王小波 熊惠娟 吳莎莎 耿志榮 王志林

(1湖北科技學院藥學院，咸寧 437100)

(2南京大學化學化工學院，配位化學國家重點實驗室，南京 210023)

0 引 言

熒光探針技術是基于熒光信號的產生、轉換和識別的分析檢測手段，它相比于高效液相色譜法、電化學分析法等，具有選擇性高、檢測限低、能實現(xiàn)原位檢測、實時跟蹤監(jiān)測和不需復雜的前處理工序等優(yōu)點。熒光探針概念的提出最早可追溯到1977年，密歇根州立大學的Sousa首次報道了2個基于萘環(huán)-冠醚體系的化合物，當堿金屬離子與其相互作用時，熒光發(fā)生了顯著的淬滅或增強現(xiàn)象[1]。隨后，De Silva于1986年引入了“熒光開關”這一新的表述方式[2]。直至1994年，Czarnik明確提出了熒光探針的構成三要素，即識別基團(receptor)、熒光信號基團(fluorophore)及連接臂(spacer)[3](圖1)。在熒光信號基團-連接臂-識別基團這一經典模型的指導下，針對各種目標底物的熒光探針不斷涌現(xiàn)，其中不乏一些高選擇性、高靈敏性的探針分子，已被廣泛應用于生化檢測、食品藥品監(jiān)控與分析、臨床疾病篩查、環(huán)境監(jiān)測等各項領域[4-9]。

圖1 熒光探針的基本構成示意圖Fig.1 Basic composition of fluorescent probes

熒光探針的分類方法較多，粗略地按制備方法可分為有機小分子探針、納米熒光探針和基因熒光探針3類。常見的如依據(jù)機理的不同可分為：(1)光誘導電子轉移 (PET)[10]；(2)熒光共振能量轉移(FRET)[11]；(3)分子內電荷轉移 (ICT)[12]；(4)激基締合物的形成或消失(Monomer-Excimer)[13]；(5)激發(fā)態(tài)分子內質子轉移 (ESIPT)[14]；(6)聚集誘導發(fā)光 (AIE)[15]等。另外，根據(jù)檢測的目標底物的不同可細分為pH探針、金屬離子探針、陰離子探針、活性氧(ROS)探針、生物活性分子探針、細胞器探針、微環(huán)境探針等。大環(huán)多胺的結構特點為環(huán)形空腔和含有較多(通常3個以上)擁有孤對電子的N原子，因此它能與H+、金屬離子等的空軌道作用，從而影響或改變分子中電子的傳遞、或改變自身的結構，進而通過熒光光譜的改變反映出對底物的識別過程。進一步地，大環(huán)多胺與金屬離子形成配合物后，可與陰離子、生物分子、DNA、RNA等相互作用，發(fā)生特異性結合。此外，由于較多N原子的存在，引入連接臂和各種熒光團或進行其他結構修飾(功能化)則顯得尤其方便。由此可知，大環(huán)多胺作為直接或間接識別基團，在構筑熒光探針方面具有其獨特的“天賦”優(yōu)勢。

隨著熒光分析技術的進步與儀器靈敏性的不斷升級，相信大環(huán)多胺型熒光探針分子庫將會進一步發(fā)展和豐富，并在化學、生物、醫(yī)學、環(huán)境等諸多領域發(fā)揮越來越重要的作用。本文將通過檢測底物的不同來進行分類，就近年來基于大環(huán)多胺的熒光探針進行綜述總結。代表性的大環(huán)多胺有四氮環(huán)cyclen、cyclam、pyclen，及三氮環(huán) tacn 等，其結構如表1。

表1 常見大環(huán)多胺的結構與基本信息Table 1 Structures and basic information of the common macrocyclic polyamines

1 生命體系富含的金屬離子探針

K+、Na+、Ca2+是生命體系中最豐富的金屬離子，此外，一些微量的過渡金屬離子如Zn2+、Cu2+、Fe3+、Fe2+等也在人體的各項生理活動和新陳代謝中發(fā)揮著舉足輕重的作用。在所有基于大環(huán)多胺熒光探針的報道中，關于這些離子的文獻數(shù)量占比也是最大的。Abir等[30]在cyclam上引入單一的亞甲基苯并咪唑作為熒光團，合成得到了一個“OFF-ON”型Zn2+探針1。該探針對Zn2+有良好的選擇性，而Cu2+則淬滅其熒光。當向探針1的溶液中逐漸加入Zn2+時，熒光強度(λem=304 nm)隨Zn2+濃度的增加而線性升高，最終可達到起始強度的12倍，熒光量子產率則從0.02增加至0.2。其熒光增強機理為Zn2+通過與環(huán)上的N配位，阻礙了PET過程的發(fā)生，并有效促進了螯合增強熒光效應(CHEF)。與其結構類似，區(qū)別僅在于識別基團為cyclen的化合物2，在Zn2+傳感上則遠不及1，其原因可能為在構筑探針方面，cyclam相比于cyclen具有更好的CHEF效果[31]。

Shiraishi等[32]報道了一個苯基苯并惡唑-酰胺-cyclen型的比例型Zn2+熒光探針3。該探針水溶性良好，發(fā)射峰位于383 nm處，當向其中加入Zn2+時，該發(fā)射峰強度逐漸下降，而在445 nm處出現(xiàn)一個新的發(fā)射峰，并隨Zn2+濃度的增加而增加，而其他金屬離子均無此現(xiàn)象。通過測量該化合物加入Zn2+前后的IR光譜和電勢滴定數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)Zn2+除與cyclen上4個氮原子配位外，還與酰胺鍵中的O發(fā)生了強烈的配位作用，并導致酰胺鍵中-NH-的去質子化，于是產生了新的熒光發(fā)射峰(445 nm)。從頭計算表明，去質子化使得苯并惡唑單元在處于激發(fā)態(tài)時可以自由旋轉，進而穩(wěn)定了TICT激發(fā)態(tài)。

Comby等[33]制備了一個基于Yb（Ⅲ）-cyclen-8-羥基喹啉體系的新型Zn2+探針4。此化合物通過配位非飽和的Yb（Ⅲ）前體配合物5與磺酸化的8-羥基喹啉在溶液中自組裝而得。在磺酸化8-羥基喹啉“天線效應”的作用下，探針4在近紅外區(qū)表現(xiàn)出較高的熒光量子產率(甲苯，Q=(0.23±0.03)%)。其對Zn2+的傳感機理為，加入的Zn2+的與磺酸化的8-羥基喹啉結合形成了更為穩(wěn)定的復合物，產生了該復合物的特征綠色熒光(λem=529 nm)，而由于4的“天線”被奪走，起初的近紅外熒光發(fā)射峰 (Yb3+：2F5/2→2F7/2，λem=984 nm)則消失。由此可知，探針4能同時在近紅外區(qū)和可見光區(qū)實現(xiàn)對Zn2+的高效檢測，且EDTA滴定實驗表明其對Zn2+的熒光響應具有可逆性。事實上，Yb（Ⅲ）前體配合物5也能通過熒光淬滅實現(xiàn)對Zn2+的檢測。

化合物6是趙玉芬等[34]報道的一個以羅丹明為熒光團，酰胺鍵為連接臂，cyclen為識別基團的Cu2+熒光探針。它具有較高的選擇性和靈敏性，可實現(xiàn)對Cu2+的裸眼識別，向6的溶液中加入Cu2+，溶液由無色變?yōu)榉凵Ｗ贤饪梢娢展庾V顯示，當體系中Cu2+的量為6的2倍時，557 nm處的吸光度達到最大值，增加了71倍，工作曲線也進一步表明6與Cu2+的結合比為1∶2。熒光光譜發(fā)現(xiàn)Cu2+可使580 nm處的發(fā)射峰強度提高53倍，是一個并不多見的“OFF-ON”型Cu2+探針，通過計算可得其對Cu2+的檢測限為 2 μmol·L-1。

圖2 探針1～5的結構Fig.2 Structures of fluorescent probes 1～5

圖3 探針6～10的結構Fig.3 Structures of fluorescent probes 6～10

Watkinson 等[35]在 1，8-萘二酰亞胺的基礎上，通過雙點擊反應，引入cyclam作為識別基團和生物素作為癌細胞靶向基團，成功合成出水溶性良好的化合物7。熒光滴定實驗和競爭性實驗表明7是一個優(yōu)良的Zn2+增強型探針，同時它具有很低的細胞毒性。在激光共聚焦顯微鏡下，通過與DAPI對比染色發(fā)現(xiàn)，探針7能透過細胞膜并進入MCF-7細胞核內，而在核外幾乎未見分布。當向培養(yǎng)基中加入外源性鋅補充劑吡啶硫酮鋅后，細胞核內及核外熒光均顯著增強。繼續(xù)加入鋅螯合劑TPEN孵育后，整個細胞內的熒光則明顯減弱。當以正常N-TERT角質細胞來重復上述實驗時，發(fā)現(xiàn)即使加入足量的吡啶硫酮鋅，也無法觀察到明顯的熒光。由此可知探針7具有良好的癌細胞靶向性，可用于癌細胞中Zn2+的熒光成像，這為研究Zn2+在細胞癌變及癌癥演化過程中的作用提供了有力武器。

Pierre課題組[36]報道了一個K+探針8，它以氮雜冠醚同時作為識別基團和連接基團，連接5H-色烯并[2，3-b]吡啶-5-酮作為天線。沒有K+加入時，天線處于遠端，熒光很弱，當加入K+，冠醚與K+配位，pπ共軛拉近了天線和金屬中心Tb3+的距離，使得能量可以從天線傳遞到Tb3+，實現(xiàn)了對K+的熒光傳感。該分子是一個優(yōu)良的時間門控型傳感器，對K+的結合常數(shù)為0.33 L·μmol-1。它對K+的選擇性相對于常見競爭性離子如 Na+、Li+、Mg2+與 Ca2+等，分別達到93、260、105和61倍。因此探針8非常有希望作為臨床 K+(0～10 mmol·L-1)的檢測分析工具。

林偉英等[37]在cyclam環(huán)上引入三碳花青染料作為長波長熒光團，制備得到了一個比例型的近紅外Cu2+熒光探針9，其2組發(fā)射峰分別位于637 nm(近紅外區(qū))與 778 nm(遠紅外區(qū))，相差達 142 nm。該探針對Cu2+的響應快，靈敏度高，檢測限低至8.9×10-8mol·L-1，成功應用于SMMC7721細胞和昆明小鼠體內對Cu2+的熒光成像。

王志林等[38]在pyclen環(huán)上連接單個NBD懸臂合成了一個 “ON-OFF”型Cu2+熒光探針10。只有Cu2+能有效淬滅10的熒光，即使在遠遠過量的Na+、Ca2+、Mg2+存在下也不影響對Cu2+的檢測。同時，該探針能選擇性定位于細胞的溶酶體，因而可適用于亞細胞層面對溶酶體中Cu2+的分析及成像，這將有助于理解溶酶體中Cu2+的功能及相關疾病如威爾遜病、門克斯綜合征、阿爾茲海默氏癥等。

2 重金屬離子探針

電子產品的普及和較低的回收利用率使得重金屬離子如Pb2+、Hg2+、Cd2+等的污染廣泛存在，它們在人體內富集到一定程度會對各器官造成嚴重傷害，制備針對上述重金屬離子的高選擇性和靈敏性探針具有重要的現(xiàn)實意義?；诖蟓h(huán)多胺的重金屬離子熒光探針也有較多文獻報道。蘭靜波等[39]合成了2個基于雙cyclen為識別基團和苝酰亞胺為熒光團的化合物11與12。Pb2+的加入能顯著提高它們在548 nm發(fā)射峰的熒光強度，在其他金屬離子的競爭干擾下，12比11具有更突出的Pb2+選擇性與靈敏性。由于11中含有一頭一尾2個cyclen環(huán)，呈對稱結構，而12中只一端為cyclen，另一端為親脂性的n-C8H17，所以探針11具有更好的水溶性，其與Pb2+的結合比為 1∶2，12 與 Pb2+的結合比則為 1∶1。 鑒于12更好的親脂性，將其成功用于HepG2中對Pb2+的熒光成像。

余孝其等[40]在cyclen的基礎上，通過經典的點擊化學手段，在對稱性的雙側或僅單側引入蒽環(huán)作為熒光團制備得到了相應的化合物13與14。雖然結構相似，但這2個分子在金屬離子識別方面卻大相徑庭。擁有雙蒽環(huán)的13對Pb2+具有優(yōu)良的選擇性，Pb2+可使其熒光顯著增強，其他離子則對熒光無影響(Cu2+淬滅其熒光)。而對于單側蒽環(huán)的14，只有Hg2+及Cu2+能較大程度地淬滅其熒光，其他金屬離子無影響。其中Cu2+的“ON-OFF”效應更為顯著，熒光幾乎完全淬滅。在 13濃度為 10 mmol·L-1的HEPES(pH 7.4，50 mmol·L-1)中，以 Pb(NO3)2溶液進行熒光滴定，熒光強度與cPb2+在 0～10 μmol·L-1范圍內成良好的線性關系。隨后，作者成功將探針13用于對MDA-MB-231細胞中外源性Pb2+的熒光成像。為了考察探針13是否能在復雜生物樣品中也能對Pb2+進行檢測，選取了胎牛血清作為對象，將Pb2+加入血清制備成特定濃度后進行熒光滴定，結果表明其仍然對胎牛血清中的Pb2+具有良好的熒光響應與線性關系。由此可知，13是一個極具前景的可用于復雜生物樣品中Pb2+定量檢測的熒光探針。

王志林課題組[41]利用pyclen連接丹磺酰氯為熒光團，合成了一個水溶性良好的高靈敏性Hg2+熒光探針 15，檢測限達到 0.5 μg·L-1，低于美國環(huán)保局所要求的飲用水中汞的最高含量2 μg·L-1[42]。鑒于15與Hg2+作用十分迅速且肉眼可見顏色變化，將15涂覆于濾紙條上可做成試紙來方便快捷地檢測Hg2+含量。

Bazzicalupi等[43]報道了一系列以7-甲氧基-香豆素為熒光團，含S的不同氮雜環(huán)為識別基團的化合物16，17與18。在CH3CN/H2O混合溶液(4/1，V/V)中，此3個化合物均對Hg2+呈現(xiàn)熒光響應，然后它們都可用于對Cos-7細胞中的Hg2+熒光成像。當它們以Si@PEG納米材料包裹或負載于PVC聚合物薄膜上后，即可用于純水中對Hg2+的檢測。此外，作者將18均勻分散浸入到PVC薄膜中，并利用計算機屏幕照相輔助技術，成功實現(xiàn)了對天然水樣品中的Hg2+定量分析。除了上述對Hg2+的共性響應外，當向化合物17的乙腈溶液中加入各種金屬離子時，唯有Al3+和Fe3+能使熒光急劇增強，表明17可用于對Al3+和Fe3+的分析檢測。

圖4 探針11～18的結構Fig.4 Structures of fluorescent probes 11～18

圖5 探針19～21的結構Fig.5 Structures of fluorescent probes 19～21

Choi等[44]合成了2個以4-硝基-苯并呋咱(NBD)為熒光團，cyclen為識別基團的化合物19與20。其中化合物20對Hg2+、Cd2+及Pb2+均有不同程度的響應而選擇性較差，化合物19則對Hg2+有優(yōu)異的選擇性。向乙酸/DMSO 緩沖液(1∶9，V/V，pH=4.8)中加入Hg2+，溶液顏色由起始的粉色變?yōu)辄S色，表明該探針能在酸性條件下實現(xiàn)對Hg2+的裸眼識別。當cHg2+/c19達到100時，530 nm處熒光強度提高至原來的24.8倍。在上述酸性溶液中，探針19對Hg2+檢測限為 1.5 μmol·L-1。

Chang課題組[45]在cyclam環(huán)上同時引入NBD和苝環(huán)為兩組具有不同發(fā)射波長的熒光團，制備得到了化合物21。游離的21分子在溶液中具有2個熒光發(fā)射峰，分別為385和538 nm，這是苝環(huán)和NBD的特征峰。對于Cu2+的熒光滴定，538 nm處發(fā)射峰強度明顯降低，而385 nm處基本沒有變化。當向含有21的溶液中逐漸加入Hg2+時，538 nm處的熒光強度逐漸增加，最終可達起始值的10倍(此時cHg2+/c21=100)，而385 nm處的發(fā)射峰基本維持不變。這充分說明化合物21對于Hg2+和Cu2+而言，分別為“OFF-ON”型和“ON-OFF”型熒光探針，兼具檢測Hg2+和 Cu2+的功能。

3 鹵素陰離子與磷系物種探針

鹵素陰離子 X-(如 F-、Cl-、I-)與一些磷系物種如PPi、ATP、ADP、AMP 等在生命體系中扮演者不可替代的角色。大環(huán)多胺與金屬離子形成配合物后，可廣泛用于對X-及磷系物種的熒光傳感。Liu等[46]以C2對稱性的cyclen骨架為基礎，制備得到了一系列鑭系配合物 22～24(Ln=Eu，Tb，Yb)。 當向它們的溶液加入F-后，F(xiàn)-會與兩分子中的Ln3+成鍵，并將2個配合物分子彼此拉近，形成一個近乎封閉的 “籠子”，F(xiàn)-自身則被包裹于“籠”中并占據(jù)中心位置。此超分子自組裝過程可由紫外可見吸收光譜、穩(wěn)態(tài)發(fā)射光譜、NMR與高分辨質譜實施監(jiān)控。X-ray單晶衍射則進一步揭示了“Eu-F-Eu”橋及Eu配合物二聚體的存在。Eu配合物對F-表現(xiàn)出優(yōu)良的選擇性，Eu3+特征熒光發(fā)射峰強度可提高22倍，而Cl-、Br-、AcO-與HCO3-均無響應。表明Eu配合物22是一個優(yōu)異的F-探針，其對F-的檢測限可達0.46 μg·L-1(24 nmol·L-1)。

盧忠林課題組[47]以三氮環(huán)[12]aneN3為Cu2+識別基團，BODIPY為熒光團設計合成了一個含雙三氮環(huán)的“ON-OFF-ON”型Cu2+及ADP熒光探針25。Cu2+與25以2∶1的方式結合，且?guī)缀蹩赏耆銣?5的熒光。 當繼續(xù)加入 ATP、ADP、AMP、PPi等各種磷系物種時，唯有ADP能使熒光完全恢復，它也被用于HepG2中外源性Cu2+及ADP的檢測。2018年，該團隊[48]仍在[12]aneN3為Cu2+配位識別基團的基礎上，以具有AIE活性的四苯基乙烯為核，制備了一個新的“ON-OFF-ON”型熒光探針26，可在水溶液中自組裝成AIE膠束，用于對Cu2+和ATP的熒光傳感。Cu2+能有效淬滅26的熒光，隨后加入ATP、ADP、AMP、GSH、Cys、Hcy及其它陰離子，只有 ATP 能讓熒光恢復(ADP不明顯)。該探針對Cu2+及ATP的檢測限分別為0.1和1.5 μmol·L-1。MTT實驗表明26及26-Cu2+對細胞具有很低的細胞毒性和良好的細胞膜透過性，它們可成功用于HepG2細胞中對Cu2+與ATP的熒光成像。這也是第一例將AIE膠束用作界面熒光探針的報道。

王志林團隊[49-50]以pyclen分別連接萘環(huán)和蒽環(huán)作為熒光團合成得到了2個化合物27和28，當加入Zn2+時，它們的熒光均顯著提高，是典型的“OFFON”型Zn2+熒光探針。與Zn2+結合形成相應的復合物27-Zn（Ⅱ）和28-Zn（Ⅱ）后，都能對焦磷酸根(PPi)產生特異性的響應，同時又有所不同。對于27-Zn（Ⅱ），加入PPi后在415 nm處產生了新的熒光峰，內在原因是1個PPi與兩分子的27-Zn（Ⅱ）發(fā)生靜電相互作用，在PPi的牽引下形成了激基締合物。對于28-Zn（Ⅱ），PPi只是淬滅原體系的熒光。因此，27-Zn（Ⅱ）與28-Zn（Ⅱ）分別為比率型和 “ON-OFF”型PPi熒光探針。27-Zn（Ⅱ）成功用于檢測無機焦磷酸酶的活性，28-Zn（Ⅱ）則用于檢測堿性磷酸酶及ATP硫酸化酶的活性。

圖6 探針22～28的結構Fig.6 Structures of fluorescent probes 22～28

4 重要功能性生物小分子探針

為了抵御外來應激壓力與損傷，細胞內的一些生物活性小分子如GSH、Cys、Hcy扮演著“清道夫”的重要角色。此外，越來越多的研究表明，H2S、NO等作為內源性氣體信號分子在調節(jié)血管舒張、神經傳導、心肌收縮、細胞凋亡、炎癥等生理過程中具有十分重要的意義。因而設計研發(fā)針對上述重要生物功能小分子的大環(huán)多胺型熒光探針也是化學家的重要研究興趣之一。Gunnlaugsson等[51]制備了1個含有4個酰胺懸臂的單核鋱配合物29，其中1個懸臂(天線)含有馬來酰亞胺官能團，可以與-SH發(fā)生1，4-Michael加成反應。在無GSH時，天線上的能量無法向Tb3+轉移，當Michael加成反應發(fā)生即GSH連接上之后，實現(xiàn)了能量向Tb3+的轉移，熒光大大增強，故此探針可用于對GSH的靈敏檢測。在生命體系中，氧化型谷胱甘肽(GSSG)轉化成GSH是一個廣泛存在的還原反應，此反應需在谷胱甘肽還原酶催化和還原氫(NADPH)做電子給體的條件下發(fā)生。因此，利用29監(jiān)控GSH的產生來間接實現(xiàn)對谷胱甘肽還原酶的活性監(jiān)測成為可能。通過熒光光譜動力學實驗，測定了 4.93、9.86、19.72 nmol·L-1三個谷胱甘肽還原酶濃度下，GSSG平衡轉化為GSH的時間差異，分別為36、18和10 min。表明在不同谷胱甘肽還原酶濃度下，體系中GSSG轉化為GSH的時間不同，濃度越高，所需時間越短。這樣，可以建立起以29作為GSH探針來測定谷胱甘肽還原酶活性的分析法。

王志林課題組[52]以橋聯(lián)雙三氮環(huán)tacn為金屬離子螯合位點，NBD為熒光團制備得到了對Hg2+有響應的熒光探針30。進而利用Hg與S的強親和力，可實現(xiàn)對生命體系中常見的含硫物種如GSH與Cys的檢測，成功用于人體血清和胎牛血清中GSH 的檢測，測得含量分別為 810 與 617 μmol·L-1。另外，該探針還具有一定的高爾基體選擇定位能力。該團隊[53]還用BODIPY為熒光團合成了BODIPY-tacn-Cu（Ⅱ）配合物31，它對同型半胱氨酸(Hcy)表現(xiàn)出優(yōu)異的選擇性，而GSH、Cys則影響甚微，因而是一個高選擇性的Hcy熒光探針。以內標法精確測定了健康人體血清中Hcy含量為(36.02±3.02)μmol·L-1，與ELISA 試劑盒檢測的結果基本一致((34.00±0.77)μmol·L-1)。 胱硫醚 β-合成酶(CBS)是生命體系中一種重要的調節(jié)Hcy代謝的酶，其活性與一系列和Hcy有關的疾病關系密切。在5-磷酸吡哆醛存在下，CBS可催化L-Hcy與等量的L-絲氨酸反應生成Cys。因此通過監(jiān)控Hcy的消耗量(或消耗速率)即可實現(xiàn)CBS活性的檢測。

王明慧等[54]合成了1個基于熒光素-cyclam-Cu(II)的“OFF-ON”型NO探針32。配合物32本身無熒光，當與NO反應后，在λex=465 nm激發(fā)下產生熒光，最大發(fā)射波長 λem=524 nm。 在 H2O2、ONOO-存在下，32對NO表現(xiàn)出良好的選擇性。隨后作者以NOC-18為NO釋放劑，在 4×10-5～14×10-5mol·L-1濃度范圍內，建立了NOC-18濃度與熒光強度之間的關系曲線，由此即可實現(xiàn)對NO的直接檢測。

Nagano小組[55]選取熒光素為熒光團，以酰胺鍵分別連接tacn、cyclen及cyclam并利用Cu2+為配位金屬離子制備得到了一系列熒光素-大環(huán)多胺-Cu（Ⅱ）配合物33～36。其中34對H2S表現(xiàn)出高選擇性和高靈敏性，ROS與活性氮(RNS)無響應，且由于其高穩(wěn)定性，高濃度GSH下也不影響對H2S的檢測。由于激發(fā)波長在可見光區(qū)，可用于細胞成像，通過以不同濃度的H2S孵育HeLa細胞，并對照20 min后的細胞內平均熒光強度，發(fā)現(xiàn)I20min/I0min隨Na2S孵育濃度增加而逐漸增大。除此之外，研究證實34還可廣泛用于檢測各種酶反應中產生的H2S，如3-巰基丙酮酸轉硫酶(3MST)，或來自3MST表達細胞的溶菌液及3-巰基丙酮酸等。該探針在胱硫醚β-合成酶(CBS)、胱硫醚 γ-裂解酶(CSE)與 3MST 等的激動劑與拮抗劑的高通量篩選領域頗具潛力，并有望在深入探索H2S的生理功能方面發(fā)揮重要價值。

楊國強等[56]通過三芳硼烷功能化，連接二苯胺與cyclen，成功制備了3個對Cu2+有響應并隨后可用于H2S檢測的熒光探針：37～39。37與38分別含有3個及2個cyclen單元而具有良好的水溶性，39只有1個cyclen而親水性較差。它們與Cu2+形成配合物后，在H2S誘導的有限聚集作用下，其光穩(wěn)定性均有所提高，熒光壽命也發(fā)生了改變。以38孵育NIH/3T3細胞僅僅5 min后，即可觀測到細胞內強烈的熒光，而以37和39孵育長達1 h后，仍然只看到十分微弱的熒光，這表明3個分子中，只有38具有良好的細胞膜透過性。細胞共定位實驗表明38能選擇性定位于細胞的線粒體。因此，在雙光子熒光顯微鏡及熒光壽命顯微鏡輔助下，38-Cu（Ⅱ）被成功用于NIH/3T3成纖維細胞中對H2S的熒光成像。

圖7 探針29～32的結構Fig.7 Structures of fluorescent probes 29～32

同樣是基于Cu（Ⅱ）-cyclen配合物，黃德建小組[57]以BODIPY為熒光團，設計合成了2個高選擇性和靈敏性的“OFF-ON”型H2S熒光探針40與41。它們的發(fā)射波長分別為765與680 nm，對H2S的檢測限均為80 nmol·L-1。40由于具有相對更長的發(fā)射波長(位于近紅外區(qū))，它成功用于對HEK293細胞中內源性H2S的熒光成像。并且通過皮下注射40與Na2S，還實現(xiàn)了小鼠體內H2S的監(jiān)測。41波長較短，則是用于檢測食物中H2S釋放或含量的理想武器。以Na2S或大蒜素 (有機多硫化物，H2S供體)孵育MCF-7細胞后，41也成功用于對H2S的熒光成像，且熒光強度與孵育濃度有良好的線性關系。

圖8 探針33～36的結構Fig.8 Structures of fluorescent probes 33～36

圖9 探針37～42的結構Fig.9 Structures of fluorescent probes 37～42

Wang等[58]以cyclen為銅離子螯合基團，蒽環(huán)為熒光團，制備了1個H2S熒光探針42。當向該探針溶液中加入NaHS后，CuS的生成使得熒光得以恢復。42對H2S除了優(yōu)良的選擇性，還表現(xiàn)出其它優(yōu)點，如較快的響應速度(小于1 min)，良好的可逆性，低的檢測限(205 nmol·L-1)等，最終該探針成功用于HeLa細胞及斑馬魚中H2S的熒光成像。

Mirra等[59]合成了1個苝環(huán)-cyclam-Cu（Ⅱ）的“籠”形配合物43-Cu（Ⅱ），該配合物也是1個具有較好選擇性的H2S探針，不足是其水溶性較差。

5 生物大分子探針

基于對大環(huán)多胺及其配合物的構建，利用金屬中心離子的正電荷與配位作用，制備能特異性識別生物大分子如DNA、RNA、蛋白質或酶等的小分子熒光探針也是分析化學家與生物學家的共同追求。Albelda等[60]以pyclen連接蒽環(huán)制備了化合物44，當向其溶液中分別加入單鏈多聚核苷酸如polyA、polyG、polyU和polyC，及雙鏈多聚核苷酸如polyA-polyU、poly(dAT)2和 poly(dGC)2時，紫外可見吸收光譜與熒光光譜均發(fā)生了變化且呈現(xiàn)有規(guī)律的差異。以熒光滴定為例，逐漸加入單鏈嘌呤型的polyA或polyG時，熒光先發(fā)生淬滅，并經歷1個最低點后又逐漸恢復，最終穩(wěn)定在較高的熒光強度(遠高于未滴定前的自由分子44的熒光強度)，同時最大發(fā)射峰的位置也紅移了8 nm。而富含嘧啶的polyU或polyC則對體系的熒光幾乎沒有影響。上述現(xiàn)象產生的可能原因是44僅能與富含嘌呤的polyA和polyG發(fā)生嵌插結合。對于雙鏈多聚核苷酸，加入約20倍的polyA-polyU時，熒光強度增加為原來的2倍，且最大發(fā)射波長紅移15 nm。同樣，加入poly(dAT)2后，熒光強度也逐漸增加并紅移，但達到平衡時poly(dAT)2的量僅為44的3倍。而當加入poly(dGC)2時，熒光則逐漸淬滅且無紅移現(xiàn)象發(fā)生。綜上可知，44是一個可用于識別不同單、雙鏈多聚核苷酸的熒光探針。

楊楚羅小組[61]以四苯乙烯-cyclen-Zn（Ⅱ）為載體制備了一個可識別特定DNA的熒光探針45。向該配合物的HEPES緩沖液中加入富含胸腺嘧啶的DNA時，其熒光顯著增強，而富含腺嘌呤、鳥嘌呤或胞嘧啶的DNA對熒光幾乎沒有影響。但由于隨機DNA的存在，使得其對富含胸腺嘧啶DNA的選擇性不甚理想。為了消除這一弊端，作者創(chuàng)造性地引入苯酚紅與配合物45組裝形成45-苯酚紅而將45的能量轉移至苯酚紅，消除了45本身所具有的背景熒光，如愿提高了其對富含胸腺嘧啶DNA的選擇性。45-苯酚紅也成功用于對多聚脫氧胸苷酸序列的檢測，檢測長度可短至2 nt。

圖10 探針43～46的結構Fig.10 Structures of fluorescent probes 43～46

Viehweger等[62]設計合成了一個基于tacn的雙模態(tài)表皮生長因子(EGF)探針46。46的結構主要包含4部分：(1)用于螯合64Cu（Ⅱ）的tacn及其支鏈部分；(2)EGF受體識別基團D4多肽[63]；(3)熒光團近紅外花青染料 sulfo-Cy5；(4) 連接基團 Cys-β-Ala-β-Ala。Tacn及其支鏈表現(xiàn)出對64Cu2+的快速動力學結合，在5 min內其放射化學產率超過95%，同時表現(xiàn)出高度的去金屬化惰性，這無疑表明其可以作為基于64Cu（Ⅱ）的體內正電子發(fā)射計算機斷層掃描(PET)造影劑。通過激光-熒光光譜法及免疫共沉淀法，研究了D4肽鏈與EGF受體的相互作用。進一步地，選取代表性的EGF受體表達細胞FaDu與A431，以放射性測量法確定了46與EGF受體的表觀解離常數(shù)Kd約為10 nmol·L-1，充分說明46與EGF受體形成了十分穩(wěn)定的復合物。因此，對于涉及EGF受體介導的一系列信號轉導過程，46能顯著抑制其中一些關鍵酪氨酸殘基的關于EGF誘導的自發(fā)磷酸化活性。綜上所述，雙模態(tài)探針46將有極大潛力成為構建EGF受體靶向的納米藥物平臺。

Nagano課題組[64]報道了1個可以用于比例型測量激酶A(PKA)活性的多肽熒光探針47-Cd（Ⅱ）。該探針由多肽底物通過香豆素生色團連接Cd（Ⅱ）-四氮環(huán)而組成，其中Cd（Ⅱ）-四氮環(huán)是磷酸基團識別位點。當多肽底物上的羥基磷酸化之后，Cd（Ⅱ）-四氮環(huán)即與帶負電的磷酸基團相互作用，導致激發(fā)波長發(fā)生紅移，由此前的360變?yōu)?10 nm。因此，利用這2個波長下的熒光強度比即可實現(xiàn)對PKA活性的測定。

Komiyama小組[65]報道了2個可用來測試酪氨酸激酶活性的熒光探針48和49。它們是2個雙核Tb3+配合物，可以選擇性地與磷酸化的酪氨酸結合而發(fā)出強烈的熒光(增強10倍)。這是苯環(huán)上的酚羥基磷酸化后，與雙核Tb3+中心發(fā)生結合，苯環(huán)吸收的能量可有效傳遞給金屬Tb3+中心所致。遺憾的是激發(fā)波長太短(λex=262 nm)，因而限制了其應用于生物體內。

另外，前文提及的楊國強等[66]制備的化合物38，除可用于Cu2+和H2S識別外，它還是一個優(yōu)異的比例型RNA熒光探針。當向38的水溶液中逐漸加入RNA(來源于圓酵母)時，熒光峰的位置逐漸藍移，由560 nm藍移至490 nm，紫外燈下可見其顏色逐漸由黃色變?yōu)樗{綠色。同樣條件下，加入DNA則藍移非常微弱。造成明顯差異的原因可能是雙螺旋結構的DNA各堿基對間已經形成了各種氫鍵，導致38與DNA間的氫鍵非常微弱。進一步的單鏈DNA熒光滴定實驗也證實了上述假設。在38良好的細胞膜透過性的前提下，用其孵育NIH/3T3細胞后，通過激光共聚焦熒光成像和雙通道信號輸出，證實了細胞核相比于細胞質具有更低的粘度。

6 其他分子離子探針

除了上述作用對象，大環(huán)多胺型熒光探針還在其它領域顯示出頑強的生命力，如納米熒光材料、細胞微環(huán)境檢測等。劉變化等[67]利用cycle與檸檬酸在微波輻射下制備得到了一種具有明亮藍光發(fā)射(λem=442 nm)的碳量子點熒光材料。在750 W的微波輻射條件下，整個過程包括縮合、交聯(lián)、碳化只需要5 min，同時其量子產率可達27.6%。在該碳量子點的表面聚集了密集的cyclen環(huán)，從而能與Eu3+結合而構建得到1個可用于四環(huán)素識別的比例型熒光探針50。在沒有四環(huán)素時，雖然結合了Eu3+，但此時50只有442 nm熒光發(fā)射峰。當加入四環(huán)素后，產生了新的Eu3+特征熒光發(fā)射峰，最強峰位于616 nm處，歸屬于5D0→7F2。隨著四環(huán)素濃度的增加，616 nm處峰強度增加明顯，而442 nm處的峰強度則略微下降。因此，以I616nm/I442nm對四環(huán)素的濃度作圖，即可實現(xiàn)對四環(huán)素的檢測。 在0～3.5 μg·mL-1的濃度區(qū)間內，線性關系良好(R2=0.998)，計算可得對四環(huán)素的檢測限為 5.2 ng·mL-1(11.7 nmol·L-1)。選擇性實驗表明，探針50只對四環(huán)素和土霉素有響應，而對其它抗生素如慶大霉素、羧芐青霉素、氯霉素、阿莫西林、司氟沙星等無響應，原因可能是只有四環(huán)素與土霉素具有相似的β二酮結構。此外，四環(huán)素的加入引起了顏色的逐漸變化，由藍到紅，作者成功利用手機及顏色識別app(ColorMeter RGB picker，White Marten)實現(xiàn)了對四環(huán)素的智能檢測，且線性關系良好(R2=0.98)。

Kimura等[68]對cyclen雙功能化，引入1個丹磺?；鰺晒鈭F，和3個甲胺酰甲基為金屬離子提供配位點，合成得到了對Y3+和La3+具有選擇性的熒光探針51。3個甲胺酰甲基與來源于丹磺酰基懸臂上NH去質子化的H形成了氫鍵，而導致51在激發(fā)態(tài)下具有強的熒光。加入Y3+或La3+后，甲胺酰甲基側鏈的配位使得相應的配合物十分穩(wěn)定，并允許來自丹磺?；鶓冶廴ベ|子化的信號傳遞，因而表現(xiàn)出明顯的熒光增強。在pH=7.4的HEPES緩沖溶液中，其它金屬離子如 Zn2+、Cd2+、Cu2+、Fe3+、Al3+、Au3+、Sc3+、Eu3+、Gd3+、Tb3+與 Yb3+等均對 51 的熒光無影響。由上可知，51將在Y3+和La3+的定性和定量測定方面具有重要價值，特別是對于90Y，作為臨床上放療的重要金屬元素之一，對Y3+的傳感必將有用武之地。

李贊等[69]以生物素-組氨酸與BODIPY-cyclen-Cu（Ⅱ）反應構建了1個可用于監(jiān)測細胞內乏氧情況的熒光探針52。其作用機理為：該探針本身由于Cu2+的順磁性淬滅作用而具有很弱的熒光(OFF態(tài))，由于結構中生物素的存在，它能富集于生物素受體過表達的癌細胞中，而乏氧癌細胞內NADH/NAD+較高，同時在一些生物還原酶的作用下，Cu2+被還原為 Cu+，并“釋放”了生物素-組氨酸-Cu（Ⅰ），BODIPY-cyclen則游離出來而表現(xiàn)出強烈的熒光。在高通量流式細胞術條件下，利用52測定了CoCl2處理過的癌細胞中的乏氧度，為(1.15±0.1)%pO2(RSD 8.7%)，WB定量分析也驗證了該結果。乏氧現(xiàn)象是目前已知的癌細胞的共性之一，該成果為設計新型靶向癌細胞并可用于研究癌細胞的乏氧機制及調節(jié)的探針提供了借鑒思路。

圖11 探針47～51的結構Fig.11 Structures of fluorescent probes 47～51

圖12 探針52和53的結構Fig.12 Structures of fluorescent probes 52 and 53

唐瑜課題組[70]以Eu3+為中央處理器(CPU)，鑲嵌于cyclen，并以三聯(lián)吡啶基團作為手臂(也是識別基團)制備了1個具有三重識別功能的分子機器人53：UV-Vis識別 Fe2+； 光致發(fā)光識別 Zn2+；MRI識別Mn2+。理論計算表明每個過渡金屬離子分別與2個探針分子形成1∶2的復合物。加入Fe2+，紫外-可見吸收光譜在569 nm處產生新的吸收峰，溶液顏色由無色變?yōu)榉凵嬎憧傻脤e2+的檢測限為0.36 μmol·L-1。光致發(fā)光光譜表明，僅僅在加入Zn2+時，Eu3+的特征熒光峰(617 nm，5D0→7F2)顯著增強，其對Zn2+的檢測限達 16 nmol·L-1。在 MRI中，沒有 Mn2+時，探針分子 53 的弛豫率為 1.06 mmol-1·L·s-1，加入0.5倍量的Mn2+后，弛豫率增加到5.56 mmol-1·L·s-1，以弛豫率對cMn2+作圖可求得探針53對Mn2+的檢測限為0.1 μmol·L-1。在上述3種識別模式的基礎上，作者還分別構建了與之對應的3種分子邏輯門：OR、INH及YES。另外，53還可用于實際生物樣品如人尿液中的Fe2+和Zn2+檢測，具有良好的回收率及精確度。

7 總結與展望

大環(huán)多胺是一類含有多個N原子而可以被修飾連接各種官能團的優(yōu)良陽離子配體，它能直接作為H+及金屬離子的識別基團，也可以與金屬離子作用后構建得到各種配合物，包括過渡金屬配合物與稀土配合物，并用于陰離子、生物活性小分子、生物大分子等的熒光檢測。因此，大環(huán)多胺在熒光探針的設計、合成與應用方面得到了廣泛關注，不斷涌現(xiàn)出優(yōu)秀的成果。盡管如此，但取得突破性進展和真正實現(xiàn)在醫(yī)學檢驗、生化分析、環(huán)境監(jiān)測等領域的商業(yè)化應用還有一定距離。主要原因可能有：(1)大環(huán)多胺的合成困難，路線較長而產率較低，加上后續(xù)的功能化與衍生化，成本高昂。以本課題組常用的pyclen為例，取2，6-吡啶二甲醇和二乙烯三胺為起始原料，需經過溴代、苯磺?；?、成環(huán)、脫除苯磺酰基等主要步驟，合成周期長，綜合產率約20%。最常見的cyclen等可以通過商業(yè)途徑購得，但價格昂貴。(2)探針本身的水溶性、親脂性，探針對目標底物的選擇性、靈敏性和作用后的熒光量子產率，以及對細胞的兼容性、透過性或組織的靶向性和熒光穿透深度等還達不到實際分析的要求。(3)現(xiàn)有檢測儀器或手段的局限性。綜合以上分析，要實現(xiàn)大環(huán)多胺型熒光探針的實際應用，需要有機化學、分析化學、生物化學、材料化學等學科的廣泛交叉和融合。實踐方面，優(yōu)化大環(huán)多胺的合成路線，開發(fā)近紅外甚至遠紅外區(qū)的熒光團，引入水溶性取代基，增加親脂性官能團、制成納米材料等值得重點關注。理論層面，如何提高量子產率、熒光壽命，如何從構效關系上闡述熒光傳感機理并指導和優(yōu)化熒光探針的設計，是未來研究者亟需破解的難題。此外，開發(fā)雙功能或多功能，如診療一體化熒光探針，光學-光聲等多模態(tài)成像，及光纖導入光動力治療等領域，都將迎來新的機遇和下一個春天。