杜毅超， 張 浩， 黃治偉， 浦仕林， 錢保林， 賴 莉， 譚 鵬，夏先明， 付文廣

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 a.四川省院士(專家)工作站; b.肝膽外科， 四川 瀘州 646000

Effect of apigenin on H2O2-induced oxidative injury in human hepatocytes L02

DUYichao,ZHANGHao,HUANGZhiwei,etal.(Academician

(Expert)WorkstationofSichuanProvince,TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the protective effect of apigenin against H2O2-induced injury in human hepatocytes (L02).MethodsL02 cells were treated with H2O2 to establish a model of oxidative injury. CCK-8 assay was used to measure cell viability; DCFH-DA was used to measure the production of reactive oxygen species (ROS) in cells; test kits were used to measure the activities of lactate dehydrogenase (LDH), malondialdehyde (MDA), and superoxide dismutase (SOD) in cell supernatant; Hoechst staining was performed to observe cell apoptosis, and a test kit was used to observe the activity of caspase-3. A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups, and the LSD-ttest was used for further comparison between two groups.ResultsApigenin at a concentration of ≥20 μmol/L significantly inhibited the proliferation of L02 cells (P<0.01). Compared with the cells in the blank control group, the cells treated with H2O2at a concentration of ≥500 μmol/L had a significant reduction in cell viability (P<0.001), and therefore, 500 μmol/L was determined as the optimal concentration for modeling. There was a significant difference in cell viability between the model group and the blank control group (P<0.01), and compared with the model group, the 5 and 10 μmol/L apigenin groups had a significant increase in cell viability (P<0.01). The cells in the blank control group had good morphology, while those in the model group were contracted and round-shaped and had marked rupture and deformity, and compared with the model group, the 5 μmol/L apigenin group showed significant improvement with a reduction in ruptured and round-shaped cells. There was a significant difference in fluorescence intensity between the blank control group, the model group, and the 5 μmol/L apigenin group (1.00±0.26 vs 32.94±1.29 vs 13.49±1.23,F=1.10,P<0.001), and the model group had a significantly higher fluorescence intensity than the blank control group (P<0.001). Compared with the model group, the 5 μmol/L apigenin group had a significant reduction in H2O2-induced ROS (P<0.001). Compared with the control group, the model group had significant increases in the levels of LDH and MDA and a significant reduction in the level of SOD (F=3.21, 2.03, and 3.32, allP<0.05), and compared with the model group, the 5 μmol/L apigenin group had significant reductions in the levels of LDH and MDA and a significant increase in the level of SOD (allP<0.05). There was a significant difference in cell apoptosis rate between the blank control group, the model group, and the 5 μmol/L apigenin group (7.54%±0.52% vs 39.77%±3.44% vs 14.40%±0.79%,F=9.439,P<0.01], and the model group had a significantly higher cell apoptosis rate than the control group (P<0.01); the cells treated with apigenin had a significantly lower apoptosis rate than those in the model group (P<0.01). There was a significant difference in the activity of caspase-3 between the blank control group, the model group, and the 5 μmol/L apigenin group (4.38±0.59 U/mg vs 16.44±1.13 U/mg vs 10.60±1.04 U/mg,F=1.17,P<0.05), and the model group had a significantly higher activity of caspase-3 than the blank control group (P<0.05); compared with the cells in the model group, the cells treated with apigenin had a significant reduction in the activity of caspase-3 (P<0.05).ConclusionApigenin may exert a protective effect against H2O2-induced injury in L02 cells by eliminating ROS and reducing caspase-3 activity.

Keywords：apigenin； hydrogen peroxide； LO2 cells； oxidative damage; apoptosis

氧化應(yīng)激在非酒精性脂肪性肝病、肝纖維化等肝病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。正常條件下，細胞通過特殊的機制維持氧化物與抗氧化物之間的平衡，而活性氧(ROS)過量會引發(fā)氧化應(yīng)激，破壞肝細胞的蛋白、脂質(zhì)及DNA，進而影響細胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致肝臟的結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生異常[2]。近年來，人們從中草藥中分離提純的一些天然活性物質(zhì)能夠通過改變氧化應(yīng)激發(fā)揮保肝護肝臟的作用[3-4]。芹菜素(Apigenin)是日常飲食中含有的一種黃酮類化合物，主要存在于芹菜、歐芹、洋甘菊等植物中[5]。研究[6-8]表明芹菜素具有很多生物活性，如抗氧化、抗癌、抗炎等多種作用。本研究利用H2O2刺激L02細胞構(gòu)建體外氧化應(yīng)激損傷模型，觀測芹菜素對氧化應(yīng)激及ROS生成的影響，探討芹菜素的抗氧化、抗凋亡作用，為其作為潛在的保肝護肝藥物成分提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人肝細胞L02購自上海中國科學(xué)院細胞庫；芹菜素(純度≥98%)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素、0.25%胰酶均購自美國HyClone公司；胎牛血清購自上海中喬新舟生物科技有限公司；CCK-8購自上海東仁化學(xué)科技有限公司；細胞凋亡-Hoechst染色試劑盒、caspase-3 活性檢測試劑盒及活性氧檢測探針2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；LDH、MDA、SOD檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。高速冷凍離心機、全光譜分光光度計、細胞培養(yǎng)箱均購自美國ThermoFisher Scientific公司；生物安全柜購自新加坡ESCO公司；倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將L02細胞以10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中。

1.2.2 芹菜素對L02細胞活力的影響 取對數(shù)期L02細胞調(diào)整濃度至6×104個/ml，每孔100 μl接種于96孔板，接種12 h后，細胞完全貼壁，分別用含1、2.5、5、10、20、40 μmol/L芹菜素的培養(yǎng)基替換原有培養(yǎng)基，并設(shè)置空白對照孔，每個濃度做6個復(fù)孔。在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后,CCK-8檢測各組細胞在450 nm波長處的光密度(OD)值，并計算細胞活力。

1.2.3 H2O2誘導(dǎo)L02細胞氧化損傷模型的建立 取對數(shù)期L02細胞調(diào)整濃度至6×104個/ml，每孔100 μl接種于96孔板，接種12 h后細胞完全貼壁，分別加入100、300、500和700 μmol/L的H2O2培養(yǎng)4 h后CCK-8檢測各組細胞在450 nm波長處的OD值，并計算細胞活力。確定H2O2的最佳濃度。

1.2.4 芹菜素對H2O2損傷L02細胞活力的影響 取對數(shù)期L02細胞調(diào)整濃度至6×104個/ml，每孔100 μl接種于96孔板，接種12 h后細胞完全貼壁，實驗分為6組，分別為對照組、模型組(H2O2，500 μmol/L)和4個芹菜素實驗組(1、2.5、5和10 μmol/L)。芹菜素預(yù)處理4 h后，加H2O2處理4 h，通過CCK-8檢測各組細胞在450 nm波長處的OD值，并計算細胞活力。

1.2.5 ROS含量的測定 取對數(shù)期L02細胞接種于24孔板，接種12 h后細胞完全貼壁，實驗分為3組，分別為對照組、模型組(H2O2，500 μmol/L)和芹菜素(5 μmol/L)組。芹菜素預(yù)處理4 h后，加H2O2處理4 h，嚴格按照活性氧檢測試劑盒說明書進行操作，熒光顯微鏡下觀察拍照，并記錄各組細胞的熒光強度，以對照組計算相對熒光強度。

1.2.6 細胞上清液體中丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)的檢測 取對數(shù)期L02細胞接種于24孔板，分組、給藥及造模同1.2.5節(jié)，造模4 h后收集細胞培養(yǎng)上清，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，檢測細胞培養(yǎng)上清中MDA含量、LDH及SOD活性。

1.2.7 Hoechst凋亡染色 取對數(shù)期L02細胞接種于24孔板，分組、給藥及造模同1.2.5節(jié)，造模4 h后用4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS輕輕潤洗3次，加入Hoechst 33342 0.5 ml，染色10 min后PBS輕輕潤洗3次，每次5min，熒光顯微鏡下觀察拍照，并計算各組細胞凋亡率。

1.2.8 caspase-3活性測定 取對數(shù)期L02細胞接種于6孔板，分組、給藥及造模同1.2.5節(jié)，造模4 h后收集細胞，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，檢測各組細胞caspase-3活性。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度芹菜素對L02細胞活力的影響 為優(yōu)化芹菜素濃度，采用1、2.5、5、10、20和40 μmol/L 6個濃度分析L02細胞活力。結(jié)果顯示，芹菜素濃度為≥20 μmol/L時對L02細胞的增殖有顯著抑制作用(P值均<0.01)(圖1)。

注: 與對照組比較，*P<0.01。

2.2 H2O2誘導(dǎo)L02細胞損傷模型的建立 為篩選出合適的H2O2建模濃度，用不同濃度的H2O2刺激L02細胞4 h。結(jié)果顯示，隨著H2O2濃度的增加，細胞活力也明顯受到抑制，與空白對照組L02細胞活力相比，500 μmol/L及以上的H2O2濃度均可使細胞活力顯著降低(P<0.001)(圖2)。因此，后續(xù)實驗選擇500 μmol/L作為H2O2的建模濃度。

2.3 芹菜素對H2O2損傷L02細胞活力的影響 CCK-8測定結(jié)果顯示，模型組細胞活力與空白對照組相比差異顯著(P<0.01)；與模型組相比，芹菜素5、10 μmol/L 組細胞存活率顯著提高(P值均<0.01)(圖3)。

注: 與對照組比較，*P<0.01，**P<0.001。

注：與空對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，

2.4 芹菜素對H2O2損傷L02細胞形態(tài)的影響 空白對照組細胞狀態(tài)較好，細胞延展良好，貼壁牢固，細胞間融合度較高；模型組細胞間收縮變圓，有細胞脫落，細胞破損變形嚴重；而芹菜素 5 μmol/L組與模型組相比，明顯得到改善，變圓破損細胞較少(圖4)。

注：a，對照組；b，模型組；c，芹菜素5 μmol/L組。

圖4芹菜素對H2O2誘導(dǎo)的L02細胞形態(tài)的影響

2.5 芹菜素對H2O2損傷L02細胞ROS水平的影響 空白對照組、模型組、芹菜素5 μmol/L組3組間相對熒光強度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(1.00±0.26 vs 32.94±1.29 vs 13.49±1.23,F=1.10，P<0.001)；模型組相對熒光強度較空白對照組明顯增強(P<0.001)，表明模型組產(chǎn)生大量的ROS；而芹菜素5 μmol/L組與模型組比較，芹菜素可明顯清除H2O2誘發(fā)的ROS(P<0.001)(圖5)。

注：a，對照組；b，模型組；c，芹菜素 5 μmol/L組。

圖5芹菜素對H2O2誘導(dǎo)的L02細胞中ROS的影響

2.6 芹菜素對H2O2損傷L02細胞上清中LDH、MDA、SOD的影響 如表2所示，模型組中LDH和MDA水平均明顯升高，SOD水平明顯降低，與空白對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.001)；經(jīng)過芹菜素(5 μmol/L)處理后，與模型組相比，LDH和MDA水平均明顯降低，SOD水平明顯升高(P值均<0.05)。以上結(jié)果提示，芹菜素能夠抑制H2O2對L02細胞的氧化損傷。

表1 芹菜素對H2O2損傷L02細胞上清中LDH、MDA、SOD的影響

注：與對照組相比，1)P<0.001；與模型組相比，2)P<0.05。

2.7 Hoechst凋亡染色觀測L02細胞凋亡情況 采用Hoechst 33342 染核后，凋亡細胞核會在熒光顯微鏡下發(fā)出強藍色熒光?？瞻讓φ战M出現(xiàn)強藍色熒光細胞核的細胞數(shù)量極少，模型組有較多細胞出現(xiàn)強藍色熒光細胞核，而用芹菜素(5 μmol/L)處理后強藍色熒光細胞核明顯減少(圖6)。

注：a，對照組；b，模型組；c，芹菜素 5 μmol/L 組。

圖6芹菜素對H2O2誘導(dǎo)的L02細胞凋亡的影響

空白對照組、模型組、芹菜素5 μmol/L組3組間細胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義7.54%±0.52% vs 39.77%±3.44% vs 14.40%±0.79%，F(xiàn)=9.44,P<0.01);模型組細胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.01);給予芹菜素處理后，相比于模型組凋亡率明顯降低(P<0.01)。說明芹菜素可抑制細胞凋亡。

2.8 芹菜素對H2O2損傷L02細胞caspase-3活性的影響 空白對照組、模型組、芹菜素5 μmol/L組3組間caspase-3活性比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義[(4.38±0.59) U/mg vs (16.44±1.13) U/mg vs (10.60±1.04) U/mg,F=1.17，P<0.05];模型組細胞caspase-3活性與對照組相比明顯增強(P<0.05);給予芹菜素(5 μmol/L)處理后，相比于模型組caspase-3活性明顯降低(P<0.05)。提示芹菜素可以通過調(diào)節(jié)caspase-3活性來抑制細胞的凋亡。

3 討論

SOD酶系是最早發(fā)現(xiàn)具有抗氧化作用的酶防御系統(tǒng)之一，其活性反映細胞抗氧化能力[11]。MDA是脂質(zhì)過氧化物中最具誘變作用的產(chǎn)物，其含量反映細胞氧化損傷的程度[12]。芹菜素具有很強的抗氧化作用，Zare等[13]通過阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性發(fā)現(xiàn)，芹菜素可明顯提高大鼠SOD水平并降低MDA水平，從而減輕心肌損傷。Huang等[14]研究發(fā)現(xiàn)芹菜素預(yù)處理可通過Notch1/Hes1介導(dǎo)的線粒體途徑減輕心肌缺血再灌注損傷，提高SOD活性并對MDA產(chǎn)生起抑制作用，從而增強心肌細胞的抗氧化能力。Sang等[15]研究表明芹菜素可通過激活Nrf2在d-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠模型中顯示保護作用，芹菜素降低了MDA水平，并提高了SOD和過氧化氫酶活性，表現(xiàn)出有效的抗氧化活性。為了解天然活性物質(zhì)芹菜素對肝細胞損傷的作用效應(yīng)，本研究通過H2O2建立L02細胞氧化損傷模型，通過一系列實驗，發(fā)現(xiàn)芹菜素可減弱H2O2致人肝細胞L02生長抑制，增強SOD活性，降低MDA的生成，提高細胞對ROS的清除能力。

Caspase-3是凋亡過程中起核心作用的關(guān)鍵酶，是凋亡的主要執(zhí)行者，負責(zé)100多種不同底物的蛋白水解，最終導(dǎo)致細胞解體和凋亡[16-18]。Duarte等[19]研究發(fā)現(xiàn)芹菜素可通過減少caspase-3激活和調(diào)節(jié)線粒體功能來保護內(nèi)皮細胞免于脂多糖誘導(dǎo)的炎癥。本研究通過Hoechst凋亡染色及測定細胞內(nèi)caspase-3活性發(fā)現(xiàn)經(jīng)過芹菜素的干預(yù)后，凋亡細胞明顯減少，caspase-3活性明顯降低，表明芹菜素可抑制人肝細胞L02的凋亡。

基于以上的論述，本研究旨在利用H2O2誘導(dǎo)L02細胞氧化損傷模型觀察芹菜素的抗氧化損傷能力。結(jié)果表明芹菜素對人肝細胞L02氧化損傷具有保護作用，可能是通過提高人肝細胞L02中抗氧化酶的活性，降低過氧化物的產(chǎn)生，提高清除自由基能力來減輕細胞氧化損傷；此外芹菜素還可通過降低人肝細胞L02的caspase-3活性來抑制細胞凋亡。本實驗為芹菜素的進一步研發(fā)應(yīng)用提供了更多的基礎(chǔ)研究支持。