOD值

2.4 各組大鼠肝組織α-SMA表達結(jié)果 Western blot法檢測結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織中α-SMA表達水平（1.07±0.06 ）較對照組（0.46±0.03）顯著升高（P＜0.01），與模型組比，綠原酸高劑量組（0.68±0.11）、低劑量組（0.76±0.10）以及UDCA組（0.65±0.08）肝組織α-SMA表達顯著降低（均P＜0.05），見圖4、圖5。

圖4 大鼠肝組織中α-SMA的Western blot表達

圖5 各組大鼠肝組織中α-SMA蛋白表達相對強度比較

3 討論

慢性膽汁淤積病因多樣，發(fā)病機制復(fù)雜，但無論何種病因，膽汁淤積如得不到有效治療，幾乎都將序貫性地引起肝纖維化，最終導(dǎo)致不可逆性肝硬化[7]。

目前認為慢性膽汁淤積導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生機制為：長期膽汁淤積損傷膽管細胞，引起匯管區(qū)慢性炎性反應(yīng)，大量炎癥細胞浸潤，釋放大量生長因子、細胞因子、化學(xué)因子等，促進肝星狀細胞大量增殖、活化，后者繼而轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞(myofibroblast, MFB)，分泌大量膠原及其他細胞外基質(zhì)（ECM）成分并集中沉積于匯管區(qū)膽管周圍[3,8-9]。 隨著疾病進展，膽汁淤積也會造成進行性肝細胞損傷，進一步加重炎性浸潤和擴大纖維化范圍。在這一病理進展過程中，膽汁淤積誘發(fā)膽管反應(yīng)及匯管區(qū)周圍膽管增生是一個非常有特點的重要病理環(huán)節(jié)。本研究采用ANIT多次灌胃給藥制備慢性膽汁淤積大鼠模型，HE病理染色觀察發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肝組織匯管區(qū)慢性炎性細胞浸潤明顯，小膽管大量增生、擴張，增殖的膽管周圍大量膠原蛋白沉積,與文獻報道結(jié)果類似。文獻報導(dǎo)認為ANIT主要通過靶向損傷小膽管上皮細胞，破壞其排泄功能，導(dǎo)致肝內(nèi)膽汁淤積，并引起膽小管增生及小葉間膽管周圍炎癥，造成肝內(nèi)膽管阻塞，從而形成明顯的膽汁淤積，因而能較好模擬臨床慢性肝內(nèi)膽汁淤積的病理變化[10-12]。

本研究進一步采用天狼星紅-苦味酸染色法重點對肝組織匯管區(qū)增生、沉積的膠原蛋白及其類型進行了觀察和分析。目前認為肝纖維化時有5種主要膠原蛋白參與, 其中以Ⅰ、Ⅲ型為主, 肝纖維化早期以Ⅲ型為主, 后期以I型為主，并且在肝纖維化過程中I、Ⅲ型膠原是假小葉纖維間隔的重要來源,即I、Ⅲ型膠原是肝纖維化、肝硬化時肝ECM的主要成分[13]。天狼星紅-苦味酸染色在偏振光照射下，I型膠原蛋白呈紅、黃色的粗纖維狀，而Ⅲ型膠原則呈現(xiàn)為綠色的細纖維狀[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肝組織匯管區(qū)膠原熒光表達顯著增強，偏振光下以亮紅、黃色的I型膠原為主，綠色的Ⅲ型膠原表達非常微弱，顯示已發(fā)生肝纖維化。

針對慢性膽汁淤積激活的肝星狀細胞[15]，本研究應(yīng)用其特征標(biāo)志分子α-SMA，采用Western blot法進行檢測，結(jié)果顯示，與對照組比，模型組大鼠肝組織中α-SMA表達水平顯著增強，提示肝星狀細胞顯著激活，與膠原表達的增強相一致。

綠原酸即1，3，4，5-四羥基環(huán)己烷羧酸-(3，4-二羥基肉桂酸酯)，多項研究顯示其具有顯著的抗炎、保肝、利膽、抗氧化等作用。文獻報道，綠原酸對四氯化碳(CCI4)肝損傷、阻塞性黃疸以及脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷均有較好的保護作用[6]。本實驗應(yīng)用高、低劑量綠原酸對ANIT所致慢性膽汁淤積大鼠肝纖維化模型進行預(yù)防給藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高、低兩個劑量的綠原酸均可顯著改善肝功能，表現(xiàn)為血清TBIL、DBIL、IBIL水平顯著降低，另外，ALP也有下降趨勢，但差異未達顯著性，考慮原因有可能與本次每組動物樣本量（8只）稍小有關(guān)。高、低劑量綠原酸還顯著減輕了肝組織的慢性炎性反應(yīng)及匯管區(qū)膽管增生反應(yīng)，肝組織膠原染色均顯著減輕，偏振光下以呈綠色的III型膠原為主，顯示肝纖維化程度及進程被顯著抑制；綠原酸高、低劑量組大鼠肝組織α-SMA表達也顯著降低，提示綠原酸可顯著抑制肝星狀細胞的活化。在研究中也發(fā)現(xiàn)，綠原酸高、低兩個劑量間的差異，高劑量呈更好的療效趨勢，但兩個劑量組相比，差異未達到顯著性，分析原因，一是可能是藥效實驗中的天花板效應(yīng)（ceiling effect）（即指當(dāng)增加藥物劑量時相對應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)如藥效、毒性等不會隨著劑量的增加而增加），二是可能由于劑量還有提高的空間，三是可能與動物樣本量略?。拷M8只）有關(guān)，這個不足將在接下來的研究工作中加以完善。

綜上所述，綠原酸可顯著改善ANIT誘導(dǎo)的慢性膽汁淤積大鼠模型的肝功能損傷、有效抑制肝星狀細胞活化、減少以I型膠原為主的膠原產(chǎn)生、減輕慢性膽汁淤積所致的匯管區(qū)小膽管增生，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用。本研究同時為慢性膽汁淤積致肝纖維化的機制研究以及探索利膽中藥單體化合物的分子機制提供了實驗依據(jù)。