葉 軍， 韓山山， 盧盺奕， 商玉濤， 馮志強,

1 安徽醫(yī)科大學空軍臨床學院 肝膽外科， 合肥 230032； 2 空軍特色醫(yī)學中心 肝膽外科， 北京 100142；3 安徽醫(yī)科大學藥學院創(chuàng)新藥物研究所， 合肥 230032； 4 北京朝陽急診搶救中心 普通外科， 北京 100122

microRNA-18a upregulates the regulatory immune function in patients with chronic hepatitis B through the PPARα/γ signaling pathway

YEJun,HANShanshan,LUXinyi,etal.

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,ClinicalCollegeofAirforce,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of microRNA-18a (miRNA-18a) on the regulatory immune function in patients with chronic hepatitis B (CHB) through the PPARα/γ signaling pathway.MethodsA total of 98 CHB patients and 96 patients without hepatitis B, who were treated in Air Force Special Medical Center (formerly known as General Air Force Hospital, PLA) from April 2017 to October 2018, were enrolled as experimental group and control group, respectively. There were no significant differences in age and sex between the two groups (P>0.05). RT- PCR was used to measure the relative mRNA expression of miRNA-18a in serum; flow cytometry was used to measure the expression of miRNA-18a in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs); ELISA was used to observe the effect of miRNA-18a on the frequency of CD4+CD25+regulatory T (Treg) cells; Western blot was used to measure the expression of proteins associated with the PPARα/γ signaling pathway. PBMCs were further divided into si-miRNA-18a inhibitor group (transfected with si-miRNA-18a inhibitor) and si-miRNA-18a normal control group (transfected with si-miRNA-18a plasmid); flow cytometry was used to investigate the effect of miRNA-18a inhibition on the frequency of CD4+CD25+Treg cells, and Western blot was used to measure the expression of proteins associated with the PPARα/γ signaling pathway. Thet-test was used for comparison of normally distributed continuous data between two groups, and a Pearson correlation analysis was performed to investigate the correlation between miRNA-18a expression and proteins associated with the PPARα/γ signaling pathway.ResultsCompared with the control group, the experimental group had significantly upregulated mRNA expression of miRNA-18a in serum and liver tissue (t=9.634 and 9.863, bothP<0.01). The experimental group had a significantly higher frequency of CD4+CD25+Treg cells than the control group (t=9.854,P<0.01). Compared with the control group, the experimental group had significantly upregulated levels of interferon-γ and interlukin-9 (t=8.235 and 8.382, bothP<0.05). Compared with the control group, the experimental group had significantly upregulated expression of PPARα and PPARγ (t=4.229 and 3.545, bothP<0.05). Compared with the si-miRNA-18a normal control group, the si-miRNA-18a inhibitor group had a significantly lower percentage of peripheral blood CD4+CD25+Treg cells among CD4+T cells (t=3.968,P<0.01). Compared with the si-miRNA-18a normal control group, the si-miRNA-18a inhibitor group had significantly lower expression of PPARα and PPARγ (t=5.023 and 4.983, bothP<0.05). miRNA-18a was positively correlated with the protein expression of PPARα and PPARγ in the PPARα/γ signaling pathway (r=0.701 and 0.682, bothP<0.05).ConclusionmiRNA-18a may affect the regulatory immune function in CHB patients by activating the PPARα/γ signaling pathway and thus upregulate the frequency of cell surface factors and cytokine secretion levels associated with immune function.

Keywords：hepatitis B, chronic； peroxisome proliferator-activated receptors； microRNAs； T-lymphocytes, regulatory

HBV感染后，HBsAg、HBeAg誘發(fā)并啟動宿主細胞對HBV不同程度免疫耐受，而CD4+CD25+調節(jié)性T淋巴細胞(Treg)在維持免疫耐受中起著決定作用[1-2]。過氧化物酶體增殖物激活受體α/γ(PPARα/γ)信號通路中PPAR有效的參與非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病過程，并以脂肪浸潤、肝細胞損害、炎癥和纖維化為臨床病理表現[3]。microRNA-18a(miRNA-18a)以其廣泛參與生物學調控、在各種疾病中表達均異常等特點成為現代醫(yī)學研究新方向[4]，有研究指出，miRNA-18a在肝病的發(fā)生發(fā)展中具有一定的作用[5]，而PPAR信號通路在非酒精脂肪性肝炎的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮了十分重要的作用[6]。但目前miRNA-18a對慢性乙型肝炎患者調節(jié)性免疫功能的影響缺乏系統(tǒng)性報道，因而本文對miRNA-18a在PPARα/γ信號通路上對慢性乙型肝炎患者調節(jié)性免疫功能影響的相關機制進行研究。

1 資料與方法

1.1 血清和組織來源 抽取來自空軍特色醫(yī)學中心(原中國人民解放軍空軍總醫(yī)院)肝膽外科2017年4月-2018年10月收治的確診慢性乙型肝炎行肝臟手術的98例患者為試驗組。納入標準：(1)血清 HBsAg和HBeAg陽性超過6個月；(2)符合我國乙型肝炎防治指南[7]的診斷標準。排除標準：(1)肝功能失代償病史者；(2)肝細胞癌病史者[8]；(3)合并惡性腫瘤患者；(4)合并臟器功能障礙者。另于本院隨機抽取同期行肝臟手術非慢性乙型肝炎的96例患者作為對照組。本研究方案經空軍特色醫(yī)學中心倫理委員會審批[批號：空總(科研)第2017-09-YJ 05]，患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器 異硫氰酸熒光素標記小鼠抗人CD4抗體(ANT-145)購自艾美捷科技、藻紅蛋白標記抗人CD25抗體(561405)購自北京志杰方遠科技有限公司，引物合成由北京金斯瑞生物科技有限公司完成。人IL-9雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(E-E-H0180c)、人IFNγ ELISA試劑盒、PPARα抗體(PPARα/NR1C1)(yboo978)、PPARγ抗體(PPAR-γ/NR1C3)(ATA35811)均購自美國R&D System公司，流式細胞分析儀(Attune NXT)購自美國Beckman公司，紫外分光光度計(S-3100)購自深圳邁昂科技有限公司。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR) 分別提取2組患者血清、肝組織中的總RNA。反轉錄成cDNA，然后PCR擴增檢測2組miRNA-18a mRNA的相對表達量。按說明書配制PCR反應體系。反應條件為95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s、80 ℃延伸10 s，共45個循環(huán)。每個樣本均檢測3次，采用2-△△CT(Livak)方法計算miRNA-18a mRNA相對表達量[9]。miRNA-18a正向引物：5’-GTGCTAAGGTGCATCTAGTGCAG-3’，反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；內參U6作為參照基因：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.4 流式細胞術檢測血清調節(jié)性免疫細胞表面因子頻率 采集2組患者外周血，肝素抗凝，經Ficoll密度梯度離心法分離獲得外周血單個核細胞(PBMC)。用抗人CD4和抗人CD25經免疫磁珠法從中分離出CD4+CD25+Treg細胞亞群(純度均>85%)。流式細胞儀檢測2組患者血清中CD4+CD25+Treg細胞表面因子頻率，結果所得流式圖運用Beckman分析軟件處理。

1.5 ELISA檢測相關細胞因子分泌水平 采用人IL-9雙抗體夾心ELISA試劑盒、人IFNγ ELISA試劑盒進行檢測，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行，每個樣本均設雙復孔。

1.6 Western Blot印跡檢測相關蛋白的表達 取2組細胞總蛋白并檢測濃度。制備電泳樣品，12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳，轉模，封閉。加入一抗，濃度分別為PPARα 1∶200，PPARγ 1∶400，β-肌動蛋白 1∶1000，4 ℃冰箱過夜，室溫孵育二抗2 h。顯影曝光條帶，每個標本重復3次。

1.7 細胞培養(yǎng)及轉染 將PBMC用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，當細胞生長到融合度達到幾乎80%后，用胰蛋白酶處理1 min，每2 d更換一次培養(yǎng)基。將培養(yǎng)的PBMC分為si-miRNA-18a抑制組(轉染miRNA-18a 抑制劑)、si-miRNA-18a正常對照組(轉染miRNA-18a質粒)。提前1天將細胞以60%的密度接種，使其混勻，第2天當細胞達到融合度40%的時候進行轉染。PBS洗滌2次之后每孔加入1 ml的DMEM高糖培養(yǎng)基(含20%胎牛血清)，用去離子水溶解siRNA至20 μmol/L，將siRNA與500 μl無血清DMEM相溶，混勻后靜置，此為A管；將Li-pofectamineTM2000與無血清DMEM混勻后靜置，此為B管，將A、B管混勻靜置20 min后加入各孔中，培養(yǎng)4～6 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24～28 h。采用RT-PCR檢測轉染效率，轉染成功即可用于后續(xù)實驗。

2 結果

2.1 一般資料 試驗組98例患者中男54例，女44例，平均(60.67±6.91)歲。對照組96例患者中男56例，女40例，平均(61.29±5.73)歲。2組間患者年齡、性別比較差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。

2.2 2組miRNA-18a mRNA 表達水平 RT-PCR結果顯示，試驗組血清中miRNA-18a mRNA相對表達量為3.53±0.57，對照組血清中miRNA-18a mRNA相對表達量為1.22±0.27，2組比較差異具有統(tǒng)計學意義(t=9.634，P<0.01)(圖1a)。試驗組肝組織中miRNA-18a mRNA相對表達量為9.24±1.25，對照組肝組織中miRNA-18a mRNA相對表達量為3.19±0.46，2組比較差異具有統(tǒng)計學意義(t=9.863，P<0.01)(圖1b)。

注：a，血清；b，肝組織。

2.3 2組PBMC中CD4+CD25+Treg細胞頻率比較 試驗組CD4+CD25+Treg細胞頻率為58.77±12.33，對照組CD4+CD25+Treg細胞頻率為46.68±12.16，2組比較差異具有統(tǒng)計學意義(t=9.854，P<0.01)(圖2)。

注：a，試驗組；b，對照組。

2.4 2組CD4+CD25+Treg相關細胞因子分泌水平 ELISA檢測結果顯示，試驗組IFNγ分泌水平為27.28±5.44，對照組的IFNγ分泌水平為11.45±2.26，2組比較差異具有統(tǒng)計學意義(t=8.235，P<0.05)(圖3a)；試驗組的IL-9分泌水平為30.89±5.79，對照組的IL-9分泌水平為12.76±2.53，2組比較差異具有統(tǒng)計學意義(t=8.382，P<0.05)(圖3b)。

圖3 miRNA-18a對CD4+CD25+Treg相關細胞因子分泌水平的影響

2.5 2組PPARα/γ信號通路相關蛋白表達水平 蛋白電泳結果顯示，試驗組的PPARα相對表達水平為0.92±0.11，對照組的PPARα相對表達水平為0.46±0.06；試驗組的PPARγ表達水平為0.47±0.05，對照組的PPARγ表達水平為0.22±0.03。PPARα和PPARγ表達水平在2組間差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為4.229、3.545，P值均<0.05)(圖4)。

圖4 2組PPARα/γ信號通路相關蛋白表達情況

2.6 抑制miRNA-18a表達對CD4+CD25+Treg細胞占外周血CD4+T淋巴細胞頻率的影響 si-miRNA-18a抑制組外周血CD4+CD25+Treg細胞占CD4+T淋巴細胞的比例為8.5%±2.2 %,si-miRNA-18a正常對照組外周血CD4+CD25+Treg細胞占CD4+T細胞的比例為11.4%±2.1%, 2組比較差異具有統(tǒng)計學意義(t=3.968,P<0.01)(圖5)。

注：a，si-miRNA-18a抑制組；b，si-miRNA-18a正常對照組。

圖5抑制miRNA-18a表達對CD4+CD25+Treg細胞占外周血CD4+T淋巴細胞頻率的影響

2.7 抑制miRNA-18a表達對PPARα/γ信號通路相關蛋白表達的影響 si-miRNA-18a抑制組的PPARα和PPARγ表達水平均明顯較si-miRNA-18a正常對照組低(t值分別為5.023、4.983,P值均<0.05)(圖6)。

圖6 抑制miRNA-18a表達對PPARα/γ信號通路相關蛋白表達的影響

2.8 miRNA-18a表達與PPARα/γ信號通路相關蛋白的相關性分析 miRNA-18a與PPARα/γ信號通路中的PPARα及PPARγ蛋白表達水平均呈正相關(r值分別為0.701、0.682，P值均<0.05)。

3 討論

慢性乙型肝炎是引起全球性關注的公共衛(wèi)生問題，機體免疫反應因HBV持續(xù)復制誘發(fā)而啟動，使感染者肝臟及周圍組織受到損害[10-11]。慢性乙型肝炎目前尚無特效治療方法，以藥物控制為主要手段，干擾素類和核苷(酸)類似物為主要涉及物[12-13]。本研究以慢性乙型肝炎患者和非乙型肝炎患者作為研究對象，探究了miRNA-18a通過PPARα/γ信號通路對慢性乙型肝炎患者調節(jié)性免疫功能的影響。通過RT-PCR檢測，發(fā)現在血清和組織中試驗組較對照組的miRNA-18a mRNA表達水平均顯著上調(P值均<0.01)。確定了miRNA-18a 在乙型肝炎中的高表達，說明miRNA-18a在乙型肝炎發(fā)生發(fā)展中具有一定的作用。采用流式細胞術檢測CD4+CD25+Treg細胞表面因子表達頻率的影響，結果發(fā)現試驗組較對照組的CD4+CD25+Treg細胞頻率升高(P<0.01)。繼續(xù)采用ELISA法檢測miRNA-18a對CD4+CD25+Treg相關細胞因子分泌水平的影響，結果顯示試驗組IFNγ和IL-9分泌水平均優(yōu)于對照組(P值均<0.05)，提示miRNA-18a對CD4+CD25+Treg相關細胞因子分泌具有一定的促進作用。最后Western Blot結果顯示試驗組PPARα和PPARγ表達水平較對照組均明顯上調(P值均<0.05)，說明miRNA-18a對慢性乙型肝炎患者調節(jié)性免疫功能的影響與激活PPARα/γ信號通路有關。si-miRNA-18a抑制組外周血CD4+CD25+Treg細胞占CD4+T淋巴細胞的比例明顯低于si-miRNA-18a正常對照組(t=3.968,P<0.01)。si-miRNA-18a抑制組的PPARα和PPARγ表達水平均明顯低于si-miRNA-18a正常對照組(P值均<0.05)。而通過相關性分析，miRNA-18a與PPARα/γ信號通路中的PPARα及PPARγ蛋白均呈正相關(P值均<0.05)，說明miRNA-18a可能通過PPARα/γ信號通路而對慢性乙型肝炎患者調節(jié)性免疫功能產生影響。

PPARα屬于核受體家族中的配體激活受體，PPAR與配體結合并激活后，與視黃醇類X受體(RXR)形成異二聚體，形成的PPAR/RXR異二聚體與靶基因啟動子上游的PPAR反應元件結合，最終調節(jié)靶基因的轉錄[14-15]。PPARα的激動一方面可以通過調節(jié)其靶基因如固醇調節(jié)元件結合蛋白、脂肪酸合成酶和低密度脂蛋白的表達改善脂質代謝，另一方面PPARα激活后能夠通過抑制NF-κB的活性從而降低炎癥因子的水平，并且有些PPARa激動劑本身還具有抗氧化作用，進一步減輕氧化應激，從而減輕肝臟的炎癥反應[16-17]。

綜上所述，本研究證明miRNA-18a可以通過激活PPARα/γ信號通路對慢性乙型肝炎患者調節(jié)性免疫功能產生影響，使其免疫功能相關細胞表面因子頻率和細胞因子分泌水平上調，該免疫信號通路可能是治療慢性乙型肝炎的一種新策略，但miRNA-18a對CD8+T淋巴細胞等適應性調節(jié)免疫細胞的影響還需要進一步探究。