張文新 黃傳峰 孫楠 高飛 于婷 孫晶 曲守方 黃杰

微衛(wèi)星（microsatellite，MS）是細(xì)胞基因組中以少數(shù)幾個(gè)核苷酸（多為1～6個(gè)）為單位短串聯(lián)重復(fù)的DNA 序列。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）是DNA復(fù)制時(shí)DNA錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair，MMR）功能缺陷，使微衛(wèi)星重復(fù)序列的錯(cuò)誤未得到糾正而引起微衛(wèi)星序列長(zhǎng)度發(fā)生變化的現(xiàn)象[1]。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性可以分為3類：微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（microsatellite instability-high，MSI-H）、微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定（microsatellite instability-low，MSI-L）及微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellite stability，MSS）[2]。微衛(wèi)星不穩(wěn)定與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，常見(jiàn)于胃癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌等腫瘤[3-5]。研究報(bào)道MSI-H型胃癌擁有獨(dú)特的分子基因表型以及臨床病理特征，比MSI-L 以及MSS型的預(yù)后好[6]。因此分析腫瘤組織的微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)，可以指導(dǎo)腫瘤個(gè)體化治療，具有重要臨床意義。

目前臨床上主要采用兩種方法檢測(cè)MSI和MMR，多重?zé)晒饩酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）毛細(xì)管電泳法直接檢測(cè)MSI，或免疫組織化學(xué)法（immunohistochemistry，IHC）檢測(cè)MMR 蛋白的表達(dá)，主要包括MLH1、PMS2、MSH2、MSH6 等MMR 蛋白[7-8]。隨著檢測(cè)技術(shù)發(fā)展，高通量測(cè)序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)也應(yīng)用于腫瘤組織的MSI檢測(cè)[9]。目前國(guó)內(nèi)已有公司申請(qǐng)MSI檢測(cè)試劑盒（熒光PCR-毛細(xì)管電泳法）的注冊(cè)。亟需建立統(tǒng)一的國(guó)家參考品，用于評(píng)估MSI檢測(cè)試劑盒的性能。本研究利用熒光PCR-毛細(xì)管電泳法檢測(cè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)國(guó)家參考品，驗(yàn)證微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)國(guó)家參考品用于相關(guān)試劑盒性能評(píng)價(jià)及臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量評(píng)價(jià)的適用性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）檢測(cè)國(guó)家參考品，批號(hào)：360028-201901，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

1.2 試劑

微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）檢測(cè)試劑盒（熒光PCR-毛細(xì)管電泳法），上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司提供。結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)檢測(cè)試劑盒（熒光PCR-毛細(xì)管電泳法），北京閱微基因技術(shù)有限公司提供。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）檢測(cè)試劑盒（熒光PCR 毛細(xì)管電泳法），廣州達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司提供。對(duì)試劑盒廠家進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)，分別為公司A，公司B，公司C。

1.3 儀器

3500 Dx基因分析儀和Veriti?Dx 96-well PCR儀，上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司提供。3500xL Dx基因分析儀和Veriti?Dx 96-well PCR 儀，北京閱微基因技術(shù)有限公司提供。3500 Dx基因分析儀和ABI PCR 2720 儀，廣州達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司提供。

1.4 方法

各實(shí)驗(yàn)室按照據(jù)各自的方法以及試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.4.1 PCR擴(kuò)增

將PCR反應(yīng)液、酶混合液、引物混合液、無(wú)核酸酶水置于室溫解凍至完全溶解。配制除模板以外的反應(yīng)體系，各組分加入后，渦旋振蕩后，分裝到0.2 mL PCR 管中。依次向已分裝擴(kuò)增體系的各管中加入1 μL 或者0.5 μL 待檢樣本、MSI 陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照（無(wú)核酸酶水）。將各反應(yīng)管放置于PCR 儀的反應(yīng)槽內(nèi)，運(yùn)行PCR 程序。

1.4.2 基因分析儀檢測(cè)擴(kuò)增片段

PCR反應(yīng)結(jié)束之后，制備毛細(xì)管電泳檢測(cè)樣品。以基因分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。使用POP7 膠。選擇“Fragment”電泳方法，參考基因分析儀的使用說(shuō)明書。檢測(cè)數(shù)據(jù)使用GeneMapper?分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4.3 結(jié)果判定

統(tǒng)計(jì)試劑盒微衛(wèi)星檢測(cè)位點(diǎn)，對(duì)樣本的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性狀態(tài)進(jìn)行判定：≥2個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)不穩(wěn)定，判斷為MSI-H；1個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)不穩(wěn)定，判斷為MSI-L；沒(méi)有微衛(wèi)星位點(diǎn)不穩(wěn)定，則判斷為MSS。

2 結(jié)果

2.1 陽(yáng)性參考品結(jié)果

對(duì)國(guó)家參考品中的16 對(duì)陽(yáng)性參考品共32例樣本進(jìn)行檢測(cè)，3家試劑盒的結(jié)果顯示均為微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定。以國(guó)家陽(yáng)性參考品MSI-3及其對(duì)應(yīng)的配對(duì)參考品MSI-3-對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果為例，A公司選擇的8個(gè)位點(diǎn)均為微衛(wèi)星不穩(wěn)定位點(diǎn)，B公司選擇的6個(gè)位點(diǎn)均為微衛(wèi)星不穩(wěn)定位點(diǎn)，C公司選擇的6個(gè)位點(diǎn)也均為微衛(wèi)星不穩(wěn)定位點(diǎn)，均檢出相應(yīng)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性狀態(tài)。見(jiàn)圖1。

2.2 陰性參考品結(jié)果

對(duì)國(guó)家參考品中的3 對(duì)陰性參考品共6例樣本進(jìn)行檢測(cè)，3家試劑盒的結(jié)果顯示均為微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）。以國(guó)家陰性參考品MSI-19及其對(duì)應(yīng)的配對(duì)參考品MSI-19-對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果為例，A公司選擇的8個(gè)位點(diǎn)中都沒(méi)有微衛(wèi)星不穩(wěn)定位點(diǎn)，B公司選擇的6個(gè)位點(diǎn)中都沒(méi)有微衛(wèi)星不穩(wěn)定位點(diǎn)，C公司選擇的6個(gè)位點(diǎn)中也都沒(méi)有微衛(wèi)星不穩(wěn)定位點(diǎn)，均檢出相應(yīng)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性狀態(tài)。見(jiàn)圖2。

2.3 檢測(cè)限參考品結(jié)果

對(duì)國(guó)家參考品中的6 組檢測(cè)限參考品共24例樣本進(jìn)行檢測(cè)，3家試劑盒的結(jié)果顯示，對(duì)20%和10%腫瘤DNA 含量的檢測(cè)限參考品均能正確檢出相應(yīng)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性狀態(tài)，而有1家試劑盒對(duì)5%腫瘤DNA 含量的檢測(cè)限參考品未能正確檢出相應(yīng)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性狀態(tài)。

以國(guó)家檢測(cè)限參考品MSI-LOD3-20%、MSILOD3-10%、MSI-LOD3-5%及其對(duì)應(yīng)的配對(duì)參考品MSI-LOD3-對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果為例，A公司MSI-LOD3-20%及MSI-LOD3-10%的8個(gè)位點(diǎn)都為微衛(wèi)星不穩(wěn)定位點(diǎn)，B公司MSI-LOD3-20%及MSI-LOD3-10%的6個(gè)位點(diǎn)中分別有6個(gè)和3個(gè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定位點(diǎn)，C公司MSI-LOD3-20%及MSI-LOD3-10%的6個(gè)位點(diǎn)中分別有6個(gè)和5個(gè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定位點(diǎn)，都檢出相應(yīng)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性狀態(tài)。同時(shí)A公司MSI-LOD3-5%的8個(gè)位點(diǎn)中有7個(gè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定位點(diǎn)，C公司MSI-LOD3-5%的6個(gè)位點(diǎn)中有3個(gè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定位點(diǎn)；但B公司MSI-LOD3-5%的6個(gè)位點(diǎn)中僅有1個(gè)位點(diǎn)為微衛(wèi)星不穩(wěn)定位點(diǎn)，未檢出相應(yīng)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性狀態(tài)。見(jiàn)圖3。

3 討論

MSI是一種遺傳性改變，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。MSI檢測(cè)已被美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南及中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（Chinese Society of Clinical Oncology，CSCO）結(jié)直腸癌診療指南推薦用于所有結(jié)直腸癌患者[10-11]。2016年，歐洲臨床腫瘤協(xié)會(huì)（European Society for Medical Oncology，ESMO）轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌共識(shí)提出，MSI檢測(cè)對(duì)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療具有重要的預(yù)測(cè)價(jià)值。2017年美國(guó)食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)了默沙東公司的帕博利珠單抗注射液（Keytruda），用于治療攜帶MMR功能缺陷（deficient mismatch repair，dMMR）和微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定性（MSI-H）的晚期（轉(zhuǎn)移性）實(shí)體瘤患者。MSI 作為晚期（轉(zhuǎn)移性）實(shí)體瘤特別是結(jié)直腸癌患者免疫治療療效的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物，其檢測(cè)具有重要的臨床意義。

MSI檢測(cè)的常用方法是多重?zé)晒釶CR 毛細(xì)管電泳法，它的原理是選擇美國(guó)國(guó)家癌癥研究所（National Cancer Institute，NCI）推薦的微衛(wèi)星（MS）位點(diǎn)[12-13]，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及毛細(xì)管電泳，比較腫瘤組織與正常對(duì)照組織的結(jié)果，確定MSI 狀態(tài)。為了標(biāo)準(zhǔn)化MSI 的檢測(cè)，1998年NCI 推薦Bethesda 指南，推薦2個(gè)單核苷酸重復(fù)位點(diǎn)BAT-25和BAT-26和3個(gè)雙核苷酸重復(fù)位點(diǎn)D2S123、D5S346和D17S250。2002年NCI 進(jìn)行修訂，推薦5個(gè)單核苷酸重復(fù)位點(diǎn)BAT-25、BAT-26、NR21、NR24和NR27。Bacher 等人提出Promega分析系統(tǒng)，以Mono-27 取代NR27，并增加Penta C和Penta D 用于識(shí)別樣本，進(jìn)一步提高了MSI檢測(cè)的敏感性。我國(guó)CSCO 結(jié)直腸癌診療指南（2018年版）建議采用NCI推薦的BAT-25、BAT-26、D2S123、D5S346和D17S250 位點(diǎn)進(jìn)行MSI檢測(cè)。

目前國(guó)家藥品監(jiān)督管理局尚未批準(zhǔn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)試劑盒（熒光PCR-毛細(xì)管電泳法）。至今MSI檢測(cè)技術(shù)仍沒(méi)有較為統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，腫瘤MSI檢測(cè)位點(diǎn)不僅僅包括以上推薦位點(diǎn)。為了提高M(jìn)SI檢測(cè)的敏感性和特異性，不同廠家的試劑盒開(kāi)發(fā)并選擇了不同的檢測(cè)位點(diǎn)。為了更好評(píng)價(jià)上市前的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)試劑盒（熒光PCR-毛細(xì)管電泳法）性能，建立標(biāo)準(zhǔn)化的統(tǒng)一的國(guó)家參考品是非常有必要的。本院建立的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)國(guó)家參考品，來(lái)源于FFPE 腫瘤組織或者細(xì)胞系以及相應(yīng)的配對(duì)樣本，包括了微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定、微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定及微衛(wèi)星穩(wěn)定三種狀態(tài)，其中微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定參考品涵蓋了不同的微衛(wèi)星不穩(wěn)定位點(diǎn)，能夠有效的評(píng)價(jià)試劑盒的性能。為了評(píng)價(jià)試劑盒的檢測(cè)敏感性，還根據(jù)目前臨床實(shí)際應(yīng)用的檢測(cè)水平，設(shè)置不同腫瘤DNA 含量的樣本，包括20%、10%、5%三種梯度。

3家不同公司的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)試劑盒（熒光PCR-毛細(xì)管電泳法）對(duì)國(guó)家參考品62例樣本的結(jié)果顯示，陽(yáng)性參考品的結(jié)果均為微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定，陰性參考品的結(jié)果均為微衛(wèi)星穩(wěn)定，20%和10%腫瘤DNA 含量檢測(cè)限參考品的結(jié)果均符合國(guó)家參考品的標(biāo)示結(jié)果，而有1家試劑盒對(duì)5%腫瘤DNA 含量的檢測(cè)限參考品未檢出相應(yīng)的MSI 狀態(tài)。國(guó)家陽(yáng)性參考品和陰性參考品的檢測(cè)結(jié)果表明雖然3家公司所選擇的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性位點(diǎn)有所差異，但是對(duì)同一份樣本的微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)的結(jié)果判定是一致的，均檢出相應(yīng)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性狀態(tài)，結(jié)果準(zhǔn)確。從國(guó)家檢測(cè)限參考品的檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)有的試劑盒對(duì)于5%腫瘤DNA 含量的檢測(cè)限參考品不能檢測(cè)出相應(yīng)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性狀態(tài)。在臨床實(shí)際檢測(cè)中MSI檢測(cè)限一般規(guī)定為20%。如果提高試劑盒檢測(cè)的敏感性，可能會(huì)降低檢測(cè)的特異性。根據(jù)臨床實(shí)際應(yīng)用，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）檢測(cè)國(guó)家參考品要求試劑盒對(duì)20%和10%腫瘤DNA 含量的檢測(cè)限參考品應(yīng)檢出相應(yīng)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性狀態(tài)；對(duì)5%腫瘤DNA 含量的檢測(cè)限參考品可檢出或未檢出相應(yīng)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性狀態(tài)。3家公司的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)試劑盒（熒光PCR-毛細(xì)管電泳法）的檢測(cè)結(jié)果顯示均符合國(guó)家參考品的陽(yáng)性參考品符合率、陰性參考品符合率和檢測(cè)限的要求。本實(shí)驗(yàn)室建立的國(guó)家參考品，可滿足微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)的要求，適用于熒光PCR-毛細(xì)管電泳法試劑盒的性能評(píng)價(jià)及臨床實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量評(píng)價(jià)。