高珊，趙雪飛，常玉梅，孫博，梁利群，張立民，董志國

（1.江蘇海洋大學(xué)海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇 連云港 222000；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院特殊生境魚類種質(zhì)特性與抗逆育種重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點實驗室，淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070;3.東北林業(yè)大學(xué)野生動物與自然保護(hù)地學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

與陸生動物相比，魚類為了適應(yīng)水環(huán)境鹽度、堿度、離子組成及pH 的變化，必須擁有高效的離子和滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制[1]。鰓、腎、腸是魚類滲透壓調(diào)節(jié)的重要器官，在維持水鹽平衡中發(fā)揮重要作用。但是，魚類生存環(huán)境不同，參與滲透調(diào)節(jié)的組織器官略有側(cè)重。淡水魚類處在低滲環(huán)境中，不喝水或攝食時少量飲水，鰓和腎組織發(fā)揮主要作用[2]；海水魚類處在高滲環(huán)境中，吞飲海水補(bǔ)償水分的被動損失，鰓和腸組織發(fā)揮主要作用[3,4]。

我國約有0.46 億hm2高碳酸鹽堿度（carbonate alkalinity,CA）、高pH、離子組成復(fù)雜的低洼鹽堿水域，有別于淡水和海水[5]。研究發(fā)現(xiàn)，大部分傳統(tǒng)淡水經(jīng)濟(jì)魚類可在低堿度水體（CA＜10 mmol）中存活，這類水體已基本開發(fā)利用；而中（CA10～30 mmol）、高（CA＞30 mmol）堿度水體堿度和pH 偏高，漁業(yè)利用率極低，尚未得到有效開發(fā)[6]。目前采用高通量測序技術(shù)，篩選了許多耐中、高堿度土著魚類鰓和腎組織基因的表達(dá)差異，如馬加迪羅非魚Oreochromis alacalicus grahami[7]、青海湖裸鯉Gymnocypris przewalskii[8]和瓦氏雅羅魚Leuciscus waleckii[9-11]等，認(rèn)為這兩個組織富集了大量參與離子和滲透壓調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因。但也有認(rèn)為，腸道組織也參與耐鹽堿魚類的滲透調(diào)節(jié)。如Wood 等[12]在青海湖裸鯉前腸收集到了液體，王萍等[13]通過室內(nèi)堿度短期脅迫實驗發(fā)現(xiàn)，湖水組直腸排泄物的HCO3-濃度最高，支持湖裸鯉腸道在其滲透壓調(diào)節(jié)中的重要作用。

瓦氏雅羅魚在我國黑龍江、遼河、黃河流域及內(nèi)陸鹽堿湖泊均有分布，具有極強(qiáng)的耐高堿特性，能耐受內(nèi)蒙古達(dá)里諾爾湖碳酸鹽堿度高達(dá)54 mmol、pH9.6 的極端惡劣環(huán)境[14,15]。解析瓦氏雅羅魚耐高堿的生理和分子機(jī)制，培育耐高堿新品種，對推進(jìn)鹽堿水域的開發(fā)利用具有重要的戰(zhàn)略意義。前期雖通過高通量測序在鰓和腎組織中發(fā)掘了大量參與滲透壓調(diào)節(jié)的候選基因，但是，缺乏這些組織的生理適應(yīng)性變化數(shù)據(jù)，對耐鹽堿候選基因在各組織的分布、定位及定量表達(dá)研究進(jìn)展緩慢；除鰓組織外，腎和腸是否參與滲透壓調(diào)節(jié)尚不清楚。

本研究通過觀察室內(nèi)中、高碳酸鹽堿度脅迫后，達(dá)里諾爾湖瓦氏雅羅魚（堿水種）和松花江瓦氏雅羅魚（淡水種）腎和腸的組織顯微結(jié)構(gòu)，分析腸道內(nèi)容物的pH，旨在探討這兩種組織耐中、高堿度中的作用，為瓦氏雅羅魚耐高堿生理和分子機(jī)制研究及淡水經(jīng)濟(jì)魚類向中、高堿度水體移植馴化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗魚為內(nèi)蒙古達(dá)里諾爾湖瓦氏雅羅魚自交F2和松花江瓦氏雅羅魚自交F2，飼養(yǎng)于黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭實驗站。選擇大小一致，體質(zhì)量為（22.24±4.68）g 的個體45 尾，運回實驗室，在循環(huán)可控水族箱（42.6cm×28.4cm×29.3cm）中暫養(yǎng)7d。實驗用水為過濾、曝氣24 h 的自來水。

1.2 方法

實驗設(shè)置對照組（CA0）、NaHCO3堿度30mmol（CA30）、NaHCO3堿度50mmol（CA50）3 組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)5 尾魚。以5 mmol/d 的速度緩慢提升，堿度至30mmol和50mmol后維持該堿度22d。實驗期間，每天換水1/2，不投喂，采用YSI 多功能水質(zhì)分析儀監(jiān)測水質(zhì)溫度（T）、pH、溶氧度（DO）、鹽度（SAL）、氨氮（NH4+，NH3）含量等指標(biāo)，用酸堿滴定法測定水體堿度。不同堿度脅迫期間，各實驗組水體檢測指標(biāo)見表1。

堿度脅迫實驗結(jié)束時，每組采5 尾魚的干腎和腸組織用于組織切片和測定腸道內(nèi)容物的pH。參考金建麗等[16]的方法，將腸道按回折度分為前腸、中腸和后腸；參考Bergman 等[17]的方法，用鑷子將腸道內(nèi)容物擠出放入事先稱量好的1.5mL 離心管中，加入200μL 滅菌水，漩渦震蕩充分混勻，靜置30min 后，12000r/min 離心5min，取上清測定pH；最后將前、中、后腸組織在Bouin’s 液（苦味酸飽和溶液+福爾馬林25mL+冰醋酸5mL）固定24h 后，轉(zhuǎn)移至70%乙醇于4℃保存?zhèn)溆?。腎的固定方法與腸道相同。

用梅特勒-托利多pH 計（SevenCompact，德國）測定堿水種和淡水種腸前、中、后部內(nèi)容物上清的pH。

組織切片及拍照觀察參考楊建等[18]的方法。采用光學(xué)顯微鏡觀察、拍照（Olympus BX53&DP74）。測微尺測定腎小球直徑、近曲小管管徑、腸道黏膜褶皺高度、環(huán)肌厚度、縱肌厚度等指標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPASS13.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。用Duncan 法進(jìn)行組內(nèi)多重比較分析，用t 檢驗比較分析組間差異。P＜0.05 具有顯著差異，P＜0.01 具有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同NaHCO3 堿度對瓦氏雅羅魚腎顯微結(jié)構(gòu)的影響

組織切片顯示，瓦氏雅羅魚的腎組織由腎小球、第一近曲小管、第二近曲小管集合管和遠(yuǎn)曲小管組成。

正常條件下（CA0），兩種實驗魚腎臟較為飽滿，毛細(xì)血管發(fā)達(dá)，腎小球和腎小管完整；腎小球大多位于腎組織的邊緣。第一近曲小管十分發(fā)達(dá)，管腔不規(guī)則，上皮細(xì)胞呈柱狀；第二近曲小管呈圓形，管壁由單層柱狀上皮細(xì)胞組成；遠(yuǎn)曲小管管腔大小不規(guī)則；集合管形狀不規(guī)則，管徑大于近曲小管（圖1）。

NaHCO3堿度脅迫組魚的腎小球和腎小管隨著堿度升高，均發(fā)生了比較明顯的皺縮（圖1）。由表2可知，與對照組相比，隨著堿度升高，兩種實驗魚的腎小球直徑和第二近曲小管管徑均變小，收縮顯著（P＜0.05）；CA 50 組堿水種的收縮程度更為明顯，各腎單元均出現(xiàn)比較明顯的空白間隙，腎小管管徑變窄或無（圖1）。

2.2 不同NaHCO3 堿度對瓦氏雅羅魚腸內(nèi)容物pH 的影響

由于堿水種淡水對照組數(shù)據(jù)缺失嚴(yán)重，故以淡水種淡水對照組的數(shù)據(jù)作為對照列入表3。由表3可知，對照組和堿度脅迫組瓦氏雅羅魚腸道pH 呈現(xiàn)低-中-低的趨勢，即腸道中部pH 較高。

表1 對照組和實驗組水體檢測指標(biāo)Tab.1 Water indicators in control group and experimental groups

表2 不同NaHCO3 堿度對瓦氏雅羅魚腎顯微結(jié)構(gòu)的影響（n=9）Tab.2 Effect of different NaHCO3 alkalinities on the micro-structure of kidney in Amur ide

圖1 不同堿度對堿水種和淡水種瓦氏雅羅魚腎組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effect of different NaHCO3 alkalinity on the microstructure of kidney in alkaline water species and freshwater species of Amur ide

2.3 不同NaHCO3 堿度對瓦氏雅羅魚腸顯微結(jié)構(gòu)的影響

組織切片顯示，瓦氏雅羅魚腸道由內(nèi)至外分別由黏膜層、黏膜下層、肌肉層和漿膜層組成，肌肉層包括環(huán)肌和縱?。▓D2）。

正常條件下（CA0），兩種實驗魚的腸道黏膜層、黏膜下層、肌肉層、漿膜層完整，紋狀緣發(fā)達(dá)，固有膜與粘膜下層界限不明顯。兩種實驗魚的腸粘膜褶皺均呈縱向“Z”形。從前腸到后腸，黏膜褶皺高度逐漸降低，縱肌變薄，環(huán)肌變厚（表4，圖3）。兩種實驗魚的前腸和中腸均觀察到杯狀細(xì)胞，位于黏膜層，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞松散，分布不均；蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining,HE）染色后，呈透明狀（圖3）。

圖2 瓦氏雅羅魚腸道橫切面和縱切面顯示圖Fig.2 Patterns of transversal and longitudinal sections of intestine in Amur ide

表3 不同NaHCO3 堿度對瓦氏雅羅魚腸道內(nèi)容物pH 的影響（n=5）Tab.3 Effect of different NaHCO3 alkalinities on intestine pH in Amur ide（n=5）

表4 瓦氏雅羅魚腸道基本結(jié)構(gòu)部分測量指標(biāo)Tab.4 Some measured indices of basic structure of intestine in Amur ide

圖3 瓦氏雅羅魚腸道（前、中、后）肌肉層顯微模式圖Fig.3 Microstructure patterns of muscle layer of intestine（foregut,midgut,and hindgut）in Amur ide

圖4 瓦氏雅羅魚堿水種和淡水種前腸顯微模式對比圖Fig.4 Microstructure comparison of foregut between alkali-adapted species and freshwater species of Amur ide

圖5 瓦氏雅羅魚堿水種和淡水種中腸顯微模式對比圖Fig.5 Microstructure comparison of midgut between alkali -adapted species and freshwater species of Amur ide

堿度脅迫下，隨著堿度升高，兩種實驗魚前腸中的杯狀細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，杯狀細(xì)胞大而松散（圖4）；中腸杯狀細(xì)胞小而密集，尤其在CA30 時，兩種實驗魚杯狀細(xì)胞富集更為明顯（圖5）；在堿度脅迫下堿水種后腸有少量杯狀細(xì)胞，而淡水種則未觀察到杯狀細(xì)胞（圖6）。

圖6 瓦氏雅羅魚堿水種和淡水種后腸顯微模式對比圖Fig.6 Microstructure comparison of hindgut between alkali -adapted species and freshwater species of Amur ide

3 討論

3.1 NaHCO3 堿度對瓦氏雅羅魚腎組織微觀結(jié)構(gòu)的影響

腎臟是淡水魚類滲透壓調(diào)節(jié)的重要器官，腎小球可過濾血液里的血細(xì)胞和大分子蛋白質(zhì)，腎小管可重吸收水分、葡萄糖、氨基酸等物質(zhì)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，正常條件下，兩種實驗魚腎臟中腎小球和腎小管完整，腎小球發(fā)達(dá)，腎小管粗壯。隨著堿度的升高，兩種實驗魚的腎小球直徑和第二近曲小管管徑均變小，收縮顯著（P＜0.05）（表2）。尤其在接近達(dá)里諾爾湖堿度的條件下（CA50），堿水種各腎單元收縮更為明顯（圖1），表明堿度脅迫抑制瓦氏雅羅魚的部分腎功能。該研究結(jié)果與耐鹽堿的卡拉白魚Chalcalburnus tarichi、青海湖裸鯉的研究結(jié)果相似。O?uz[20]比較了卡拉白魚淡水群體和鹽堿湖泊群體腎顯微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)鹽堿湖泊群體腎小球結(jié)構(gòu)萎陷，集合小管皺縮，腎單元的過濾速率顯著降低。Na+-K+-ATPase（NKA）標(biāo)記離子細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，卡拉白魚湖水族群和青海湖裸鯉一樣，NKA 活性下降了30%，明顯抑制了腎功能[12]；Galat 等[21]通過比較生活在不同鹽堿湖泊的鉤吻鱒的腎組織顯微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，其腎組織均出現(xiàn)不同程度的退化，腎小球縮小甚至消失；楊建等[18]研究鹽度對5 種淡水魚幼魚的腎組織的影響發(fā)現(xiàn)，幼魚在低鹽脅迫下，腎小球發(fā)達(dá)，腎小管粗壯，而在高鹽脅迫下腎組織退化，腎小管縮短?？梢钥闯?，魚類腎臟的萎縮程度與水體環(huán)境的滲透壓呈正比[22]，鹽堿水和海水均屬于高滲環(huán)境，明顯抑制了魚的腎功能。

3.2 NaHCO3 堿度對瓦氏雅羅魚腸組織微觀結(jié)構(gòu)的影響

腸道能有效吸收液體彌補(bǔ)高滲環(huán)境造成的脫水，也是海水魚類滲透壓調(diào)節(jié)的重要器官[23]。本研究采用NaHCO3對兩種馴養(yǎng)在淡水池塘的瓦氏雅羅魚進(jìn)行堿度脅迫實驗，其水體相對與淡水環(huán)境來講，屬于高滲環(huán)境。前期已有學(xué)者認(rèn)為，生活在高鹽堿湖泊的魚類行為生理與海水魚類相似，可通過吞飲湖水調(diào)節(jié)滲透壓。Wood 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，馬加迪羅非魚以（8.01±1.29）mL/（kg·h）速率吞飲湖水，并通過鰓泌鹽，保持體內(nèi)較低的滲透壓；隨后Wood 等[12]在裸鯉的前腸部分收集到液體，并發(fā)現(xiàn)其腸內(nèi)的Mg2+和Ca2+濃度均高于血漿含量，認(rèn)為裸鯉與海水魚類的腸道離子吸收機(jī)制相似；王萍等[13]的室內(nèi)堿度短期脅迫實驗發(fā)現(xiàn)，湖水組直腸排泄物的HCO3-濃度最高，支持湖裸鯉腸道在其滲透壓調(diào)節(jié)中的重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，瓦氏雅羅魚腸道前、中、后部組織結(jié)構(gòu)基本相同，主要差異表現(xiàn)在黏膜褶皺高度、環(huán)肌和縱肌厚度（表3）；另外，從兩種實驗魚數(shù)據(jù)可以看出，二者主要在腸道后部的黏膜褶皺高度、環(huán)肌厚度以及杯狀細(xì)胞數(shù)量存在顯著差異（P＜0.05）。其中，杯狀細(xì)胞數(shù)量隨著堿度升高顯著增加，尤其是腸道中部增加較為明顯。瓦氏雅羅魚堿水種腸道后部在堿度脅迫下也出現(xiàn)了少量杯狀細(xì)胞，而淡水種則未觀察到（圖6）。腸道內(nèi)的杯狀細(xì)胞增多，致使分泌黏液量增多，以防止腸道受損[25]。兩種實驗魚前、中、后腸的pH 呈“低-高-低”的變化趨勢，并未出現(xiàn)像馬加迪羅非魚從前腸到后腸pH逐漸升高的趨勢[17]，且遠(yuǎn)低于水環(huán)境pH（9.44～9.55）。因此，瓦氏雅羅魚是否吞飲湖水，通過腸道參與滲透壓調(diào)節(jié)，尚需要更多的生理和分子生物學(xué)證據(jù)。