杜 崑 鄭 銘 王向東 張 羅

(首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，北京 100730)

在西方國家，85%的鼻息肉患者表現(xiàn)為以2型免疫為主的嗜酸性炎性反應并伴有組織內(nèi)總IgE的升高[1]，高IgE表達的強2型免疫反應也與疾病術后的復發(fā)密切相關[2]。目前針對IgE的單克隆抗體被證實可有效治療鼻息肉[3]，這表明息肉組織內(nèi)增多的IgE可能參與了鼻息肉的致病過程。亞洲人鼻息肉的免疫特點與西方國家存在顯著差異[4]，近年來2型免疫反應在中國患者的鼻息肉局部呈逐年增加的趨勢[5]。

從外周血循環(huán)遷移到息肉組織內(nèi)的初始B細胞，在抗原刺激下，經(jīng)Tfh細胞輔助增生形成生發(fā)中心，進而發(fā)育為成熟的IgE型漿細胞并參與免疫過程。在生發(fā)中心反應中，源于Tfh細胞的CD40分子配體(CD40 ligand, CD40L)、白細胞介素(interleukin，IL)-21和IL-4參與到了T-B細胞之間的信號傳遞并促進IgE型B細胞分化成熟[6]。IgE在復發(fā)的慢性鼻竇炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)患者中表達增高[2, 7]，但是作為在生發(fā)中心反應中IgE合成的關鍵分子，CD40L和IL-21對鼻息肉復發(fā)的影響仍不清楚，它們對易復發(fā)和不易復發(fā)的鼻息肉患者的IgE產(chǎn)生是否發(fā)揮著不同的作用仍不清楚。

本研究旨在探討IL-4、CD40L和IL-21對疾病復發(fā)的影響,并進一步分析CD40L和IL-21在術后3年時間內(nèi)的復發(fā)和未復發(fā)性鼻息肉患者中對 IgE產(chǎn)生的影響，為進一步的臨床生物治療提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2011年1月至2012年12月就診于首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科并行鼻內(nèi)鏡下鼻竇開放和鼻息肉切除手術的CRSwNP患者73例和無鼻腔鼻竇疾病的健康受試者24例，CRSwNP患者中男性53例(72.6%)，女性20例(27.4%)，平均年齡為(45.03±13.53)歲；健康受試者中男性18例(75%)，女性6例(25%)，平均年齡為(40.83±13.20)歲。所有患者CRSwNP的診斷符合2012年EPOS指南的診斷標準[8]。入組標準：年齡>16歲的雙側CRSwNP患者，且術前4周內(nèi)未使用鼻噴和口服糖皮質(zhì)激素治療和無急性上呼吸道感染者。排除標準:年齡不滿16周歲，合并有免疫缺陷、囊性纖維化、真菌性鼻竇炎和單側鼻竇炎患者。根據(jù)隨訪時間內(nèi)疾病是否復發(fā)進行分組(復發(fā)組33例，未復發(fā)組40例)。本研究方案經(jīng)由首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院倫理委員會審核通過(批號：TREC2011-21)，參與研究的受試患者均簽署知情同意書。

入組的CRSwNP患者術前記錄性別、年齡、哮喘病史和吸煙史等臨床資料。行皮膚點刺試驗記錄患者是否伴有變應性因素，待測吸入過敏原包括：樹木組合(柳樹/楊樹/榆樹)、普通豚草、艾蒿、室內(nèi)塵螨組合(屋塵螨/粉塵螨)、屋塵、貓、狗、蟑螂和霉菌。采集外周血并記錄嗜酸性粒細胞百分比，術后給予規(guī)范藥物治療2～3個月，藥物治療方案包括規(guī)律使用鼻噴糖皮質(zhì)激素、黏液促排劑和0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液鼻沖洗。對所有患者門診隨訪3年以上，息肉復發(fā)的診斷標準[9]：經(jīng)鼻內(nèi)鏡檢查發(fā)現(xiàn)帶蒂息肉樣新生物形成，鼻塞、流涕、頭痛和嗅覺減退癥狀中伴有2項或2項以上，再次給予常規(guī)藥物治療3個月后癥狀無法改善者。

1.2 免疫學檢測

手術中獲取受試者的鼻息肉樣本后凍存于-80 ℃ 冰箱，待受試者完成隨訪后取出并制備組織勻漿，制備方法參照文獻[10]。即獲取冰凍組織100 mg，在含有少量液氮的培養(yǎng)皿中約切成2 mm×2 mm，之后將組織連同磁珠置入勻漿儀(德國B.Braun-Melsungen公司)高速勻漿處理15 min，加入含有1%蛋白酶抑制劑(美國Sigma Aldrich 公司)的0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液并離心3 000 r/min,10 min，4 ℃，收集離心后上清液凍存于-80 ℃待檢測時取出。

通過Luminex檢測試劑盒(美國R&D Systems公司)，通過Bio-Plex 200(美國BioRad公司)檢測凍存的上清液中IL-4、IL-21和CD40L；使用ImmunoCAP(瑞典Phadia公司)檢測總IgE濃度。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢驗驗證數(shù)據(jù)的正態(tài)性分布，符合正態(tài)分布的定量資料使用獨立樣本t檢驗對比組間差異和Pearson相關性檢驗分析變量之間的相關性；不符合正態(tài)分布的定量資料使用Mann-WhitneyU檢驗對比組間差異和Sperman相關性檢驗分析變量之間的相關性。對于定性臨床資料采用χ2檢驗對比組間差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征分析

73例CRSwNP患者和24例無鼻腔鼻竇疾病的健康受試者的人口學特征和臨床特征見表1。兩組患者年齡和性別比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，外周血Eos計數(shù)、吸煙者和哮喘者比例以及組織總IgE濃度組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 復發(fā)和未復發(fā)CRSwNP患者的免疫學特征分析

73例患者均接受了功能性鼻內(nèi)鏡手術治療，手術方式包括篩竇/上頜竇開放術、額竇/篩竇/上頜竇開放術、蝶竇/篩竇/上頜竇開放術和全組鼻竇開放術，兩組患者接受的手術方式比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。復發(fā)組患者的組織總IgE和患有哮喘病史患者的比例顯著高于未復發(fā)組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；復發(fā)組患者外周血Eos百分比雖然明顯高于未復發(fā)組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組患者間息肉組織內(nèi)的IL-21、CD40L和IL-4比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見表2。

2.3 CRSwNP復發(fā)相關的Logistic回歸分析

以術后門診隨訪3年后CRSwNP患者的復發(fā)與否為因變量，以鼻息肉組織勻漿中的總IgE、IL-21、IL-4和CD40L為自變量進行二元Logistic回歸分析。經(jīng)回歸分析后證實局部鼻息肉組織內(nèi)高表達的IgE是術后復發(fā)的危險因素，而IL-4、CD40L和IL-21與疾病的復發(fā)無明顯相關性(表3)。

表1 CRSwNP患者和健康受試者的臨床特征

CharacteristicsControl (n=24)CRSwNP (n=73)PGender (male/female)18/653/200.818Age/a40.83±13.2045.03±13.530.186Blood eosinophils/%1.60 (1.40-3.00)5.20 (2.95-8.40)<0.001Asthma0 (0)14 (19.18)0.018Smoker3 (12.5)32 (43.84)0.006Recurrence (recurrence/non-recurrence)-33/40-Tissue total IgE/(KU·L-1)1.04 (0-3.52)150.70 (67.76-407.28)<0.001

CRSwNP: chronic rhinosinusitis with nasal polyps.

表2 復發(fā)和未復發(fā)CRSwNP患者的臨床特征與免疫學特征

CharacteristicsNon-recurrence (n=40)Recurrence (n=33)PGender (male/female)32/828/50.590Age/a44.53±14.9545.65±11.670.723Blood eosinophils/%4.40 (2.50-7.20)5.95 (3.7-9.45)0.070Asthma4 (10)10 (30.3)0.028Skin prick test positive13 (32.5)9 (27.3)0.628Smoker18 (45.0)14 (42.42)0.825Surgical proceduresBilateral patency of ethmoidal and maxillary sinus5 (12.5)1 (3.0)0.212Bilateral patency of frontal, ethmoidal and maxillary si-nus5 (12.5)4 (12.1)1.000Bilateral patency of sphenoid, ethmoidal and maxillary sinus4 (10.0)4 (12.1)1.000Bilateral patency of all four sinus26 (65.0)24 (72.7)0.479IL-4/(pg·mL-1)3.14 (3.14-74.14)3.14 (3.14-74.14)0.802IL-21/(ng·mL-1)1.72±0.741.82±1.210.694CD40L/(pg·mL-1)320.21 (167.09-552.31)304.09 (167.20-776.05)0.825Tissue total IgE/(KU·L-1)98.89 (43.56-255.20)257.40 (143.00-776.05)<0.001

CRSwNP: chronic rhinosinusitis with nasal polyps；IL: interleukin;CD40L: CD40 ligand.

表3 CRSwNP術后復發(fā)相關生物學指標的二元Logistic回歸分析結果

CRSwNP: chronic rhinosinusitis with nasal polyps;IL: interleukin;CD40L: CD40 ligand.

2.4 IL-21與易復發(fā)的CRSwNP組織中IgE的相關性

由于組織總IgE在復發(fā)組與未復發(fā)組比較，差異有統(tǒng)計學意義，且Logistic回歸分析表明鼻息肉局部增多的IgE是復發(fā)的危險因素，故而進一步分析與IgE差異表達相關的免疫分子。在73例患者中，組織總IgE與IL-21水平呈正相關(r=0.290，P=0.01)(圖1A)，與CD40L、IL-4無相關性；CD40L與IL-21呈正相關(r=0.440，P<0.001)(圖1B)。根據(jù)疾病的復發(fā)與否對患者進行分組發(fā)現(xiàn)，在復發(fā)組中，IgE與IL-4和CD40L無明顯相關，與IL-21呈顯著相關(r=0.374，P=0.029)(圖1C, D)；未復發(fā)組中IgE與IL-4、CD40L和IL-21均無相關性。

圖1 免疫學分子相關性分析

3 討論

CRSwNP是一種高度異質(zhì)性疾病，根據(jù)其局部組織的病理和免疫學特征不同又可分為不同的內(nèi)在型，不同內(nèi)型疾病對藥物的敏感性和手術治療的效果也不同[11]。對于嚴重的2型免疫反應介導的CRSwNP術后復發(fā)概率更大，為患者的生活質(zhì)量帶來了極大的困擾，也極大地增加了社會和個人的醫(yī)療負擔。IgE是2型免疫反應中的關鍵分子，與哮喘的合并發(fā)生和術后疾病的復發(fā)有著密切關系[12]。雖然目前使用IgE單克隆抗體對其進行靶向治療可以有效改善疾病嚴重程度，但是其臨床應用也存在一定限制，如臨床不良反應和昂貴的價格等，故而深入研究參與疾病復發(fā)的IgE相關的免疫分子可以為后續(xù)的生物治療提供可靠的理論依據(jù)。

本研究結果顯示，復發(fā)的CRSwNP其局部組織內(nèi)有著更高濃度的IgE，并且合并有哮喘病史的比例更高，這與既往研究[13]的相關結果是一致的。另外本研究中外周血中Eos在復發(fā)組中的含量明顯高于未復發(fā)組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這可能是與數(shù)據(jù)的離散分布和樣本量較小有關。經(jīng)過Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)組織局部增多的IgE是CRSwNP復發(fā)的危險因素，而IL-4、CD40L和IL-21與疾病的復發(fā)無明顯相關。同樣，雖然復發(fā)組與未復發(fā)組IL-4、CD40L和IL-21組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但是在復發(fā)組中，組織內(nèi)IgE的含量與IL-21是呈正相關。這表明CD40L、IL-4和IL-21并沒有直接參與疾病的復發(fā)，但是IgE作為2型免疫反應的關鍵分子與疾病的復發(fā)相關，而IL-21可能協(xié)助參與了復發(fā)組鼻息肉組織中IgE的合成。

IgE在息肉組織中的合成有賴于IgE分泌型的漿細胞的存在。在骨髓中發(fā)育成熟的初始B細胞經(jīng)外周血到達二級淋巴器官(如脾臟和淋巴結)和黏膜淋巴組織中。近年來有研究[14-15]證實，鼻息肉組織內(nèi)淋巴細胞豐富，可能成為一種異位淋巴組織,并且最近有多項研究在息肉組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)了生發(fā)中心樣結構，這表明息肉組織內(nèi)存在B細胞的發(fā)育成熟和漿細胞的分化形成。在經(jīng)典的生發(fā)中心反應過程中，濾泡輔助T細胞(follicular helper T)通過其胞膜表面的CD40L和T細胞抗原識別受體(T-cell antigen receptor,TCR)與分別B細胞膜上的CD40分子和MHC II類分子結合完成細胞間的相互作用，促進B細胞的發(fā)育成熟[16]。IgM型初始B細胞在這個反應過程中根據(jù)Tfh細胞所釋放的信號不同而分化發(fā)育為不同類型的漿細胞(如IgG型、IgA型和IgE型)，在IL-21和IL-4的作用下可以誘導初始B細胞發(fā)生類別轉化進而分化發(fā)育為IgE型漿細胞[17]。故而，CD40L、IL-4和IL-21都是參與最終IgE產(chǎn)生的關鍵分子。在本研究中CD40L與IL-21有顯著相關性，這與IL-21和CD40L在生發(fā)中心反應中的協(xié)同作用是一致的。在未復發(fā)的CRSwNP患者中，IgE與CD40L、IL-21和IL-4均無相關性，然而在復發(fā)的CRSwNP患者中IgE與IL-21呈顯著正相關。這表明在術后3年里易復發(fā)和不易復發(fā)的CRSwNP其IgE的產(chǎn)生機制可能是不同的?；贗gE產(chǎn)生的免疫學分子機制和本研究的結果，筆者推測在未復發(fā)的患者中，其IgE的產(chǎn)生可能更多是來源于外周血遷移而來的漿細胞而非在局部接受抗原提呈后直接發(fā)生了分化成熟；在復發(fā)的患者中，其IgE的產(chǎn)生與源于局部的分化發(fā)育成熟有關，這需要在未來的研究中進一步從分子和細胞層面去證實。

CRSwNP的本質(zhì)是一種鼻腔鼻竇黏膜的慢性炎性增生性疾病，雖然目前對于經(jīng)過藥物治療3個月以上無效的患者需要采用鼻內(nèi)鏡手術干預來緩解鼻腔癥狀，這并不能從發(fā)病原因上遏制其發(fā)病，故而隨著隨訪時間的延長，越來越多的患者出現(xiàn)了疾病的復發(fā)。在Calus等[18]的一項長達12年的回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，80%的CRSwNP患者出現(xiàn)了疾病的復發(fā)現(xiàn)象，其中有37%的患者需要再次接受手術治療以達到緩解癥狀的目的。故而深入的研究其發(fā)病和復發(fā)的分子機制，找到更多可靠的靶向治療分子，提高生物治療的臨床選擇和應用范圍，以逐步實現(xiàn)對疾病治愈的臨床目的。本研究證實了在中國人群中，CRSwNP患者相比健康人群而言，其鼻腔組織內(nèi)的IgE含量是增多的，并且增多的IgE與疾病的復發(fā)是相關的。之后，從與IgE合成相關的免疫分子中篩選到CD40L、IL-4和IL-21，對其進行相關性分析發(fā)現(xiàn)IL-21可能參與到了復發(fā)病例中IgE的合成。本研究的不足之處在于未能從細胞層面對其進一步佐證，這需要在接下來的研究中不斷完善。盡管如此，本研究證實了IL-21而不是CD40L與復發(fā)的CRSwNP中IgE的合成的關系，為將來的生物靶向治療提供理論參考依據(jù)。