宋啟晗 李旭冉 李 昕 楊巍巍 李 偉 于 順, 3, 4*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室 北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京 100053; 2. 首都醫(yī)科大學(xué)帕金森病臨床診療與研究中心，北京 100053; 3. 帕金森病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和教育部神經(jīng)變性病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100053; 4.國(guó)家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100053)

突觸核蛋白病是以α-突觸核蛋白(α-synuclein, α-Syn)在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的異常聚集和沉積為特征的神經(jīng)退行性疾病，包括帕金森病(Parkinson’s disease, PD)，路易體癡呆(dementia with Lewy bodies, DLB)和多系統(tǒng)萎縮(multiple system atrophy, MSA)[1]，其中以PD和MSA在臨床上最為多見[2]。兩種疾病在臨床癥狀上既有重合，又有各自的特征[3]。例如，雖然PD和MSA均有運(yùn)動(dòng)和自主神經(jīng)癥狀，但其表現(xiàn)和嚴(yán)重程度卻有不同。此外，PD和MSA也有各自特殊的臨床癥狀，如PD還表現(xiàn)出嗅覺下降、睡眠障礙、抑郁、焦慮甚至癡呆等非運(yùn)動(dòng)癥狀，而MSA則呈現(xiàn)小腦共濟(jì)失調(diào)等癥狀。PD和MSA臨床癥狀的異質(zhì)性還表現(xiàn)為疾病亞型分類的不同[4-6]。如PD可以分為震顫為主型(tremor dominant, TD)與姿勢(shì)不穩(wěn)和步態(tài)困難為主型(postural instability gait difficulty, PIGD)[7]，而MSA則可以分為以帕金森綜合征為突出表現(xiàn)的MSA-P亞型(MSA of Parkinsonism type)、小腦共濟(jì)失調(diào)癥狀為突出表現(xiàn)的MSA-C亞型(MSA of cerebellar type)[8]以及混合型MSA(MSA between cerebellar and parkinsonism type， MSA-C+P)[9]。在病理結(jié)果上，雖然PD和MSA均以α-Syn 的聚集和沉積為特征，但形成的病理結(jié)構(gòu)和沉積的神經(jīng)細(xì)胞卻不同。PD的特征性病理結(jié)構(gòu)是路易體(Lewy body, LB)和路易神經(jīng)突(Lewy neurite, LN)，沉積在神經(jīng)元的胞體和突起，而MSA的特征性病理結(jié)構(gòu)是少突膠質(zhì)細(xì)胞包涵體(glial cytoplasmic inclusion, GCI)，沉積到少突膠質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)中[2,10]。目前，導(dǎo)致α-Syn在不同疾病發(fā)生不同沉積的機(jī)制尚不清楚。本課題組[11-13]之前研究顯示，PD患者的血漿可以促進(jìn)α-Syn聚集的程度與PD的Hoehn-Yahr (H&Y)分期具有相關(guān)性，提示體液內(nèi)環(huán)境的變化與α-Syn聚集以及臨床表型具有內(nèi)在聯(lián)系。

本研究旨在比較分析PD和MSA以及二者不同亞型血漿促進(jìn)α-Syn聚合能力的差異，進(jìn)一步為體液環(huán)境變化影響α-Syn聚集提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019年期間經(jīng)社區(qū)篩選的健康受試者(對(duì)照組)10例和經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科專家臨床確診的PD和MSA患者各20例為研究對(duì)象，年齡55～65歲，男女比例均等。無其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病及遺傳代謝性疾病，病程<10年。PD采用新版世界運(yùn)動(dòng)障礙學(xué)會(huì)(Movement Disorder Society，MDS)[14]新版統(tǒng)一帕金森病綜合評(píng)價(jià)量表(Unified Parkinson’s Disease Rating Scale, MDS-UPDRS)進(jìn)行評(píng)分。亞型評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)=震顫類指標(biāo)均分÷姿勢(shì)不穩(wěn)/步態(tài)困難均分。比值>1.15為TD型，比值<0.9為PIGD型。MSA根據(jù)歐洲多系統(tǒng)萎縮研究組[15](European MSA Study Group，EMSA-SG)于2004年建立的統(tǒng)一多系統(tǒng)萎縮評(píng)估量表(Unified Multiple System Atrophy Rating Scale, UMSARS)進(jìn)行評(píng)分(表1)。本研究獲得首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理學(xué)審批號(hào)： 臨研審[2019]024號(hào)，所有受試者均簽署了知情同意書。研究分為對(duì)照組、震顫為主型PD(PD-TD)、姿勢(shì)不穩(wěn)與步態(tài)困難為主型PD(PD-PIGD)、小腦萎縮型MSA(MSA-C)和混合型MSA-C+P型，每組各10例。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料

重組人α-Syn、抗α-Syn單克隆抗體(3D5)由本室制備；生物素化3D5由北京博奧森生物技術(shù)有限公司標(biāo)記；親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶(美國(guó)Vector Laboratories公司)；4-硝基磷酸二鈉鹽(para-nitrophenol phosphate, pNPP)(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；ELISA 96孔板(美國(guó)Corning公司)；酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋公司)； BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(美國(guó)Pierce Biotech公司)；ECL檢測(cè)試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)。

1.2.2 體外血漿與α-Syn重組蛋白共孵育

將重組人α-Syn蛋白加入血漿中，至終濃度為100 μmol/L。以37 ℃，650 r/min的條件在恒溫震蕩孵育器中震蕩孵育48 h。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)α-Syn的寡聚體含量[16-17]

用濃度為1 mg/L的3D5單克隆抗體包被96孔酶標(biāo)板，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h，4 ℃過夜，PBST洗板。10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) BSA封閉，200 μL/孔，37 ℃孵育2 h，PBST洗板。加入倍比稀釋的重組人α-Syn寡聚體標(biāo)準(zhǔn)品(0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0 μmol/L) 和待測(cè)樣品，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h，PBST 洗板。然后加入濃度為1 mg/L生物素化3D5，100 μL/孔，37 ℃ 孵育2 h，PBST 洗板。再加入親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶(1∶5 000),100 μL/孔，37 ℃ 孵育1 h，PBST 洗板。最后加入pNPP，100 μL/孔，37 ℃顯色30 min，于405 nm 處測(cè)定吸光度(A)值。每次每個(gè)樣品重復(fù)3 孔，重復(fù)3 次。

1.2.4 蛋白印跡試驗(yàn)檢測(cè)α-Syn的寡聚體

各組取等量的α-Syn的寡聚體，進(jìn)行蛋白電泳，半干法轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉封閉1 h，抗α-Syn單克隆抗體(3D5，1∶10 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次。二抗1∶5 000室溫孵育1 h，TBST洗膜3次。加入ECL發(fā)光劑1 mL/膜，暗室曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 受試者人口信息和臨床資料

各組年齡、性別等方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，各組臨床數(shù)據(jù)見表1。

表1 受試者人口學(xué)資料和臨床特征

ItemsControlPD-PIGDPD-TDMSA-CMSA-C+PFPAge/a60.08±2.6560.46±3.0660.84±4.2160.43±4.6160.75±2.990.2040.933Female/male5/55/55/55/55/50.000-Education/a12.5±1.276.4±1.678.6±3.0511.75±3.7710.28±3.045.1590.007Duration/a-9.4±7.303.4±1.953.75±1.263.64±2.252.5340.093MoCA26.1±5.4018.0±6.5220.8±2.0517.85±8.2517.25±5.621.3830.284H-Y-3.4±0.552.1±0.22--4.9140.003UPDRS III-64.2±23.4622.2±16.27--3.2890.011UMSARS II---18.0±8.6624.0±10.741.2010.264

PD: Parkinson’s disease；PIGD： postural instability gait difficulty；TD： tremor dominant；MSA： multiple system atrophy tremor dominant；MSA-C： MSA of cerebellar type；MSA-C+P： MSA between cerebellar and parkinsonism type；MoCA: montreal cognitive assessment;H-Y: Hoehn-Yahr stage;UPDRSIII: Unified Parkinson’s Disease Rating Scale III;UMSARSII: Unified Multiple System Atrophy Rating Scale.

2.2 在PD和MSA患者血漿α-Syn寡聚體濃度比較

ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，α-Syn在3組血漿中形成的寡聚體濃度有明顯差異，其中兩兩比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PD(1.434±0.210) μmol/L、MSA(1.341±0.138) μmol/L與對(duì)照組(1.151±0.070) μmol/L比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而PD血漿中的α-Syn寡聚體濃度與MSA血漿比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表2。

2.3 α-Syn在不同亞型PD和MSA患者血漿中的寡聚體形成量

Western blotting分析結(jié)果顯示，未經(jīng)振蕩孵育的α-Syn單體，表觀相對(duì)分子質(zhì)量在17 000左右。在正常血漿中，除了檢測(cè)到α-Syn單體外，還在54 000和170 000處檢測(cè)到α-Syn，相當(dāng)于三聚體和十聚體。而在PD和MSA血漿中，三聚體和十聚體明顯增加，并且在三聚體和十聚體之間出現(xiàn)多種相對(duì)分子質(zhì)量不同的寡聚體(圖1A、B)。對(duì)Western blotting條帶進(jìn)行灰度分析發(fā)現(xiàn)，α-Syn在不同PD和MSA亞型血漿中形成的寡聚體的量明顯不同，其中在PD-PIGD中多于PD-TD，MSA-C中多于MSA-C+P(圖1C、D)。

ELISA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證明，α-Syn在不同PD和MSA亞型血漿中形成的寡聚體的量不同，與Western blotting分析結(jié)果一致。經(jīng)方差分析顯示α-Syn寡聚體含量分別在PD和MSA亞型中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩兩比較結(jié)果顯示，PD-PIGD與PD-TD和對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 MSA-C與MSA-C+P和對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。

3 討論

本課題組[13]以往的研究結(jié)果表明，PD血漿具有促進(jìn)α-Syn聚集的作用。本研究進(jìn)一步分析了PD和MSA及其不同亞型患者血漿促進(jìn)α-Syn聚集的能力，證明不同PD和MSA亞型患者的血漿促進(jìn)α-Syn聚集的能力不同，表現(xiàn)為PD-PIGD>PD-TD，MSA-C>MSA-C+P。PD血漿促進(jìn)α-Syn聚集的作用與血漿中影響α-Syn磷酸化修飾的酶的變化有關(guān)。PD血漿中促α-Syn磷酸化修飾的激酶(polo-like kinase，PLK2)的活性增高，而促進(jìn)α-Syn去磷酸化的酶(protein phosphatase 2A,PP2A)的活性降低，這種變化有利于α-Syn的磷酸化修飾，進(jìn)而促進(jìn)其聚集[13]。由此可以推測(cè)，PD和MSA不同亞型患者血漿促進(jìn)α-Syn聚集能力的不同也與其血漿中PLK2和PP2A的活性發(fā)生了不同程度的變化有關(guān)，進(jìn)而影響α-Syn的磷酸化和聚集。

表2 ELISA檢測(cè)疾病各亞型α-Syn寡聚體的濃度

DiseasesGroupNumber of caseConcentrationFPPDControl101.151±0.070PD-TD101.313±0.243PD-PIGD101.556±0.052*#9.663<0.05MSAControl101.151±0.070MSA-C+P101.228±0.190MSA-C101.406±0.161▲△19.790<0.05

*P<0.05vsPD control,#P<0.05vsPD-TD;△P<0.05vsMSA control,▲P<0.05vsMSA-C+P;α-Syn: α-synuclein；PD: Parkinson’s disease；MSA： multiple system atrophy tremor dominant；TD： tremor dominant；PIGD： postural instability gait difficulty；MSA-C+P： MSA between cerebellar and parkinsonism type；MSA-C： MSA of cerebellar type.

PD和MSA患者血漿促進(jìn)α-Syn聚集的能力可能是其神經(jīng)組織代謝變化的反映。PD患者敏感腦區(qū)影響α-Syn磷酸化修飾的酶發(fā)生了變化，表現(xiàn)為PLK2活性增加，而PP2A活性下降[18]。在本研究中，隨著老化，紋狀體和海馬等PD易受損腦區(qū)的PLK2和PP2A也發(fā)生了有利于α-Syn磷酸化修飾的變化，同時(shí)這些腦區(qū)組織勻漿具有促進(jìn)α-Syn磷酸化和聚集的作用[19]。

PD-PIGD患者血漿促進(jìn)α-Syn聚集的能力大于PD-TD患者血漿這一結(jié)果與PD-PIGD患者病程進(jìn)展較快，預(yù)后較差相符合，提示PD血漿促進(jìn)α-Syn聚集的能力很可能反映PD腦組織促進(jìn)α-Syn聚集的能力。目前尚無法解釋MSA-C患者血漿促進(jìn)α-Syn聚集的能力高于MSA-C+P患者血漿，盡管后者的突觸核蛋白病理同時(shí)累及小腦和中腦[20]。不同MSA亞型患者可能存在代謝性的差異。今后將通過檢測(cè)不同亞型MSA血漿中的調(diào)節(jié)α-Syn磷酸修飾的酶，驗(yàn)證血漿酶活性的變化與血漿促進(jìn)α-Syn聚集體的能力的一致性。

雖然PD和MSA同屬于突觸核蛋白病，而且MSA發(fā)展的速度明顯快于PD[2,21]，但本研究結(jié)果卻顯示，PD血漿促進(jìn)α-Syn聚集的能力似乎略大于MSA血漿，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，原因之一是樣本的數(shù)量較小，今后將通過增加樣本數(shù)量并進(jìn)行亞型分層比較驗(yàn)證PD和MSA的差異。

鑒于血漿促進(jìn)α-Syn寡聚體形成的能力在PD和MSA與健康對(duì)照組不同，且存在亞型之間的差異，這一檢測(cè)將又可能成為一種診斷技術(shù)，用于PD和MSA的診斷。今后將通過擴(kuò)大樣本數(shù)量驗(yàn)證這種可能性。