劉彧成，梁健,2，王培，鄭妮，洪敏 ,郭永軍,2，李永仁,2

（1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2.天津市海洋牧場(chǎng)技術(shù)工程中心，天津 300457）

外套膜分布在兩片貝殼內(nèi)面，是包裹內(nèi)臟團(tuán)的薄膜，其背面與內(nèi)臟團(tuán)的上皮組織粘連在一起。外套膜分泌形成貝殼的分泌機(jī)理一直是研究熱點(diǎn)。特別是其外側(cè)緊貼貝殼的珍珠層，可形成珍珠，長(zhǎng)期以來(lái)備受青睞。縊蟶Sinonovacula constricta 屬于雙殼貝類(lèi)，俗稱(chēng)“蟶子”、“青子”，殼較其他貝類(lèi)脆，生長(zhǎng)較快，是一種重要的養(yǎng)殖貝類(lèi)[1,2]。關(guān)于櫛孔扇貝Chlamys farrei[3,4]、三角帆蚌Hyriopsis cumingii[5]、池蝶蚌Hyriopsis schlegelii[6]、紫彩血蛤Nuttallia olivacea[7]、文蛤Meretrix meretri[8]等貝類(lèi)的外套膜已有研究，但縊蟶外套膜的組織學(xué)和組織化學(xué)研究較少。

本研究采用HE 染色等組織學(xué)方法研究縊蟶外套膜的組織結(jié)構(gòu)，采用Gomori 鈣-鈷法染色、汞溴酚藍(lán)染色和阿利新藍(lán)-PAS 染色方法分析其內(nèi)在化學(xué)構(gòu)成，旨在從組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)主要成分上找到縊蟶與其他貝類(lèi)的不同點(diǎn)，為解決縊蟶貝殼易破損、運(yùn)輸中大量死亡等問(wèn)題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用縊蟶取自于天津市王頂?shù)趟a(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)，平均殼長(zhǎng)為（53.24±2.23）mm，暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室水箱中，選擇個(gè)體完整、規(guī)格相近、活力良好的縊蟶作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.2 方法

將縊蟶放在解剖盤(pán)中，測(cè)量和記錄殼長(zhǎng)、殼寬、殼高和體質(zhì)量。用手術(shù)刀沿外套膜與貝殼交匯處插入，輕輕滑動(dòng)解剖刀使外套膜與貝殼分離，用剪刀剪取約1 cm 長(zhǎng)的外套膜，用貝類(lèi)生理鹽水[8]清洗之后，置于固定液中。外套膜組織較薄，為防止固定時(shí)發(fā)生蜷縮，先將組織放在濾紙上緩慢滴加固定液，再將組織連同濾紙一同放入固定液中固定。

1.2.1 組織學(xué)方法

將組織塊在Bouin’s 液中固定12h 后，取出移入70%乙醇中保存?zhèn)溆谩Ｃ撍畡槭宥〈?，各?jí)脫水時(shí)間為1h，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度6μm，H·E染色，常規(guī)方法封片。

1.2.2 組織化學(xué)方法

將組織放于Carnoy 氏液中固定，脫水、包埋及切片同上，用改良Gomorri 鈣鈷法顯示堿性磷酸酶（對(duì)照組切片于90℃的熱水中處理10min 使堿性磷酸酶失活），AB-PAS 染色法顯示糖類(lèi)，汞溴酚藍(lán)染色法顯示蛋白質(zhì)，中性樹(shù)膠封片。采用Motic BA600-4 數(shù)字切片掃描與應(yīng)用系統(tǒng)高精度掃描切片，用Motic 數(shù)字切片助理Lite 1.0 觀察組織，采集圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織學(xué)觀察

組織學(xué)觀察顯示，縊蟶外套膜無(wú)邊緣膜突起，上、下殼外套膜的邊緣膜直接愈合，有明顯的愈合點(diǎn)（圖版1-ⅰA）。邊緣膜（圖版1-ⅰB）較厚，顏色深，中央膜較薄，近似透明。

2.1.1 邊緣膜

如圖版1-ⅱ所示，邊緣膜顏色深，較厚，由結(jié)締組織（C）、肌纖維（D）、外側(cè)上皮（E）和內(nèi)側(cè)上皮（F）組成，還分布有粘液細(xì)胞（向下箭頭）。

2.1.1.1 外側(cè)上皮

靠近縊蟶外殼一側(cè)的上皮層被稱(chēng)為外側(cè)上皮，主要由單層柱狀纖毛上皮細(xì)胞（圖版1-ⅲ，向右箭頭）組成。細(xì)胞核位于底部，呈卵圓形，無(wú)粘液細(xì)胞分布。

2.1.1.2 內(nèi)側(cè)上皮

靠近縊蟶外套腔一側(cè)的上皮層被稱(chēng)為內(nèi)側(cè)上皮，主要由單層柱狀上皮細(xì)胞（圖版1-ⅳ，向左箭頭）組成；內(nèi)側(cè)上皮分布著大量細(xì)胞核明顯的粘液細(xì)胞。

2.1.1.3 結(jié)締組織和肌纖維

上皮層下分布的結(jié)締組織十分豐富，主要為疏松結(jié)締組織，內(nèi)分布有較多肌纖維，肌纖維由內(nèi)環(huán)?。▓D版1-ⅴG）和外縱?。▓D版1-ⅴH）組成，主要維持外套膜的伸縮，與外套膜的運(yùn)動(dòng)相關(guān)。

2.1.2 愈合點(diǎn)

縊蟶上殼和下殼的外套膜已愈合，沒(méi)有其他灘涂雙殼貝類(lèi)所具有的邊緣膜突起，這是縊蟶外套膜的特殊之處（圖版1-ⅵ）。

2.2 組織化學(xué)研究

2.2.1 改良Gomorri 鈣鈷法顯示堿性磷酸酶

縊蟶外套膜邊緣膜的外側(cè)上皮細(xì)胞經(jīng)改良Gomorri 鈣鈷法顯示為陽(yáng)性，細(xì)胞內(nèi)含物有棕褐色沉淀，表明該部位有較強(qiáng)的堿性磷酸酶(ALP)活性（圖版2-?。?，對(duì)照組縊蟶同一部位的上皮細(xì)胞顯示為陰性，細(xì)胞內(nèi)無(wú)棕褐色沉淀（圖版2-ⅱ）。而其他部位，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均顯示為陰性，細(xì)胞內(nèi)無(wú)棕褐色沉淀（圖版2-ⅲ和圖版2-ⅳ）。

2.2.2 AB-PAS 染色顯示糖類(lèi)

縊蟶外套膜的邊緣膜內(nèi)側(cè)和外側(cè)上皮細(xì)胞都被AB-PAS 染成藍(lán)色，說(shuō)明含有酸性黏蛋白；外套膜邊緣內(nèi)側(cè)的上皮細(xì)胞質(zhì)（圖版2-ⅴ，向上箭頭）被染成淺紫紅色，說(shuō)明含有少量糖類(lèi)，分布有中性粘液物質(zhì)；結(jié)締組織和肌纖維PAS 染色呈陽(yáng)性，被染成紅紫色，染色相對(duì)較強(qiáng)，說(shuō)明糖類(lèi)含量較多。

2.2.3 汞溴酚藍(lán)染色顯示蛋白質(zhì)

圖版1 縊蟶外套膜組織學(xué)觀察（橫切，H·E 染色）Plate 1 Histological observation of mantle membrane of razor clam Sinonovacula constricta （Transversal section,H.E.staining）

圖版2 縊蟶外套膜組織化學(xué)觀察Plate Ⅱ Histochemical observation of mantle membrane of razor clam Sinonovacula constricta

汞溴酚藍(lán)染色法顯示，縊蟶外套膜的邊緣膜外側(cè)上皮細(xì)胞染色較深，說(shuō)明蛋白質(zhì)含量較多，內(nèi)側(cè)上皮染色較淺，說(shuō)明蛋白質(zhì)含量較少。而結(jié)締組織染色較淺，說(shuō)明蛋白質(zhì)含量較少，肌纖維染色很深，說(shuō)明蛋白質(zhì)含量很多（圖版2-ⅵ）。

3 討論

3.1 縊蟶外套膜結(jié)構(gòu)的分析

組織學(xué)觀察表明，縊蟶的外套膜主要由邊緣膜和中央膜組成，但組織結(jié)構(gòu)與雙殼貝殼類(lèi)外套膜基本組織結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)有所不同?？O蟶上、下殼外套膜的邊緣膜愈合而無(wú)邊緣突起結(jié)構(gòu)，而文蛤[8]、紫彩血蛤[7]等雙殼貝類(lèi)均有邊緣膜、中央膜和邊緣膜突起結(jié)構(gòu)。

3.2 縊蟶外套膜粘液細(xì)胞的分布

H·E 染色表明，縊蟶外套膜內(nèi)、外側(cè)上皮分別為柱狀纖毛上皮和柱狀上皮，外側(cè)上皮細(xì)胞間分布一定量的粘液細(xì)胞。邊緣膜的外側(cè)為單層柱狀纖毛上皮，外側(cè)上皮染色比內(nèi)側(cè)上皮深，因?yàn)閮?nèi)側(cè)細(xì)胞內(nèi)有大量的粘液細(xì)胞，可以分泌大量粘液物質(zhì)，說(shuō)明位于內(nèi)側(cè)上皮的細(xì)胞有一定的分泌功能。邊緣膜上皮下有大量泡狀疏松結(jié)締組織，其中還分布有大量肌纖維?？O蟶外套膜中含有較多粘液細(xì)胞，但是，外套膜不同部位粘液細(xì)胞的數(shù)量不同，形態(tài)也不盡相同。對(duì)櫛孔扇貝和文蛤的研究發(fā)現(xiàn)，外套膜和鰓絲等部位受水流沖擊影響較大，含有較多的粘液細(xì)胞[10,11]?？O蟶的外套膜中也含有大量粘液細(xì)胞，主要分布在外套膜的內(nèi)側(cè)上皮細(xì)胞間，而且在邊緣膜處較密集。推測(cè)縊蟶的外套膜中粘液細(xì)胞的分布情況與外界接觸情況有關(guān)，即接觸越頻繁粘液細(xì)胞的數(shù)量越多。

3.3 縊蟶外套膜中化學(xué)物質(zhì)的分布

組織化學(xué)方法顯示，在外套膜邊緣膜外側(cè)上皮細(xì)胞中堿性磷酸酶(ALP)活性較強(qiáng)，其余各部位均無(wú)明顯反應(yīng)。背角無(wú)齒蚌Anodonta woodiana elliptica外套膜的表皮細(xì)胞中，堿性磷酸酶反應(yīng)很強(qiáng)，結(jié)締組織中只有游走細(xì)胞為陽(yáng)性，其余細(xì)胞為陰性，肌細(xì)胞活性不明顯[12]。AB-PAS 染色法顯示：縊蟶外套膜的邊緣膜內(nèi)、外側(cè)上皮均具較少糖類(lèi)，結(jié)締組織和肌纖維中含有大量糖類(lèi)。紫彩血蛤外套膜中，外側(cè)上皮含糖量多[6]。汞溴酚藍(lán)染色顯示蛋白質(zhì)法的研究結(jié)果則表明，縊蟶外套膜內(nèi)側(cè)上皮和肌纖維蛋白質(zhì)含量少，外側(cè)上皮和結(jié)締組織蛋白質(zhì)含量多。海灣扇貝Argopecten irradians 外套膜同樣也富含蛋白質(zhì)，但是肌纖維和上皮組織含量多，結(jié)締組織中含量少[13]。

3.4 小結(jié)

縊蟶上、下殼外套膜的邊緣膜愈合，無(wú)邊緣突起結(jié)構(gòu)?？O蟶的外套膜中粘液細(xì)胞的分布與外界接觸有關(guān)，即接觸越頻繁粘液細(xì)胞分布數(shù)量越多。糖類(lèi)大多分布于結(jié)締組織和肌纖維中，上皮層中分布較少；蛋白質(zhì)大多分布于外側(cè)上皮和結(jié)締組織中，內(nèi)側(cè)上皮和肌纖維中分布較少。