金曄麗 潘海華 唐睿康＊，

(1浙江大學(xué)化學(xué)系，杭州 310027)

(2浙江大學(xué)求是高等研究院，杭州 310027)

0 引 言

生物硬組織如脊椎動(dòng)物的牙和骨，軟體動(dòng)物的外殼等具有分層有序的結(jié)構(gòu)特征、優(yōu)異的機(jī)械性能，在生物體內(nèi)發(fā)揮防護(hù)、支撐、運(yùn)動(dòng)和咀嚼攝食等重要生理功能。生物硬組織是通過生物礦化過程形成的。35億年前，生物礦化現(xiàn)象就普遍存在于動(dòng)物、植物以及微生物中[1]，經(jīng)過漫長的生物進(jìn)化，生物體可通過碳酸鈣、磷酸鈣等常見礦物晶體裝配出具有多層次有序結(jié)構(gòu)的牙齒、骨骼等硬組織。生物礦化學(xué)科就是研究生物分子和生物基質(zhì)如何調(diào)控礦物晶體的形成機(jī)制，包括生物礦物的組成、結(jié)構(gòu)和形成過程，生物礦化相關(guān)蛋白質(zhì)的功能，如蛋白質(zhì)對(duì)礦物晶體的作用、識(shí)別和對(duì)礦物結(jié)晶的調(diào)控等。

受生物礦化啟發(fā)，仿生礦化利用生物礦化原理在體外制備類似生物礦物的有機(jī)-無機(jī)復(fù)合結(jié)構(gòu)材料，或者模擬生物礦化環(huán)境，研究有機(jī)分子調(diào)控礦物結(jié)晶的機(jī)制。通過仿生礦化研究，人們已成功制備出類牙、類骨和類貝殼等有機(jī)-無機(jī)分層結(jié)構(gòu)材料，有助于高性能儲(chǔ)能、催化、分離以及高強(qiáng)增韌和硬組織替代材料的制備。

近年來，隨著我國人口老齡化和飲食結(jié)構(gòu)改變，有關(guān)牙和骨的健康問題日漸凸顯，比如齲齒問題、骨缺損、普遍存在于老年人群中的骨質(zhì)疏松問題，這些硬組織損害和疾病往往是不可逆的，需要硬組織替代生物材料的植入來輔助生物體的修復(fù)。仿生礦化研究為體內(nèi)外硬組織制備和修復(fù)提供思路，對(duì)于硬組織的修復(fù)具有十分重要的意義。我們將重點(diǎn)綜述生物礦化從機(jī)理到硬組織仿生修復(fù)的相關(guān)內(nèi)容，具體包括生物礦化的基本原理和主要礦物、無機(jī)礦物結(jié)晶調(diào)控原理和新認(rèn)識(shí)、與牙骨硬組織修復(fù)密切相關(guān)的膠原礦化機(jī)制和最新進(jìn)展、硬組織材料的多級(jí)結(jié)構(gòu)特征以及仿生礦化在硬組織修復(fù)中的前沿進(jìn)展。

1 生物礦化與仿生

生物體內(nèi)無機(jī)礦物在形成過程中受到了細(xì)胞、蛋白質(zhì)、有機(jī)基質(zhì)及無機(jī)離子的影響[2]，生物礦化的核心是在水介質(zhì)中和有機(jī)物的調(diào)控下，無機(jī)礦物的成核、生長和組裝的過程。除正常生物礦外，在一些代謝異常，炎癥和生物信號(hào)或激素失調(diào)等異常生理情況下也會(huì)在非硬組織部位產(chǎn)生礦化，稱為病理性礦化，如血管鈣化、腎結(jié)石、牙結(jié)石、軟骨鈣化、肌腱鈣化和基底神經(jīng)元鈣化等，這些病理性生物礦化過程對(duì)人體健康十分不利。無論是促進(jìn)硬組織修復(fù)還是消除病理性礦化都需要深入了解生物礦化過程。

根據(jù)生物礦化的途徑，可以分為生物誘導(dǎo)(biologically induced)礦化和生物控制(biologically controlled)礦化[3]。生物誘導(dǎo)礦化是指由于生物代謝過程引起細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的離子富集、pH變化等誘導(dǎo)礦物向沉淀反應(yīng)方向移動(dòng)的過程。在這一過程生物不主動(dòng)參與調(diào)控礦物的沉積和結(jié)構(gòu)，生物誘導(dǎo)礦化一般多見于藻類、細(xì)菌等低等生物[4]。大多數(shù)病理性礦化也是屬于生物誘導(dǎo)礦化。生物控制礦化是指生物對(duì)礦物顆粒的成核和生長起著直接的化學(xué)控制作用。在大多數(shù)情況下，這些礦物質(zhì)是在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞上的特定位置，在特定條件下直接合成的。生物控制礦化是生物體內(nèi)基因直接程序化控制礦化過程，并且生物體營造特殊礦化環(huán)境，使礦化過程與外界環(huán)境隔絕。在這種情況下產(chǎn)生的礦物顆粒往往是有序的晶體，其尺寸分布窄，顆粒形態(tài)具有特異性和一致性。貝殼、牙、骨的形成過程主要涉及到生物控制礦化。

根據(jù)生物礦化中的無機(jī)礦物類型，一般可將生物礦物分為兩大類：一類是鈣化礦物，一類是非鈣化礦物。鈣化礦物主要有磷酸鈣和碳酸鈣，在細(xì)胞代謝中起到了重要的作用[5]。非鈣化礦物主要有硅礦物和鐵礦物。

碳酸鈣礦物主要有6種不同的結(jié)構(gòu)[2]，分別是：方解石、文石、球霰石、一水合碳酸鈣(CaCO3·H2O)、六水合碳酸鈣(CaCO3·6H2O)和無定形碳酸鈣(amorphous calcium carbonate，ACC)。 最近 Zou 等[6]在研究ACC結(jié)晶過程中加入鎂離子，發(fā)現(xiàn)了具有單斜結(jié)構(gòu)的半水合碳酸鈣(CaCO3·1/2H2O)。生物體內(nèi)最廣泛存在的是方解石和文石[4]。方解石、文石、球霰石都是結(jié)晶態(tài)的碳酸鈣，而ACC是非晶態(tài)碳酸鈣，具有熱力學(xué)不穩(wěn)定性[7]。Addadi[8]課題組把ACC分成亞穩(wěn)態(tài)的含水ACC和不穩(wěn)定的脫水ACC。

磷酸鈣是哺乳動(dòng)物生物礦化研究的主要無機(jī)礦物，可以分為穩(wěn)定的磷酸鈣晶體礦物和不穩(wěn)定的無定形磷酸鈣礦物 (amorphous calcium phosphate，ACP)。生物體內(nèi)最穩(wěn)定和常見的磷酸鈣晶體是磷灰石，結(jié)構(gòu)上接近羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAP，Ca10(PO4)6(OH)2)，在生物體環(huán)境中，羥基可以被氟離子、氯離子、碳酸根等取代。生物體內(nèi)其他結(jié)晶態(tài)磷酸鈣還有磷酸氫鈣(dicalcium phosphate，DCP)、磷酸八鈣(octacalcium phosphate，OCP)和二水磷酸氫鈣(dicalcium phosphate dihydrate，DCPD)， 被認(rèn)為是骨形成的前體相[9]。一些病理性礦化組織中，如鈣化血管、腎結(jié)石和牙結(jié)石等，也含有不同晶型的磷酸鈣。

生物礦物與生物有機(jī)基質(zhì)復(fù)合在一起，具有精巧的多級(jí)分層結(jié)構(gòu)，賦予了其優(yōu)異的力學(xué)性能[10]，這啟發(fā)了科學(xué)家們模擬生物礦物的多級(jí)分層結(jié)構(gòu)，制備高性能材料。從不同角度模擬生物礦化，可以初步將仿生礦化研究分為過程仿生、功能仿生和結(jié)構(gòu)仿生。通過仿生礦化可以合成各種類貝殼[11]、類牙[12]和類骨[13]材料，具有優(yōu)異的力學(xué)性能或者特殊的功能，有望在臨床治療、軍事、建筑材料等方面發(fā)揮重要作用。

2 礦物的結(jié)晶

2.1 晶體的經(jīng)典成核和生長模型

礦物結(jié)晶是生物礦化的重要過程，一般的結(jié)晶過程包括晶體成核和晶體生長。根據(jù)經(jīng)典成核理論(classical nucleation theory，CNT)，成核是溶質(zhì)分子從溶液中凝聚形成穩(wěn)定晶核種子的過程。經(jīng)典成核理論認(rèn)為，在過飽和溶液晶體成核雖然是體相自由能(ΔGv)降低的過程，但隨著晶體-溶液界面形成，又增加了界面總自由能(ΔGs)。這二者與晶核尺寸相關(guān)，但由于冪次不同，這導(dǎo)致總自由能(ΔG)先增加后降低(圖1)[14]。當(dāng)晶核半徑(r)到達(dá)臨界晶核半徑(rc)后，此時(shí)晶體成核過程達(dá)到最大自由能(臨界能，Gcrit)。過飽和度和固-液界面能均會(huì)影響成核能壘，是結(jié)晶的熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)因素，但晶體-溶液界面能可在動(dòng)力學(xué)上調(diào)控成核能壘，對(duì)成核起關(guān)鍵的調(diào)控作用[15]。

圖1 均相成核自由能與尺寸關(guān)系圖[14]Fig.1 Relationship between free energy and size[14]

根據(jù)溶液含異質(zhì)的狀況，可以分為均相成核(homogeneous nucleation)和異相成核(heterogeneous nucleation)[16]。均相成核是指在沒有外界干擾的均勻單一體系中形成晶核的過程，該過程需要借助過飽和度的高化學(xué)位驅(qū)動(dòng)跨越成核能壘才形成穩(wěn)定晶核，也稱為臨界核[17]。而異相成核過程一般發(fā)生在不同的相表面、雜質(zhì)、晶界或者位錯(cuò)上[18]。對(duì)于異相成核體系，結(jié)晶相在基質(zhì)上形成時(shí)，增加了晶體-溶液界面，但同時(shí)減少了基質(zhì)-溶液界面，所以界面自由能項(xiàng)要采用有效界面能，與溶液-基質(zhì)-晶體三相界面的接觸角(θ)有關(guān)[14]。一般異相成核的有效界面能要小于晶體-溶液界面能，所以在溶液體系中，由于存在多種雜質(zhì)或表面，可大大降低成核能壘，異相成核相對(duì)更容易發(fā)生[19]。CNT有助于理解生物礦化過程，可以認(rèn)為生物礦化中的有機(jī)基質(zhì)是礦化過程的異相成核位點(diǎn)，可誘導(dǎo)礦物成核并控制礦物的物相、成核空間分布和晶體取向。

晶體成核后，在過飽和溶液中會(huì)繼續(xù)生長。對(duì)于傳統(tǒng)晶體生長的理解是晶體的離子單體首先擴(kuò)散至晶體表面，然后進(jìn)入晶格，實(shí)現(xiàn)在晶體表面生長[14]。隨著原位原子力顯微鏡技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)晶體主要是通過表面的臺(tái)階生長來實(shí)現(xiàn)晶體的長大[20]。晶體表面的平面區(qū)域被稱作臺(tái)階平臺(tái)(Terrace)，臺(tái)階平臺(tái)的凸起稱作臺(tái)階(Step)，臺(tái)階上還有許多折角，稱作扭折(Kink)。晶體生長過程中最可能的途徑是首先擴(kuò)散到晶面進(jìn)行吸附，然后擴(kuò)散到臺(tái)階，最后進(jìn)入扭折。相反，晶體溶解時(shí)，晶體組成的分子更容易從扭折處脫離[21]。晶體表面臺(tái)階的來源主要有2種，一種是螺旋位錯(cuò)，另一種是島狀臺(tái)階。與此相對(duì)應(yīng)的晶體生長模式為螺旋生長和島狀生長[22]。螺旋生長是晶格產(chǎn)生螺旋位錯(cuò)，并以此為中心產(chǎn)生連續(xù)的臺(tái)階而生長；島狀生長是在晶體平面上通過二維成核形成臺(tái)階源然后生長的方式[20]。螺旋臺(tái)階是由于晶體成核或生長過程中雜質(zhì)分子嵌入或分子錯(cuò)誤堆疊引起的，形成過程與過飽和度的關(guān)系不大；但島狀臺(tái)階的形成是二維成核，需要一定的過飽和度來克服成核能壘。所以在溶液過飽和度較低時(shí)，晶體一般按照螺旋生長方式進(jìn)行；而過飽和度較高時(shí)，按照島狀形式生長。

2.2 生物礦化和仿生礦化中的非經(jīng)典晶體成核與生長

生物礦物在結(jié)晶過程中受到多方面因素的影響，如蛋白質(zhì)、細(xì)胞、基因、有機(jī)分子和無機(jī)離子[23]，但生物礦化是一個(gè)復(fù)雜的礦物形成過程，一些礦化途徑不符合經(jīng)典結(jié)晶理論所假設(shè)的通過單體附著的晶體生長過程。在仿生礦化體系中發(fā)現(xiàn)了許多通過顆粒的附著(particle attachment，CPA)的非經(jīng)典結(jié)晶途徑，其中包括寡聚體、多離子復(fù)合物、液態(tài)前驅(qū)體、無定形顆粒、納米顆粒等結(jié)晶前驅(qū)體或生長單元[24]。在生物礦化體系中，也發(fā)現(xiàn)大量經(jīng)由亞穩(wěn)態(tài)的無定形相相變轉(zhuǎn)化為最終礦物結(jié)晶相的非經(jīng)典結(jié)晶過程。例如，海膽胚胎針狀體的礦化過程是通過聚集ACC前體的納米顆粒，然后轉(zhuǎn)化為方解石單晶[25]。類似的無定形到晶體的轉(zhuǎn)化途徑廣泛存在于各種生物礦物中，包括海膽的脊刺[26]和牙[27]、哺乳動(dòng)物的牙釉質(zhì)[28]、脊椎動(dòng)物的骨骼[29]、甲殼動(dòng)物的外骨骼[30]、環(huán)節(jié)動(dòng)物的石灰質(zhì)結(jié)石[31]和軟體動(dòng)物的幼體殼[32]。這種無定形相的相變過程受許多因素影響，如水和添加劑等。無定形相在水溶液中會(huì)很快轉(zhuǎn)變成結(jié)晶相，Ihli等[33]發(fā)現(xiàn)如果除去早期形成的 ACC的游離水，可以使其穩(wěn)定保存很久。無定形相的相變過程也會(huì)受添加劑的影響。Tao等[34]研究了球鼠婦(西瓜蟲)的換殼機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其外殼的相變過程是鎂離子和富天冬氨酸(Aspartic acid，Asp)共同作用的結(jié)果。鎂和富含Asp的化合物的協(xié)同作用可以穩(wěn)定ACC防止其相變，而球鼠婦換殼時(shí)，這2種添加劑的含量會(huì)減少。

仿生礦化體系發(fā)現(xiàn)了更豐富的非經(jīng)典結(jié)晶途徑，有助于全面理解生物礦化過程。Gower課題組[35]最早觀察到加入聚丙烯酸(polyacrylic acid，PAA)及聚天冬氨酸(polyaspartic acid，pAsp)后具有液態(tài)性質(zhì)的碳酸鈣液滴。Gebauer[36]等證明了碳酸鈣礦化初期含有穩(wěn)定的預(yù)成核離子簇，然后這個(gè)離子簇通過液-液相分離形成致密的納米級(jí)液滴，可繼續(xù)聚結(jié)形成無定形相。這種團(tuán)簇不僅存在于碳酸鈣礦化過程中，也存在于磷酸鈣結(jié)晶過程中。Dey等[37]通過冷凍電鏡技術(shù)在磷酸鈣結(jié)晶早期觀察到了松散且尺寸僅為1 nm左右的團(tuán)簇，他們認(rèn)為這種團(tuán)簇是ACP的前驅(qū)體。這個(gè)穩(wěn)定的團(tuán)簇不同于經(jīng)典成核理論預(yù)測(cè)的小于臨界尺寸的不穩(wěn)定離子聚集體，即使在不飽和的溶液中也能形成。由此提出的團(tuán)簇成核前體(Pre-nucleation clusters，PNCs)、液-液相分離(Liquidliquid phase separation)及液態(tài)前驅(qū)體假說(polymerinduced liquid precursors，PILP)是仿生礦化研究的重要發(fā)現(xiàn)，引起了生物礦化領(lǐng)域?qū)W者的廣泛關(guān)注。

3 膠原礦化

牙和骨中含有豐富的Ⅰ型膠原纖維，牙本質(zhì)修復(fù)和骨修復(fù)的一個(gè)重要過程就是膠原礦化，因此研究膠原礦化對(duì)于硬組織修復(fù)具有重要的臨床意義。膠原纖維具有天然帶狀結(jié)構(gòu)，是由于纖維在不同區(qū)域所含電荷密度分布不同造成的[38]。在骨膠原纖維內(nèi)分布的是沿膠原纖維方向生長的HAP晶體[39]。在膠原礦化的過程中，有機(jī)基質(zhì)對(duì)HAP晶體成核和生長的調(diào)控是膠原礦化研究的關(guān)鍵科學(xué)問題。在有機(jī)基質(zhì)中，除膠原蛋白外，還存在非膠原蛋白(noncollagen proteins，NCPs)，在調(diào)控和誘導(dǎo)膠原纖維礦化中起重要作用。常見的NCPs有牙本質(zhì)磷蛋白(dentin phosphoprotein，DPP)、成牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白(dentin matrix protein 1，DMP1)、骨涎蛋白(bone sialoprotein)、骨鈣素(osteocalcin)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogeneticprotein，BMP-2)和骨橋蛋白(osteopontin)等[40-41]。NCPs在體內(nèi)膠原礦化過程中起重要作用已經(jīng)得到了普遍的認(rèn)可[42]。Boskey[43]認(rèn)為NCPs可能為磷酸鈣礦化提供成核位點(diǎn)，也可能用于調(diào)控晶體的大小、取向或晶形，或用于提供鈣、磷離子。膠原礦化的仿生礦化研究中，常使用帶電的大分子有機(jī)物如聚天冬氨酸、聚丙烯酸代替NCPs質(zhì)來誘導(dǎo)和調(diào)控膠原礦化，然而膠原纖維內(nèi)實(shí)現(xiàn)礦化的原因至今存在很多爭(zhēng)議。

3.1 聚合物誘導(dǎo)的液態(tài)前驅(qū)體假說

Olszta等[10]提出了膠原在骨形成過程中是通過聚合物誘導(dǎo)的液態(tài)前驅(qū)體實(shí)現(xiàn)礦化的。PILP可以通過毛細(xì)作用吸入膠原纖維的間隙中，然后轉(zhuǎn)化為HAP。PILP工藝可以看作利用酸性聚合物來簡(jiǎn)單模擬NCPs功能誘導(dǎo)液-液相分離，抑制磷酸鈣結(jié)晶成核，形成亞穩(wěn)態(tài)PILP。PILP工藝首次實(shí)現(xiàn)膠原纖維內(nèi)穩(wěn)定可靠的有序礦化，是目前膠原礦化實(shí)驗(yàn)采用最多的工藝。但目前關(guān)于PILP的液態(tài)性仍缺乏相關(guān)直接證據(jù)，通過毛細(xì)作用吸入膠原纖維空隙的假說仍有待證明。

3.2 抑制劑排除假說

Toroian等[44]提出了抑制劑排除假說，考慮了膠原纖維內(nèi)空間可容納分子的大小對(duì)膠原礦化的可能影響。他們認(rèn)為小于6 kDa的分子和磷灰石晶體可以擴(kuò)散到纖維內(nèi)，從而導(dǎo)致礦化或直接影響礦化。雖然大于40 kDa的分子被排除在纖維外，但它們可以通過促進(jìn)磷灰石晶核形成，然后擴(kuò)散到纖維內(nèi)實(shí)現(xiàn)礦化，或者通過抑制纖維外溶液中的磷灰石晶核的生長來促進(jìn)纖維內(nèi)礦化(小于6 kDa的磷灰石晶體只有幾個(gè)晶胞大小，可以當(dāng)作晶核看待)。但假說中提及的磷灰石晶核進(jìn)入膠原纖維，以及蛋白分子可抑制溶液中的磷灰石晶核的繼續(xù)生長還有待實(shí)驗(yàn)證明。此外，膠原本身對(duì)礦化的直接調(diào)控作用也被忽略，不符合后來實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的膠原本身對(duì)礦化有調(diào)控作用[45-46]。

3.3 庫侖引力誘導(dǎo)礦化假說

Landis等[45]根據(jù)膠原分子的不同染色條帶(bands)的序列分析提出了膠原分子的富含電荷殘基的區(qū)域可能是礦化的成核位點(diǎn)。Nudelman等[47]結(jié)合冷凍電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，礦化首先發(fā)生在富含正電荷的a條帶(a-band)(靠近重疊區(qū)和空隙區(qū)的交界處)，支持庫侖引力誘導(dǎo)礦化假說。根據(jù)該假說可以解釋為何酸性聚合物穩(wěn)定的ACP優(yōu)先發(fā)生在a條帶。但該論文沒有對(duì)堿性聚合物穩(wěn)定ACP誘導(dǎo)膠原礦化的優(yōu)先發(fā)生區(qū)域進(jìn)行分析，庫侖引力誘導(dǎo)礦化假說還有待更系統(tǒng)的評(píng)估。

3.4 協(xié)同組裝礦化假說

Wang等[46]發(fā)現(xiàn)Ⅰ型膠原在體外可以在沒有添加任何有機(jī)大分子的情況下誘導(dǎo)HAP取向結(jié)晶。作者首先采用反滲透法得到高濃度的膠原蛋白基質(zhì)，然后通過調(diào)節(jié)pH誘導(dǎo)膠原蛋白自組裝成液晶態(tài)有序排列的膠原纖維凝膠。如果在高濃度酸性膠原溶液中引入高濃度的磷酸鈣酸性溶液，可以使膠原組裝過程和礦化過程協(xié)同進(jìn)行，得到有序礦化的膠原基質(zhì)。由于膠原協(xié)同組裝礦化的方法不含聚電解質(zhì)，充分支持了膠原本身對(duì)礦化的調(diào)控作用。該假說推測(cè)NCPs在體內(nèi)的可能作用是提高膠原基質(zhì)的局部離子濃度。由于形成液晶態(tài)膠原基質(zhì)和膠原礦化工藝的操作復(fù)雜性，加上膠原有序礦化的實(shí)現(xiàn)對(duì)膠原濃度、礦化液配方比較嚴(yán)苛，目前采用協(xié)同組裝礦化方法的研究并不多見。

3.5 滲透壓/電荷雙平衡誘導(dǎo)礦化假說

在仿生礦化領(lǐng)域中，大部分研究都是使用聚陰離子電解質(zhì)來模擬NCPs的作用。然而，Niu等[48]發(fā)現(xiàn)聚陽離子電解質(zhì)也能促進(jìn)膠原纖維內(nèi)礦化，對(duì)庫侖引力誘導(dǎo)礦化假說提出了質(zhì)疑并進(jìn)行了完善。作者發(fā)現(xiàn)，膠原纖維經(jīng)聚丙烯胺(poly allyamine hydrochloride，PAH)穩(wěn)定ACP礦化，未發(fā)現(xiàn)a條帶優(yōu)先礦化的跡象，并且重疊區(qū)和空隙區(qū)的電子密度類似，也就是未發(fā)現(xiàn)膠原纖維內(nèi)有優(yōu)先礦化的區(qū)域。作者還發(fā)現(xiàn)，膠原纖維經(jīng)聚陽離子電解質(zhì)修飾后，仍可通過聚正電解質(zhì)穩(wěn)定ACP礦化，卻不能被聚負(fù)電解質(zhì)穩(wěn)定ACP礦化。這些發(fā)現(xiàn)不符合庫侖引力誘導(dǎo)礦化假說的預(yù)判。由此，作者認(rèn)為膠原纖維內(nèi)外需維持Gibbs-Donnan平衡。溶液中添加聚電解質(zhì)時(shí)，纖維外的滲透壓更高，導(dǎo)致膠原纖維內(nèi)的水分子向外滲透，原子力顯微鏡原位觀測(cè)到膠原纖維的尺寸在變小。由于膠原纖維的粘彈性，因脫水壓縮的膠原纖維具有恢復(fù)原貌的內(nèi)驅(qū)力，作者由此猜想，含聚合物的礦化前驅(qū)體會(huì)因此進(jìn)入膠原纖維內(nèi)部，使壓縮的膠原纖維得到恢復(fù)。雖然基于Gibbs-Donnan平衡的滲透壓/電荷雙平衡假說豐富了膠原礦化中礦化前驅(qū)體進(jìn)入膠原機(jī)制的理解，但該假說最關(guān)鍵的部分(礦化前驅(qū)體進(jìn)入膠原纖維的驅(qū)動(dòng)力)屬于猜測(cè)，目前只有分子模擬的支持，需要更多實(shí)驗(yàn)來佐證。

4 牙和骨的多級(jí)結(jié)構(gòu)

4.1 骨的多級(jí)結(jié)構(gòu)

骨是有機(jī)-無機(jī)的復(fù)合材料，其中，以HAP和碳酸磷灰石為主的無機(jī)成分約占總質(zhì)量的65%，以Ⅰ型膠原為主的有機(jī)質(zhì)約占總質(zhì)量的34%[49]。Nair等[50]將骨分成六級(jí)結(jié)構(gòu)(圖2)，從微觀到宏觀分別是：第一級(jí)是磷灰石，膠原纖維(fibre)和其他微量成分；第二級(jí)是具有磷灰石/膠原纖維有序復(fù)合結(jié)構(gòu)的礦化膠原纖維；第三級(jí)是由膠原纖維有序排列形成的膠原纖維束(fibril)；第四級(jí)是骨中發(fā)現(xiàn)的4種膠原纖維束有序堆疊模型；第五級(jí)是哈弗氏管，即骨單位，第六級(jí)是整體骨。Weiner等[51]將整體骨進(jìn)一步分成皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨。Reznikov等[52-53]基于先進(jìn)的掃描透射電鏡的3D成像技術(shù)將骨的結(jié)構(gòu)分成十二級(jí)結(jié)構(gòu)。膠原纖維本身就具有多級(jí)結(jié)構(gòu)，膠原纖維由微纖維(micro-fibril)按準(zhǔn)六邊形錯(cuò)位堆疊形成，每個(gè)微纖維由3條鏈形成的三重螺旋結(jié)構(gòu)蛋白，而這些螺旋結(jié)構(gòu)又是由含G-X-Y的殘基序列單元重復(fù)形成。

圖2 骨的多級(jí)結(jié)構(gòu)[50]Fig.2 Multistage structure of bone[50]

4.2 牙的多級(jí)結(jié)構(gòu)

牙本質(zhì)中無機(jī)礦物質(zhì)約占總質(zhì)量的70%，以膠原蛋白為主的有機(jī)質(zhì)約占20%，其余是水[54]。在解剖學(xué)結(jié)構(gòu)上，牙本質(zhì)由牙本質(zhì)小管、成牙本質(zhì)細(xì)胞突起和細(xì)胞間質(zhì)組成，其中細(xì)胞間質(zhì)中的管間牙本質(zhì)富含網(wǎng)狀礦化膠原纖維，其結(jié)構(gòu)與骨礦化膠原纖維類似。牙本質(zhì)與牙釉質(zhì)之間有一層牙本質(zhì)-牙釉質(zhì)邊界(dentin-enamel boundary，DEB)，將二者牢固地結(jié)合在一起，其中同時(shí)含有膠原蛋白和牙釉蛋白[55]。和牙本質(zhì)相比，牙釉質(zhì)的有機(jī)物含量更低，由96%(w/w)的磷灰石，1%(w/w)的有機(jī)物和3%(w/w)的水組成[56]，其結(jié)構(gòu)也與牙本質(zhì)有很大的不同。Cui等[57]將牙釉質(zhì)分為7級(jí)結(jié)構(gòu)(圖3)，牙釉質(zhì)的主要成分是六方羥基磷灰石晶體，其晶胞單元是最基本結(jié)構(gòu)(1級(jí))。磷灰石晶胞按晶體c軸方向擇優(yōu)堆疊形成磷灰石納米纖維(直徑約為30 nm)(2級(jí))。由磷灰石晶體納米纖維聚集組裝而成晶體微纖維(直徑約為100 nm)(3級(jí))。微纖維繼續(xù)組裝形成更粗的晶體纖維束(直徑約為800 nm)(4級(jí))。晶體纖維束按不同方向擇優(yōu)排列，垂直于牙釉面的纖維束組成釉柱，按一定夾角傾斜的纖維束組成釉柱間質(zhì)，釉柱與釉柱間質(zhì)的結(jié)構(gòu)不連續(xù)處為釉質(zhì)鞘。釉柱、釉柱間質(zhì)、釉質(zhì)鞘形成連續(xù)體，呈鎖孔或鱗片狀結(jié)構(gòu)(直徑為6～8 μm)(5級(jí))。鎖孔連續(xù)體緊密排列，形成魚鱗狀斑圖的釉柱群(6級(jí))。其中牙釉外層的釉柱群呈放射狀排列，牙釉內(nèi)部的釉柱之間交錯(cuò)編織，呈交叉式排列，釉柱以不同排列方式最終構(gòu)成覆蓋在整個(gè)牙冠表面的釉質(zhì)層(7 級(jí))。

圖3 從納米級(jí)到毫米級(jí)的牙釉質(zhì)結(jié)構(gòu)示意圖(未按比例)[57]Fig.3 Schematic illustration(not drawn to scale)of the hierarchical assembly of enamel structure，from the millimetre to the nanometre scale[57]

5 硬組織修復(fù)

硬組織是生物體通過礦化形成的組織，如脊椎動(dòng)物的牙和骨、軟體動(dòng)物的外殼和棘皮動(dòng)物外骨骼等，對(duì)生物體起重要的保護(hù)、支撐、運(yùn)動(dòng)和攝食等功能。隨著人口的老齡化，由硬組織老化或損傷引起的健康問題，如牙齲、牙缺損、骨質(zhì)疏松和骨折等，會(huì)嚴(yán)重影響生存質(zhì)量，甚至威脅生命。研究硬組織修復(fù)，對(duì)于幫助人體重建硬組織生理功能起著重要的作用。本節(jié)將主要介紹牙釉質(zhì)的體外修復(fù)，牙本質(zhì)再礦化修復(fù)和骨修復(fù)方面的研究進(jìn)展。

5.1 牙釉質(zhì)的修復(fù)

齲齒是一種生物膜介導(dǎo)的、糖代謝驅(qū)動(dòng)的、多因素(基因，菌群口腔環(huán)境，飲食衛(wèi)生習(xí)慣等)誘發(fā)的進(jìn)行性不可逆疾病[58]。例如，口腔中發(fā)酵的碳水化合物和一些細(xì)菌的酸性代謝產(chǎn)物會(huì)對(duì)牙釉質(zhì)產(chǎn)生直接腐蝕[59]。在沒有細(xì)菌參與下，長期飲食酸性物質(zhì)會(huì)腐蝕牙齒，加速磨損[60]。牙齒處于連續(xù)的脫礦和再礦化平衡，如果平衡被打斷，脫礦大于再礦化會(huì)導(dǎo)致牙釉質(zhì)本體受到侵蝕，引起牙釉質(zhì)有序結(jié)構(gòu)破壞，機(jī)械性能下降，進(jìn)而導(dǎo)致磨損加速，齲壞將進(jìn)一步向內(nèi)推進(jìn)[61]。牙釉質(zhì)是牙齒最重要的第一保護(hù)層，齲齒的原發(fā)部位往往起始于釉質(zhì)層。因此牙釉質(zhì)的再礦化對(duì)于牙齒初齲的修復(fù)具有重大意義。

目前臨床醫(yī)學(xué)上修復(fù)齲齒的手段主要是通過人工材料修補(bǔ)，所采用的齲齒修復(fù)材料主要有銀汞合金和樹脂材料等。銀汞合金修復(fù)齲齒操作簡(jiǎn)單、價(jià)格經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，但存在美觀性欠佳、潛在的汞毒性以及重金屬污染等問題，目前已逐步被樹脂材料取代。樹脂材料經(jīng)調(diào)色可減小與殘留牙體的色差，但樹脂材料機(jī)械強(qiáng)度較差，且具有固化收縮性，修復(fù)后與牙體存在明顯的間隙，易發(fā)生界面材料的生物降解，長期有效性不佳[62]。這些人工材料無論是從材質(zhì)，結(jié)構(gòu)還是性能上都與天然牙體有很大的差距。因此利用仿生礦化手段，在受損牙體表面再礦化一層與天然牙齒結(jié)構(gòu)相近的材料，對(duì)于修復(fù)牙齲具有重要的臨床意義。

目前，牙釉質(zhì)的修復(fù)和再礦化的仿生礦化實(shí)驗(yàn)主要是在體外模擬口腔或體液環(huán)境，對(duì)酸蝕后的牙釉質(zhì)進(jìn)行修復(fù)。通過模擬牙釉蛋白和其他礦化功能蛋白促進(jìn)牙釉質(zhì)形成的功能，仿生礦化實(shí)驗(yàn)中常加入礦化功能蛋白或其模擬物(多肽，雙親分子或高分子等)。Fan等[63]將水凝膠在添加了牙釉蛋白和氟離子的人工唾液中培養(yǎng)，然后對(duì)酸蝕后的牙釉質(zhì)表面進(jìn)行再礦化修復(fù)，發(fā)現(xiàn)牙釉質(zhì)表面形成了含有針狀氟化羥基磷灰石晶體的礦物層。由于礦化功能蛋白獲取困難，研究者們發(fā)現(xiàn)一些多肽殘基也具有類似功能蛋白的活性。Kirkham等[64]發(fā)現(xiàn)一種可自組裝成纖維的酸性多肽(P11-4)可以促進(jìn)牙釉質(zhì)的再礦化和抑制脫礦。除多肽外，一些合成高分子也具有促進(jìn)礦化功能，其中富含電荷基團(tuán)和衍生化能力的聚酰胺-胺型樹枝狀高分子(PAMAM)吸引了研究者的廣泛關(guān)注。Yang等[65]合成了天冬氨酸和硬脂酸修飾的PAMAM雙親分子，發(fā)現(xiàn)具有類牙釉蛋白的組裝功能，并可誘導(dǎo)磷灰石取向生長。Wu等[66]合成了阿倫磷酸(ALN)改性的羧酸化聚酰胺-胺樹枝狀高分子，發(fā)現(xiàn)其具有原位誘導(dǎo)牙釉質(zhì)再礦化的功能，并對(duì)磷灰石有強(qiáng)特異吸附和誘導(dǎo)再礦化的功能，礦化生成的棒狀磷灰石具有與人牙釉質(zhì)類似的納米結(jié)構(gòu)。

圖4 復(fù)制復(fù)雜的牙釉質(zhì)結(jié)構(gòu):(A)酸蝕和修復(fù)后的牙釉質(zhì)的掃描電鏡圖;(B)修復(fù)后牙釉質(zhì)的三維原子力顯微鏡圖;(C)(A)中紅色圓圈的高倍掃描電鏡圖像;(D)修復(fù)后的牙釉質(zhì)的橫截面圖，牙釉質(zhì)棒和牙釉質(zhì)棒之間都修復(fù)了;R和IR分別代表牙釉柱和釉柱間質(zhì);(E，F(xiàn))具有不同方向的可以修復(fù)的牙釉質(zhì)棒[71]Fig.4 Replication of the complicated structure of enamel:(A)Scanning electron microscope image showing both acid-etched enamel and repaired enamel;(B)A three-dimensional atomic force microscope image of repaired enamel;(C)Highmagnification scanning electron microscope image of the red circle in(A);(D)Cross-sectional view of final repaired enamel，where both enamel rods and inter-rods were repaired，R and IR represent for enamel rod and inter-rod，respectively;(E，F(xiàn))Enamel rods with different orientations which can be repaired[71]

上述牙釉質(zhì)再礦化過程的礦物來源是礦化液中的鈣磷離子，但在實(shí)際牙釉質(zhì)修復(fù)時(shí)，不可能在口腔中引入大量的鈣磷液。針對(duì)該難題，仿生礦化同樣從生物礦化過程找到了靈感：生物礦化不是從溶液中的鈣磷離子直接礦化，而是將ACP作為牙和骨礦化的前驅(qū)體。因此，有一些仿生礦化研究工作將ACP納米顆粒作為鈣磷來源用于牙釉質(zhì)的修復(fù)。然而，ACP是磷酸鈣的亞穩(wěn)態(tài)，在溶液中很容易發(fā)生相變，不易保存，極大地限制了它的臨床應(yīng)用。為此，研究者通過添加穩(wěn)定劑穩(wěn)定ACP復(fù)合物應(yīng)用于牙釉質(zhì)的修復(fù)。Reynolds等[67]通過酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptides，CPP)穩(wěn)定 ACP，實(shí)現(xiàn)了齲壞釉質(zhì)表層的再礦化。Zhang等[68]發(fā)現(xiàn)磷酸化殼聚糖-ACP處理釉質(zhì)可以快速修復(fù)釉質(zhì)層。除ACP外，HAP納米顆粒也可用于牙釉質(zhì)的修復(fù)的裝配單元。Li等[69]合成了20 nm的納米羥基磷灰石顆粒，該尺寸與牙釉質(zhì)的基本組成類似，可以很好地吸附在脫礦的牙釉質(zhì)表面，形成致密礦化層，恢復(fù)了酸蝕牙齲的機(jī)械性能。雖然合成的納米羥基磷灰石顆?？梢孕迯?fù)牙釉質(zhì)，但沒有實(shí)現(xiàn)牙釉質(zhì)表面的磷灰石取向排列結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，Li等[70]利用谷氨酸調(diào)控20 nm磷酸鈣顆粒組裝，脫礦的牙釉質(zhì)表面在修復(fù)后得到了具有良好機(jī)械性能的類牙釉修復(fù)層，并且在礦化修復(fù)層可以看到納米磷灰石晶體的取向排列和牙釉質(zhì)的“魚鱗”釉柱群特征。

雖然以上仿生修復(fù)手段可以得到和牙釉質(zhì)的機(jī)械性能相似的修復(fù)層，但是要得到具有天然層級(jí)結(jié)構(gòu)的牙釉質(zhì)再礦化層仍是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。近期，Shao等[71]基于納米簇材料為生物礦化最基本單元的認(rèn)識(shí)，以及生物礦化中大量存在的晶體/無定形礦物緊密結(jié)合礦化前沿界面，大規(guī)模制備了磷酸鈣寡聚體，并以此作為牙釉質(zhì)再礦化的裝配單元。研究發(fā)現(xiàn)，將該材料直接滴在酸蝕的牙釉質(zhì)上可形成致密ACP層，模仿生物礦化前沿，可以誘導(dǎo)牙釉質(zhì)上棒狀磷灰石的外延晶體生長，成功使牙釉質(zhì)長出了2～10 μm的再礦化釉質(zhì)層。修復(fù)層與原始釉質(zhì)層沒有明顯的界面和縫隙，實(shí)現(xiàn)了牙釉質(zhì)晶格連續(xù)修復(fù)，并且牙釉質(zhì)的多級(jí)結(jié)構(gòu)得以保留。修復(fù)后機(jī)械性能與天然牙釉質(zhì)相同。由于是晶格連續(xù)的外延生長修復(fù)，磷酸鈣寡聚體可以實(shí)現(xiàn)不同取向的牙釉柱和釉柱間質(zhì)的再生，以及大尺度的全牙釉質(zhì)層修復(fù)，這在仿生礦化修復(fù)牙釉質(zhì)領(lǐng)域取得了重大突破，有望將牙齒修復(fù)從“填料填補(bǔ)”帶入“仿生再生”時(shí)代。

5.2 牙本質(zhì)的修復(fù)

牙釉質(zhì)內(nèi)部是牙本質(zhì)，他們通過DEB緊密相連。牙齲進(jìn)展突破牙釉質(zhì)層后，牙本質(zhì)將直接裸露在口腔環(huán)境。同時(shí)，牙本質(zhì)暴露后，細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物、口腔殘留物質(zhì)等將侵入并擴(kuò)散到牙本質(zhì)內(nèi)部，并且難以通過自行清除或沖刷清除，齲病發(fā)展將大大加速。該階段可能伴隨著牙齒劇烈疼痛，患者往往在這個(gè)階段就醫(yī)，急需對(duì)齲壞部位進(jìn)行修補(bǔ)和封閉。

牙本質(zhì)具有和牙釉質(zhì)截然不同的組成和結(jié)構(gòu)，它的主體部分是礦化膠原網(wǎng)絡(luò)。在傳統(tǒng)牙修復(fù)過程中，一般將齲壞部位挖除后，通過酸蝕對(duì)周圍牙本質(zhì)膠原進(jìn)行脫礦以促進(jìn)粘結(jié)劑滲入膠原纖維網(wǎng)絡(luò)，增加粘結(jié)劑/樹脂與牙本質(zhì)之間的鉚合作用，增強(qiáng)粘結(jié)強(qiáng)度。但粘結(jié)劑/樹脂很難進(jìn)入膠原纖維內(nèi)部并且將膠原纖維緊密封閉。牙本質(zhì)膠原纖維與粘結(jié)劑之間具有縫隙，脫礦膠原纖維在膠原酶的作用下會(huì)自然降解，粘結(jié)劑/樹脂與牙本質(zhì)之間的鉚合作用將大大降低，因此，粘結(jié)的長期有效性受到嚴(yán)重影響。針對(duì)該問題，研究者們探索了通過仿生礦化對(duì)牙本質(zhì)膠原進(jìn)行再礦化以重構(gòu)牙本質(zhì)和防止膠原纖維的生物降解。

在牙本質(zhì)礦化中，NCPs起到關(guān)鍵作用。Gower課題組通過使用pAsp、PAA等功能聚陰離子電解質(zhì)來模擬NCPs，在膠原基質(zhì)礦化方面取得了很多突破性成果。Olszta等[10]通過基于PAA首次實(shí)現(xiàn)了膠原纖維內(nèi)部礦化(碳酸鈣)，并提出PILP促進(jìn)膠原礦化的假說。后來，又通過pAsp陰離子多肽模擬NCPs，基于PILP技術(shù)實(shí)現(xiàn)了膠原纖維的磷酸鈣有序礦化[72]。在牙本質(zhì)形成過程中，堿性磷酸酶是反映牙礦化生物活性的重要標(biāo)志物。受此啟發(fā)，Jee等[73]通過堿性磷酸酶來提供緩慢釋放的無機(jī)磷酸鹽離子，模擬了牙礦化的生物調(diào)控過程，結(jié)合PILP技術(shù)，實(shí)現(xiàn)膠原海綿礦化。PILP技術(shù)還可以實(shí)現(xiàn)天然膠原基質(zhì)的礦化。Jee等[74]發(fā)現(xiàn)通過從火雞肌腱中獲得的生物膠原支架也可以通過PILP過程礦化。此外，他們還發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白(osteopontin，OPN)交聯(lián)膠原纖維可以促進(jìn)膠原的纖維內(nèi)礦化[75]，進(jìn)一步理解了NCPs調(diào)控礦化的途徑。

早期的實(shí)驗(yàn)中，Gower課題組發(fā)現(xiàn)PAA難以實(shí)現(xiàn)膠原纖維的礦化，轉(zhuǎn)而采用pAsp。我們發(fā)現(xiàn)聚電解質(zhì)的濃度也是影響牙本質(zhì)再礦化的關(guān)鍵參數(shù)。Wang 等[76]發(fā)現(xiàn)低濃度的 PAA(100 mg·mL-1)不能保持PILP的流動(dòng)性，因此發(fā)生的是纖維外礦化。相反，高濃度的 PAA(1 000 mg·mL-1)可以穩(wěn)定 ACP，防止其相變，纖維可以內(nèi)礦化但是其礦化時(shí)間會(huì)延長，而300～500 mg·mL-1是個(gè)合適的濃度范圍。

通過PILP可實(shí)現(xiàn)牙本質(zhì)膠原的再礦化，但礦化修復(fù)時(shí)間往往以周為單位，需要2周甚至1～2個(gè)月的時(shí)間，這對(duì)于通過仿生礦化修復(fù)牙本質(zhì)的臨床應(yīng)用而言是個(gè)極大的限制因素，因此找到快速礦化的方法具有重要的意義。唐?？嫡n題組與牙醫(yī)研究團(tuán)隊(duì)合作，對(duì)該問題進(jìn)行了持續(xù)的探索。Chen等[77]研究發(fā)現(xiàn)牙本質(zhì)膠原蛋白和戊二醛交聯(lián)能促進(jìn)牙本質(zhì)的仿生再礦化，提高牙本質(zhì)的力學(xué)性能和生物穩(wěn)定性。戊二醛預(yù)處理后再礦化時(shí)間從7 d縮短到2 d。戊二醛等雖然可以促進(jìn)膠原纖維礦化，但是其對(duì)生物體存在一定的毒性。我們發(fā)現(xiàn)生物硬組織中含有極高水平的檸檬酸鹽，受此啟發(fā)，Shao等[78]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過檸檬酸預(yù)處理膠原可以縮短膠原纖維的礦化時(shí)間和顯著提高膠原纖維的礦化度，并從礦化前驅(qū)體與膠原纖維的界面浸潤角度進(jìn)行了解釋。從圖5中可以看到膠原纖維上吸附的檸檬酸可以顯著降低膠原纖維與ACP前體之間的界面能，以增強(qiáng)它們?cè)谏锏V化早期的潤濕效果，從而促進(jìn)纖維內(nèi)的礦物形成。除檸檬酸外，硫酸軟骨素也廣泛存在于礦化組織中，在礦化過程中起著重要作用。He等[79]通過隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡發(fā)現(xiàn)了固定化的硫酸軟骨素提供了磷酸鈣的特異性成核位點(diǎn)，加速磷酸鈣成核，并通過積累膠原纖維中的鈣離子而顯著促進(jìn)膠原礦化，使礦化時(shí)間縮短到2 d。

圖5 (a～d)檸檬酸預(yù)處理/未檸檬酸預(yù)處理的膠原蛋白原纖維上沉積的ACP的TEM圖;比例尺:50 nm;(a)未處理膠原纖維，θ=106.7°±8.7°(平均值±SD，n=30);(b)膠原原纖維(用 2.5×10-2mol·L-1檸檬酸鹽預(yù)處理)，θ=83.3°±4.3°(n=30);(c)膠原原纖維(用 5×10-2mol·L-1檸檬酸鹽預(yù)處理)，θ=66.8°±7.7°(n=30);(d)由于 ACP 潤濕(θ=0°)而導(dǎo)致的溶脹的 C 膠原原纖維(用 0.1 mol·L-1檸檬酸鹽預(yù)處理)((a～d)插圖:SAED模式表示非晶相);(e)膠原纖維的礦物質(zhì)含量(N:N-膠原纖維;C25，C50，C100:分別用檸檬酸2.5×10-2、5×10-2和 0.1 mol·L-1預(yù)處理的膠原原纖維;B:豬骨);(f)不含和(g)含 0.1 mol·L-1檸檬酸鹽預(yù)處理的再礦化牙本質(zhì)超薄切片的TEM圖(虛線是和礦化牙本質(zhì)(R)/完整天然牙本質(zhì)(N)的邊界，插圖為與HAP模式匹配的SAED模式，比例尺為1 μm)[78]Fig.5 (a～d)Representative TEM images of the deposited ACP on the collagen fibrils with/without citrate pretreatment;scale bar:50 nm;(a)N-collagen fibrils，θ=106.7°±8.7°(mean±SD，n=30);(b)C-collagen fibrils(pretreated with 2.5×10-2mol·L-1citrate)，θ=83.3°±4.3°(n=30);(c)C-collagen fibrils(pretreated with 5×10-2mol·L-1citrate)，θ=66.8°±7.7°(n=30);(d)Swelled C-collagen fibrils(pretreated with 0.1 mol·L-1citrate)as the result of ACP wetting(θ=0°).Insets of(a～d):SAED patterns indicate the amorphous phase;(e)Mineral contents of collagen fibrils(N:N-collagen fibrils;C25，C50，C100:collagen fibrils pretreated by 2.5×10-2，5×10-2，and 0.1 mol·L-1 citrate，respectively;B:pig bone);TEM image of ultrathin section of remineralized dentin without citrate pretreatment(f)and that with 0.1 mol·L-1citrate pretreatment(g)dotted lines to guide the eye for the boundary of resin/collagen and remineralized dentin(R)/intact natural dentin(N)(Insets:SAED patterns matching that of HAP;Scale bar:1 μm)[78]

樹脂粘接劑修復(fù)齲齒是臨床的成熟技術(shù)，但自酸蝕粘結(jié)劑使膠原脫礦，會(huì)導(dǎo)致膠原纖維的酶促降解，影響粘結(jié)的長期有效性。研究者通過開發(fā)可礦化樹脂粘接劑了解決這一難題。Gu等[80]用樹脂粘接劑作為載體，在波特蘭水泥模擬體液系統(tǒng)中成功再礦化了牙本質(zhì)。但考慮粘結(jié)劑的臨床實(shí)際流程，粘結(jié)劑固化封閉牙本質(zhì)后，與口腔環(huán)境進(jìn)行了隔斷，牙本質(zhì)難以持續(xù)從體液中獲得低濃度鈣磷離子來再礦化牙本質(zhì)。基于無定形為前驅(qū)相的生物礦化過程給該課題帶來了啟發(fā)，通過在粘結(jié)劑體系引入無定形前驅(qū)體，降低了牙本質(zhì)礦化對(duì)溶液離子來源的依賴性。Wu等[81]合成了pAsp穩(wěn)定的Si-ACP粒子，以樹脂粘結(jié)體為載體，負(fù)載Si-ACP顆粒，關(guān)照固化后，依然可以實(shí)現(xiàn)Ⅰ型膠原的再礦化和脫礦牙本質(zhì)的再礦化。Tay課題組[82]采用藥物載體的輸送的方法來引入礦化前驅(qū)體，他們通過多孔介孔二氧化硅來包裹和傳遞PILP，成功礦化了膠原纖維。這些前瞻性研究為膠原仿生礦化到牙本質(zhì)修復(fù)的臨床應(yīng)用之間架起了橋梁，對(duì)未來牙本質(zhì)修復(fù)具有重要的意義。

5.3 骨修復(fù)

不同于牙，骨在人體具有自修復(fù)功能(骨重構(gòu))。但在一些情況下，骨不能實(shí)現(xiàn)完全自修復(fù)，比如骨內(nèi)富集或殘留毒素引起的骨髓壞死或干細(xì)胞分化干擾，大尺寸的骨缺損，骨質(zhì)疏松等。目前骨修復(fù)的主要研究對(duì)象包括骨缺損以及骨質(zhì)疏松。骨缺損是指由創(chuàng)傷、腫瘤或感染引起的骨粉碎或者降解。如果不進(jìn)行干預(yù)，骨缺損是無法愈合的[83]。骨質(zhì)疏松是由于骨生長和骨吸收失衡造成的。懷孕、哺乳期、絕經(jīng)、老齡化以及激素水平失調(diào)都會(huì)引起骨質(zhì)疏松。骨缺損不愈和骨質(zhì)疏松都可引起慢性疼痛、行動(dòng)能力下降、抑郁、睡眠喪失等[84]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存能力，需要通過骨修復(fù)來幫助骨重建。

骨修復(fù)的最佳方法是自體骨移植，但存在二次手術(shù)和來源有限的風(fēng)險(xiǎn)和限制。采用異體骨移植存在排異反應(yīng)和病毒/細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)。所以骨修復(fù)材料的研究引起了廣泛關(guān)注。目前，臨床上采用較多的骨修復(fù)材料主要是組織耐受性好和可生物降解的材料[3]。我們主要介紹與仿生礦化密切相關(guān)的磷酸鈣材料的生物效應(yīng)，骨水泥材料、有機(jī)-無機(jī)復(fù)合材料、骨粘膠材料以及一些“軟的”和“活的”的材料以及仿生礦化骨再生研究。

HAP除作為骨礦物增強(qiáng)機(jī)械性能外，還被認(rèn)為具有一定的生物活性，具有誘導(dǎo)骨形成能力。唐?？嫡n題組對(duì)磷酸鈣礦物的骨誘導(dǎo)能力開展了細(xì)胞學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)不同尺寸和形貌的HAP在修復(fù)骨時(shí)具有不同的調(diào)節(jié)作用。Cai等[85]制備了不同尺寸的HAP納米顆粒，并研究了它們對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSCs)和骨肉瘤細(xì)胞(U2OS)增殖的影響，發(fā)現(xiàn)HAP納米顆粒可以促進(jìn)MSCs的增殖，同時(shí)抑制了U2OS的生長。上述納米級(jí)棒狀HAP雖然可以促進(jìn)骨干細(xì)胞生長，但形貌不同于骨中的片狀磷灰石，其中大量暴露的是(100)晶面。為了探究類磷灰石的生物學(xué)效應(yīng)，Liu等[86]合成了類骨片狀HAP(p-HAP)和棒狀HAP，研究它們的細(xì)胞生物活性和對(duì)骨生成的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)與棒狀HAP相比，具有(100)面的片狀HAP更顯著促進(jìn)了間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的細(xì)胞活力和成骨分化。這些研究對(duì)于全面理解骨中的納米磷灰石的生物學(xué)效應(yīng)具有重要的參考意義。

基于磷酸鈣礦物的磷酸鈣骨水泥材料具有良好的降解性和骨誘導(dǎo)能力，是骨修復(fù)的重要替代材料，但存在機(jī)械性能不足的問題。Moussa等[87]發(fā)現(xiàn)在制備磷酸鈣生物陶瓷中引入左旋酒石酸可以減少晶體尺寸，增強(qiáng)生物陶瓷的機(jī)械性能，對(duì)骨修復(fù)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

除無機(jī)礦物作為主要成分外，骨中還存在一定有機(jī)物質(zhì)，是有機(jī)-無機(jī)復(fù)合材料。模仿骨的有機(jī)-無機(jī)復(fù)合材料也是修復(fù)骨缺損的理想材料。Li等[88]合成了聚酰胺6(PA6)/HAP納米復(fù)合材料，結(jié)合了HAP的生物活性、生物相容性和PA6優(yōu)異的機(jī)械增強(qiáng)增韌性能的納米復(fù)合材料，在化學(xué)和機(jī)械性能上接近天然骨。除聚酰胺、聚乳酸等人工合成高分子外，一些生物相容性好、機(jī)械性能優(yōu)良的天然生物高分子，如纖維素、絲素等，也得到廣泛關(guān)注，可用于制備良好的骨修復(fù)材料。例如細(xì)菌纖維素(bacterial cellulose，BC)具有良好的生物相容性和濕態(tài)機(jī)械性能，Hu等[89]制備了BC/HAP復(fù)合材料，實(shí)現(xiàn)了骨缺損的修復(fù)。

上述骨植入材料雖然具有足夠的強(qiáng)度，但與原骨骼系統(tǒng)的對(duì)接還需要依靠骨釘來鉚定，骨愈合后需要二次手術(shù)取出。受沙堡蠕蟲膠水下粘結(jié)性啟發(fā)，Kirillova等[90]制備了基于磷酸四鈣(tetracalcium phosphate)和磷酸絲氨酸復(fù)合的一種新型骨粘合劑，可在潮濕的環(huán)境中實(shí)現(xiàn)骨和骨的高粘合強(qiáng)度，可在幾分鐘內(nèi)解決骨折修復(fù)問題，并可降解吸收，具有很好的骨整合能力。

硬的骨修復(fù)材料具有很好的機(jī)械支撐作用，但骨形成的早期是一些“軟的”和“活的”凝膠材料。“軟的”水凝膠材料也可應(yīng)用于骨修復(fù)，具有很多獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)：除了其潛在的骨傳導(dǎo)性和生物降解性外，還可利用可控生長因子釋放和細(xì)胞封裝等增加其骨誘導(dǎo)性[91]。Nonoyama等[92]開發(fā)了一種新型的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠系統(tǒng)，經(jīng)HAP納米球礦化后的水凝膠具有可滲透性，可用于修復(fù)骨缺損。骨形成早期是膠原基質(zhì)水凝膠材料，但其中含有多種干細(xì)胞和功能細(xì)胞，是一種“活的”材料。受此啟發(fā)，Thrivikraman等[93]在膠原纖維凝膠中內(nèi)封裝干細(xì)胞(hMSCs)、血管和神經(jīng)細(xì)胞，并借鑒PILP的仿生礦化技術(shù)，在含NCPs的礦化液中培養(yǎng)，使膠原基質(zhì)礦化，可在體外得到具有骨樣組織特征的材料，是研究骨再生的很好體外模型。

傳統(tǒng)骨修復(fù)材料一般是在體外構(gòu)筑好，再移植到體內(nèi)進(jìn)行骨整合。而骨形成過程，是利用礦化前驅(qū)體實(shí)現(xiàn)膠原基質(zhì)礦化的過程。唐?？嫡n題組的Yao等[94-95]受此啟發(fā)，對(duì)骨修復(fù)進(jìn)行了一種創(chuàng)新嘗試：向生物活體提供裝配所需的原料(礦化前驅(qū)體)，而不是在體外進(jìn)行材料裝配，讓生物利用這些礦化前驅(qū)體來幫助骨再生。仿生礦化研究表明磷酸鈣納米團(tuán)簇是磷酸鈣形成的前驅(qū)體，但在溶液中含量極少且容易聚集，不易分離獲取和宏量制備[37]。他們通過借鑒和改進(jìn)PILP方法，得到了宏觀體量的磷酸鈣聚合物液態(tài)前體納米簇(CaP-PILP)材料。該材料富含礦物，呈粘稠狀態(tài)，具有較好的流動(dòng)性。CaP-PILP中富含1 nm大小的磷酸鈣團(tuán)簇，能實(shí)現(xiàn)膠原纖維的礦化，是一種礦化前驅(qū)體材料。Yao等[94]將該材料應(yīng)用于動(dòng)物顱骨缺損骨修復(fù)，取得了良好效果。從圖6中可以看到10周后納米簇在骨缺損內(nèi)產(chǎn)生了與周圍組織結(jié)合良好的修復(fù)層。由于CaP-PILP具有流動(dòng)性，他們還將納米簇材料注射入骨質(zhì)疏松骨的骨髓腔，發(fā)現(xiàn)可以完全治療骨質(zhì)疏松[95]。該研究是一個(gè)重要突破，因?yàn)楣琴|(zhì)疏松一般認(rèn)為是不可逆的過程，臨床治療往往以延緩進(jìn)展為主。在這些研究中，我們是從生物礦化中學(xué)習(xí)，發(fā)展仿生礦化技術(shù)，并通過仿生礦化技術(shù)得到材料，反過來應(yīng)用于生物礦化體系中，實(shí)現(xiàn)骨再生修復(fù)。

圖6 10周后，對(duì)照組、PAA/pAsp、HAP、P-control和納米簇的體內(nèi)骨再生;(A，D，G，J，M)代表性重建的微CT圖像;(B，E，H，K，N)代表性的HE染色結(jié)果，其中包括骨缺損邊緣(綠色矩形)和缺損中心(黑色矩形)的放大圖像;(C，F(xiàn)，I，L，O)具有代表性的Masson三色染色結(jié)果，以及骨缺損區(qū)域(黑色矩形)的放大圖像[94]Fig.6 In vivo bone regeneration of control，PAA/pAsp，HAP，P-control，and cluster-loaded hydrogel group after 10 weeks:(A，D，G，J，M)Representative reconstructed micro-CT images;(B，E，H，K，N)Representative HE staining results，with zoom-in images of the bone defect margins(green rectangles)and defect center(black rectangles);(C，F(xiàn)，I，L，O)Representative Masson trichrome staining results，with zoom-in images of the bone defect regions(black rectangles)[94]

6 結(jié) 論

我國已成為人口老齡化國家，由硬組織老化和損傷引起的健康問題日益嚴(yán)重，健康中國已成為國家發(fā)展基本方略中的重要內(nèi)容。硬組織本身是生物礦化的產(chǎn)物，深入學(xué)習(xí)生物礦化中的生物組織結(jié)構(gòu)、礦化結(jié)晶過程和礦化原理、層次結(jié)構(gòu)調(diào)控策略以及結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，可以啟發(fā)仿生礦化研究。發(fā)展材料構(gòu)筑的工程策略以及制備類似生物礦物結(jié)構(gòu)和生物功能的活性材料，有助于人體硬組織修復(fù)、幫助硬組織重建、恢復(fù)其生理功能甚至強(qiáng)化其生理機(jī)能。

近些年，在生物礦化和仿生礦化研究中所發(fā)現(xiàn)的非經(jīng)典結(jié)晶途徑、多級(jí)有序結(jié)構(gòu)材料的仿生構(gòu)筑工程策略以及膠原礦化的機(jī)制，對(duì)于深入理解生物礦化過程和調(diào)控機(jī)制、硬組織植入材料和誘導(dǎo)再生材料的設(shè)計(jì)和制備具有重要意義。其中，本課題組基于生物礦化前驅(qū)體的礦化策略發(fā)展了一些全新的仿生礦化技術(shù)，并應(yīng)用于牙釉質(zhì)修復(fù)、牙本質(zhì)修復(fù)和骨修復(fù)等方面，取得了初步的創(chuàng)新成果。特別是最近發(fā)展的基于寡聚體和磷酸鈣納米簇材料的礦化方法，可實(shí)現(xiàn)全牙釉質(zhì)的外延修復(fù)以及骨缺損和骨質(zhì)疏松的體內(nèi)修復(fù)，具有很好的應(yīng)用前景，已引起社會(huì)的關(guān)注。在膠原礦化仿生研究中，與牙科團(tuán)隊(duì)合作，我們重點(diǎn)解決加速牙本質(zhì)礦化，提高礦化度以及與粘結(jié)劑體系復(fù)配使用等臨床應(yīng)用亟需解決的重要難題，為仿生礦化的研究從基礎(chǔ)走向應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。我們相信，隨著對(duì)生物礦化過程和礦化機(jī)制的更深入和全面的認(rèn)識(shí)，生物“活”體系的仿生礦化將迎來新的突破，并期待仿生礦化從理論走向應(yīng)用，從學(xué)習(xí)走向創(chuàng)新，從“仿生”(體外燒杯實(shí)驗(yàn))走向“再生”(細(xì)胞或體內(nèi)組織實(shí)驗(yàn))。