張偉峰 雷素?fù)P 趙俊濤

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是一種危害人類健康的重要心血管疾病，被稱為發(fā)達(dá)國家的“頭號殺手”[1]。隨著發(fā)展中國家的經(jīng)濟(jì)發(fā)展，這種疾病也呈現(xiàn)逐年升高的趨勢。盡管近年來在治療方面取得了進(jìn)展，但心肌梗死患者隨后發(fā)生缺血和死亡的風(fēng)險(xiǎn)仍在增加。因此，開發(fā)一種新的高效治療方案具有重要意義。miRNA，一種長度僅在18～22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性，高度保守的微小分子，其通過沉默靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程在人類多種疾病中發(fā)揮調(diào)控作用[2-3]。且miRNA 也參與了機(jī)體多個(gè)器官如心臟、肺臟、腎臟、肝臟、皮膚的纖維化過程[4]。miR-93-5p是近2年在心肌梗死中新發(fā)現(xiàn)的失調(diào)miRNA 之一[5]，其在心肌梗死中的功能及機(jī)制尚未十分清楚。弗林蛋白酶（Furin）是一種高度特異性的絲氨酸內(nèi)切蛋白酶，歸屬于前蛋白轉(zhuǎn)化酶（proprotein convertases，PC）家族，其在心臟的發(fā)育、生長及結(jié)構(gòu)重塑中具有重要作用[6-7]。我們推測miR-93-5p 與Furin 在心肌梗死過程中的成纖維細(xì)胞纖維化中具有聯(lián)系。本研究旨在探討miR-93-5p 調(diào)控心臟成纖維細(xì)胞纖維化的功能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

心肌梗死模型小鼠購自上海百致生物醫(yī)藥科技有限公司；杜氏培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）購自Gibco公司；pcDNA3.1-EGFP 載體購自上海振譽(yù)生物科技有限公司；pmir-GLO 載體購自上海鈺博生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈免疫反應(yīng)（Real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain immune reaction，qRT-PCR）試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自日本TaKaRa；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自Promega；電化學(xué)發(fā)光（electronics components laboratory，ECL）試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)中涉及的引物及序列均有上海吉瑪公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和處理

使用開胸法無菌摘取小鼠心臟，去除結(jié)締組織，用胰酶消化，收集細(xì)胞懸液。用新鮮含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，再使用差速貼壁法將細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。其中貼壁細(xì)胞為心肌成纖維細(xì)胞，未貼壁的細(xì)胞為心肌細(xì)胞。將細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至3～4 代后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將心肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記為CF組，心肌細(xì)胞標(biāo)記為CM組。使用脂質(zhì)體對CF細(xì)胞進(jìn)行處理，具體的處理方法為：取3～4倍的質(zhì)粒或DNA 量的脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，miR-NC組（轉(zhuǎn)染miR-NC）、miR-93-5p mimic 組（轉(zhuǎn)染miR-93-5p mimic）、inhibitor-NC組（轉(zhuǎn)染inhibitor-NC）、miR-93-5p inhibitor 組（轉(zhuǎn)染miR-93-5p inhibitor）、pcDNA組（轉(zhuǎn)染pcDNA）、pcDNA-Furin 組（轉(zhuǎn)染pcDNA-Furin）、si-NC組（轉(zhuǎn)染si-NC）、si-Furin 組（轉(zhuǎn)染si-Furin）、miR-93-5p mimic+pcDNA組載體（共轉(zhuǎn)染miR-93-5p mimic和pcDNA）、miR-93-5p mimic+pcDNA-Furin 組（共轉(zhuǎn)染miR-93-5p mimic和pcDNA-Furin），將其轉(zhuǎn)染8 h 后，棄去培養(yǎng)基，用新培養(yǎng)基再培養(yǎng)48 h，用qRTPCR 驗(yàn)證轉(zhuǎn)染是否成功，將轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。若轉(zhuǎn)染不理想，需要調(diào)整轉(zhuǎn)染條件，更換質(zhì)粒，進(jìn)行重新轉(zhuǎn)染，直至轉(zhuǎn)染成功，才可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 qRT-PCR 檢測細(xì)胞中miR-93-5p、Furin 的表達(dá)

詳細(xì)步驟參考文獻(xiàn)[6]，miR-93-5p、Furin 以U6、GAPDH為內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算miR-93-5p、Furin 的相對表達(dá)。引物信息（5′-3′）：miR-93-5p，上游引物GCCATGTAAACATCTCGGACTG，下游引物CAATGCGTGTGGTGGAGGAG；U6，上游引物GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，下游引物CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT；Furin 上游引物CCAGAGCGCCCTTTGAAA，下游引物CCAGTCGCAAGATAAAAAAATACTTTG；GAPDH，上游引物GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACG，下游引物 TGCCATGGGTGGAATCATATTGG；PCR 條件：95℃15 min，94℃15 s，55℃30 s，70℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.3 Western blot 檢測細(xì)胞中Furin、CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP2、Fibronectin 的蛋白表達(dá)

用0.25 %胰酶消化、收集細(xì)胞，用蛋白裂解液充分將其裂解。然后進(jìn)行總蛋白的提取，定量和變性。用變性后的蛋白上清液進(jìn)行蛋白電泳上樣，結(jié)束后將蛋白從膠上轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。然后將膜進(jìn)行倍比稀釋的相應(yīng)一抗（1∶500～1 500）溶液中孵育過夜（4℃）。取出膜，將其浸入相應(yīng)倍稀釋的二抗（1∶1 000）溶液中孵育2 h（37℃）。最后，用ECL顯色液進(jìn)行顯影、曝光，將圖片用Quantity One 4.62 軟件進(jìn)行分析，用目的條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示蛋白的表達(dá)。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的熒光活性

構(gòu)建包含miR-93-5p 結(jié)合位點(diǎn)的Furin 野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體WT-Furin、MUTFurin，將其分別與miR-NC、miR-506-3p 共轉(zhuǎn)染至CF 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，按照雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒說明檢測熒光素酶活性。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（）表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-93-5p、Furin 在心肌成纖維細(xì)胞中的差異表達(dá)

運(yùn)用qRT-PCR和Western blot 檢測CM、CF 細(xì)胞中miR-93-5p、Furin 的表達(dá)情況。與CM 組相比，CF 組細(xì)胞中miR-93-5p mRNA 表達(dá)顯著升高，F(xiàn)urin 的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）。見表1。

表1 miR-93-5p、Furin在心肌成纖維細(xì)胞中的差異表達(dá)（±s）Table1 Differential expression of mir-93-5p and furin in cardiac fibroblasts（±s）

表1 miR-93-5p、Furin在心肌成纖維細(xì)胞中的差異表達(dá)（±s）Table1 Differential expression of mir-93-5p and furin in cardiac fibroblasts（±s）

組別CM 組CF 組t值P值miR-93-5p mRNA 1.01±0.06 1.28±0.11 6.464 0.000 Furin mRNA 1.00±0.08 2.54±0.15 27.176 0.000 Furin 蛋白0.99±0.07 1.53±0.11 12.424 0.000

2.2 miR-93-5p對成纖維細(xì)胞纖維化的影響

與miR-NC組相比，miR-93-5p mimic 組心肌成纖維細(xì)胞中miR-93-5p mRNA 表達(dá)顯著升高，CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP2、Fibronectin 的蛋白表達(dá)均顯著降低；與inhibitor-NC組相比，miR-93-5p inhibitor 組心肌成纖維細(xì)胞中miR-93-5p mRNA 表達(dá)顯著降低，CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP2、Fibronectin 的蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）。見表2。

表2 miR-93-5p 調(diào)控成纖維細(xì)胞纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)（±s）Table2 miR-93-5p regulates the expression of fibrosis related proteins in fibroblasts（±s）

表2 miR-93-5p 調(diào)控成纖維細(xì)胞纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)（±s）Table2 miR-93-5p regulates the expression of fibrosis related proteins in fibroblasts（±s）

注：與miR-NC組比較，aP＜0.05；與inhibitor-NC組比較，bP＜0.05。

組別miR-NC組miR-93-5p mimic 組inhibitor-NC組miR-93-5p inhibitor 組F值P值miR-93-5p mRNA 1.02±0.07 2.94±0.16a 0.97±0.06 0.20±0.12b 681.816 0.000蛋白CollagenⅠ0.99±0.08 0.67±0.05a 0.96±0.07 1.68±0.14b 197.784 0.000 CollagenⅢ1.02±0.08 0.77±0.06a 0.98±0.07 1.37±0.12b 76.054 0.000 TIMP2 1.01±0.09 0.52±0.04a 0.96±0.05 1.67±0.13b 278.185 0.000 Fibronectin 1.00±0.08 0.42±0.03a 0.99±0.08 1.71±0.13b 320.894 0.000

2.3 miR-93-5p 靶向Furin

通過Stabase 2 軟件預(yù)測到Furin 可能是miR-93-5p 的靶基因（圖1A）；雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，miR-93-5p mimic 組相較于miR-NC組可顯著降低Furin-WT 細(xì)胞的熒光素酶活性，miR-93-5p inhibitor 組相較于inhibitor-NC組可顯著升高Furin-WT細(xì)胞的熒光素酶活性；Western blot 檢測顯示，miR-93-5p mimic 組相較于miR-NC組Furin 蛋白表達(dá)顯著降低，miR-93-5p inhibitor組相較于inhibitor-NC組Furin 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），見表3和圖1B。

2.4 Furin 對成纖維細(xì)胞纖維化的影響

與pcDNA組相比，pcDNA-Furin 組細(xì)胞中Furin mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高，CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP2、Fibronectin 的蛋白表達(dá)均顯著升高；與si-NC組相比，si-Furin 組細(xì)胞中Furin mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低，CollagenⅠ、Colla-genⅢ、TIMP2、Fibronectin 的蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）。見表4。

表3 miR-93-5p 靶向Furin（±s）Table3 miR-93-5p targeting furin（±s）

表3 miR-93-5p 靶向Furin（±s）Table3 miR-93-5p targeting furin（±s）

注：與miR-NC組比較，aP＜0.05；與inhibitor-NC組比較，bP＜0.05。

組別miR-NC組miR-93-5p mimic 組inhibitor-NC組miR-93-5p inhibitor 組F值P值熒光活性Furin-WT 0.99±0.08 0.27±0.02a 0.99±0.06 1.77±0.12b 517.655 0.000 Furin-MUT 1.00±0.06 0.98±0.09a 0.97±0.08 1.02±0.10b 0.629 0.601 Furin蛋白1.00±0.08 0.68±0.06a 0.97±0.07 1.49±0.12b 138.634 0.000

表4 Furin 對成纖維細(xì)胞纖維化的影響（±s）Table4 Effect of furin on fibroblast fibrosis（±s）

表4 Furin 對成纖維細(xì)胞纖維化的影響（±s）Table4 Effect of furin on fibroblast fibrosis（±s）

注：與pcDNA組比較，aP＜0.05；與si-NC組比較，bP＜0.05。

組別pcDNA組pcDNA-Furin 組si-NC組si-Furin 組F值P值Furin mRNA 1.00±0.05 1.95±0.12a 0.99±0.06 0.32±0.03b 755.943 0.000蛋白Furin 1.02±0.09 1.64±0.09a 0.96±0.07 0.72±0.06b 224.016 0.000 CollagenⅠ1.01±0.08 1.82±0.15a 0.99±0.09 0.67±0.06b 213.243 0.000 CollagenⅢ1.00±0.08 1.49±0.13a 0.99±0.08 0.70±0.06b 116.072 0.000 TIMP2 1.02±0.09 1.55±0.12a 1.01±0.07 0.68±0.05b 155.919 0.000 Fibronectin 0.97±0.09 1.44±0.12a 0.99±0.08 0.52±0.04b 166.583 0.000

2.5 Furin 回復(fù)miR-93-5p對成纖維細(xì)胞纖維化的調(diào)控作用

與miR-93-5p mimic+pcDNA組相比，miR-93-5p mimic+pcDNA-Furin 組細(xì)胞中miR-93-5p mRNA表達(dá)顯著降低，CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP2、Fibronectin 的蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）。見表5。

表5 Furin 回復(fù)miR-93-5p對成纖維細(xì)胞纖維化的調(diào)控作用（±s）Table5 Regulatory effect of furin on fibroblast fibrosis by recovering miR-93-5p（±s）

表5 Furin 回復(fù)miR-93-5p對成纖維細(xì)胞纖維化的調(diào)控作用（±s）Table5 Regulatory effect of furin on fibroblast fibrosis by recovering miR-93-5p（±s）

注：與miR-93-5p+pcDNA組比較，aP＜0.05。

組別miR-93-5p mimic 組miR-93-5p mimic+pcDNA組miR-93-5p mimic+pcDNA-Furin 組F值P值蛋白miR-93-5p mRNA 1.02±0.08 0.99±0.09 0.76±0.06a 30.182 0.000 CollagenⅠ0.99±0.08 1.02±0.09 1.23±0.10a 18.844 0.000 CollagenⅢ1.00±0.08 0.98±0.09 1.31±0.11a 34.748 0.000 TIMP2 0.98±0.08 1.00±0.07 1.43±0.09a 89.953 0.000 Fibronectin 1.01±0.08 0.97±0.08 1.52±0.10a 111.355 0.000

3 討論

miRNAs 在心肌梗死的發(fā)生、發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用[8]，但是miR-93-5p 在心肌梗死中的功能仍有待進(jìn)一步開發(fā)。Liu 等[9]在研究中發(fā)現(xiàn)，包含miR-93-5p 的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived stromal cells，ADSC）外泌體能夠顯著的增強(qiáng)單純使用ADSC 對急性心肌梗死大鼠的心肌治療作用，并且這種機(jī)制與miR-93-5p 可分別通過靶向自噬相關(guān)基因（recombinant autophagy related protein 7，Atg7）和Toll 樣受體4（toll like receptor，TLR4）來抑制缺氧誘導(dǎo)的自噬和炎性細(xì)胞因子的分泌相關(guān)。Li 等[10]報(bào)道，miR-93 在冠狀動脈疾?。╟oronary artery disease，CAD）患者血液中升高，但其可抑制心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血再灌注的損傷，但在抑制miR-93 的小鼠模型中，能夠加速心臟重塑的惡化。Zhong 等[11]在急性心肌梗死組織的差異miRNA 分析中報(bào)道，miR-93-5p 的表達(dá)異常升高。

Furin是一種分泌型前蛋白轉(zhuǎn)化酶，可通過在一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部位點(diǎn)進(jìn)行有限的蛋白水解，將前體蛋白激活為生物活性形式[12]。其參與多種蛋白質(zhì)前體的成熟，包括生長因子、跨膜受體、內(nèi)分泌激素和粘附分子[13]。Furin 的多種潛在底物與心臟分化和發(fā)育的不同方面有關(guān)，例如，骨形態(tài)發(fā)生蛋白4抗體（bone morphogenetic protein 4，Bmp4）對于流出道（outflow tract，OFT）和房室（atrioventricular，AV）分隔是必需的，并受Furin 影響[14]。此外，攜帶突變的小鼠破壞了proBmp4 對Bmp4 的有序分裂，表現(xiàn)出發(fā)育異常，包括心血管缺陷[15]。王玨等[16]報(bào)道，在心臟成纖維細(xì)胞中，F(xiàn)urin 作為miR-24 的靶標(biāo)，參與小鼠心臟成纖維細(xì)胞的膠原合成、增殖、遷移過程。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)urin 在大鼠心臟成纖維細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并且下調(diào)Furin 能夠抑制心臟成纖維細(xì)胞中纖維化相關(guān)蛋白CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP2、Fibronectin 的表達(dá)，而上調(diào)Furin 則具有相反的作用。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均與上述前人的研究結(jié)果相吻合。miR-93-5p和Furin 在心肌梗死成纖維細(xì)胞中的表達(dá)雖都為上調(diào)，但是二者發(fā)揮的功能是相反的，這可能與機(jī)體在疾病發(fā)展的不同階段具有不同的生理病理學(xué)特性有聯(lián)系，發(fā)生這種作用的機(jī)制可能還與其他因素（miRNA 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)）相關(guān)，這有待進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，miR-93-5p 具有抑制心臟成纖維細(xì)胞纖維化的作用，其機(jī)制與靶向抑制Furin 有關(guān)，為心肌梗死的治療提供新靶點(diǎn)。