趙金花， 李俊峰， 毛小榮

1 蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 蘭州 730000； 2 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 a.傳染病研究室; b.感染科， 蘭州 730000

Effect of T-lymphocyte phenotype on immune status in chronic hepatitis B virus infection and its application value

ZHAOJinhua,LIJunfeng,MAOXiaorong.

(TheFirstClinicalMedicalCollege,LanzhouUniversity,Lanzhou730000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the association between T-lymphocyte phenotype and immune status in chronic hepatitis B (CHB) and its application value.MethodsA total of 77 CHB patients who attended The First Hospital of Lanzhou University from January 2015 to May 2019 were enrolled, and according to the status of HBeAg and the serum levels of alanine aminotransferase (ALT), HBsAg, and HBV DNA, they were divided into immune tolerance group and non-immune tolerance group. The laboratory results of T-lymphocyte phenotype, HBV serological test, HBV DNA load, routine blood test, and liver function were obtained, and aspartate aminotransferase-to-platelet ratio index (APRI) and fibrosis-4 (FIB-4) were calculated. Thettest was used for comparison of normally distributed continuous data between two groups; and the Mann-WhitneyUtest was used for comparison of non-normally distributed continuous data between two groups; the chi-square test was used for comparison of categorical data between groups. Spearman correlation analysis was used to test the correlation effect between the two variables. The diagnostic efficacy of Treg, CD8+PD-1+T lymphocyte percentage and CD8+CD45RO+T lymphocyte percentage were evaluated by AUC.ResultsCompared with the non-immune tolerance group, the immune tolerance group had significantly higher percentages of Treg and CD8+PD-1+T cells (U=12.0 and 59.0,P<0.001,P=0.013) and significantly lower percentages of CD3+CD8+T cells and CD8+CD45RO+T cells (U=50.0 and 38.5, bothP<0.05). Compared with the high HBV DNA load group, the low HBV DNA load group had significantly lower percentages of Treg and CD8+PD-1+T cells (U=178.5 and 255.0,P=0.003 and 0.018) and significantly higher percentages of CD3+T cells and CD8+CD45RO+T cells (U=104.0 and 149.5,P=0.033 and 0.025). APRI was negatively correlated with the percentage of Treg (r=-0.379,P=0.013), and FIB-4 was negatively correlated with the percentages of CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD4+CD45RO+, and CD8+CD45RO+T cells (r=-0.259, -0.275, -0.233, and -0.229,P=0.023, 0.016, 0.041, and 0.045). Treg, CD8+PD-1+T cells, and CD8+CD45RO+T cells had an area under the ROC curve of 0.793 (95% confidence interval [CI]: 0.651-0.936), 0.802 (95% CI: 0.678-0.927), and 0.816 (95% CI: 0.706-0.927), respectively, in evaluating immune status.ConclusionThere are various T-lymphocyte phenotypes in patients with chronic HBV infection, and different T lymphocytes have different abilities to eliminate HBV. Detection of T-lymphocyte phenotype helps to understand the immune status and adjust the immune function in CHB patients and can provide a reference for the functional cure of CHB patients.

Keywords：hepatitis B, chronic； T-lymphocyte subsets； immunity, cellular

HBV感染是引起慢性肝病的主要原因，其特點(diǎn)是炎癥、肝細(xì)胞損傷和肝纖維化的緩慢進(jìn)展。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，每年約有2.4億人感染HBV，只有不到1%的慢性HBV感染通過抗病毒治療治愈，因此就產(chǎn)生了長(zhǎng)期或終生治療的需求[1]。HBV的清除在很大程度上依賴有效的T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)，在慢性HBV感染中，這種反應(yīng)通常會(huì)變得失調(diào)。研究[2]表明，即使在急性HBV感染期間循環(huán)內(nèi)的特異性T淋巴細(xì)胞頻率也是適中的，并且在慢性感染中進(jìn)一步降低。感染HBV還可以通過處理和遞呈異常高水平的病毒粒子和亞病毒顆粒對(duì)免疫系統(tǒng)長(zhǎng)期攻擊，反復(fù)觸發(fā)T淋巴細(xì)胞受體，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞衰竭[3-4]。目前的抗病毒治療很少達(dá)到治愈的目的，迫切需要新的治療方法來恢復(fù)HBV特異性T淋巴細(xì)胞免疫，以盡快達(dá)到慢性HBV的功能性治愈。初治慢性HBV感染者的轉(zhuǎn)錄基因顯示，在慢性HBV感染的不同階段有不同的血液基因特征，這表明不同階段T淋巴細(xì)胞的激活是不同的[5]。此外，肝臟免疫狀態(tài)是通過肝臟炎癥反應(yīng)表現(xiàn)，免疫反應(yīng)越強(qiáng)，炎癥程度越強(qiáng)，但嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致肝纖維化程度的增加而加快肝硬化進(jìn)展。因此，評(píng)估慢性HBV感染患者免疫狀態(tài)是實(shí)現(xiàn)HBV功能性治愈的基礎(chǔ)，通過研究不同T淋巴細(xì)胞表型百分比與肝纖維化程度的相關(guān)性，尋找治療與肝臟炎癥反應(yīng)之間的平衡點(diǎn)。本研究擬通過觀察慢性HBV感染初治患者外周血T淋巴細(xì)胞表型百分比與不同免疫狀態(tài)及HBV DNA不同水平以及與肝纖維化程度之間的相關(guān)性，為了解慢性HBV感染初治患者的免疫狀態(tài)及恢復(fù)HBV特異性免疫功能提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年1月-2019年5月在蘭州大學(xué)第一醫(yī)院就診的慢性HBV感染初治患者77例，篩選流程見圖1。其中免疫耐受期68例，非免疫耐受期9例。慢性HBV感染患者診斷依據(jù)臨床實(shí)踐指南[6]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并肝細(xì)胞癌、肝移植、脾切除、血液系統(tǒng)疾病、丙型肝炎及戊型肝炎、AIDS、遺傳代謝性肝病、酒精性和非酒精性脂肪性肝病；(2)合并有活躍的自身免疫性疾病、藥物或可能影響免疫功能的共同疾病。本研究方案經(jīng)由蘭州大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(批號(hào)：LDYYLL2019-254)。

1.2 研究方法

1.2.1 觀察指標(biāo) 收集患者的一般資料、T淋巴細(xì)胞表型、HBV血清學(xué)標(biāo)志物、HBV DNA載量、血常規(guī)、肝功能等主要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，并計(jì)算肝纖維化血清學(xué)診斷指標(biāo)APRI及FIB-4。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)T淋巴細(xì)胞亞群及調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)檢測(cè) 外周血單個(gè)核細(xì)胞中加入熒光素標(biāo)記的單克隆抗體CD3、CD4、CD8、CD45RO、CD4+CD25+Foxp3(Treg)和小鼠IgG1-FITC及小鼠IgG2-PE做為對(duì)照(美國(guó)BD公司)直接標(biāo)記全血細(xì)胞，溶血素溶解紅細(xì)胞，PBS洗滌兩次，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞，CellQuest軟件獲取分析細(xì)胞進(jìn)行分析，計(jì)算CD3+、CD4+、CD8+、Treg、CD8+PD-1+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RO+細(xì)胞。

圖1 研究對(duì)象的篩選流程

1.2.3 免疫狀態(tài)分期 根據(jù)國(guó)內(nèi)指南[6]，將年齡較輕、HBV DNA>107IU/ml、HBsAg水平較高(通常>104IU/ml)、HBeAg陽性及ALT持續(xù)正?；颊吡袨槊庖吣褪芷诨颊撸溆嗷颊呔袨榉敲庖吣褪芷诨颊?。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 慢性HBV感染初治患者中HBeAg陰性組44例，其中男32例，女12例，HBeAg陽性組33例，其中男22例，女11例，根據(jù)HBeAg狀態(tài)分為2組，CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞百分比和HBsAg水平在HBeAg陽性組與HBeAg陰性組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表1)。

2.2 不同免疫狀態(tài)下T淋巴細(xì)胞表型百分比的比較結(jié)果

慢性HBV感染后患者不同免疫狀態(tài)表現(xiàn)出不同的T淋巴細(xì)胞表型百分比。Treg和CD8+PD-1+細(xì)胞百分比在免疫耐受期明顯高于非免疫耐受期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；CD8+CD45RO+百分比和CD3+CD8+百分比在免疫耐受期明顯低于非免疫耐受期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表2)。

2.3 不同HBV DNA載量組各T淋巴細(xì)胞表型百分比的比較結(jié)果 為了進(jìn)一步評(píng)估不同T淋巴細(xì)胞表型對(duì)HBV DNA的清除作用，根據(jù)HBV DNA載量將患者分為HBV DNA高載量組(>500 IU/ml)和HBV DNA低載量組(≤500 IU/ml)。結(jié)果顯示Treg和CD8+PD-1+百分比在HBV DNA低載量組明顯低于HBV DNA高載量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；CD3+和CD8+CD45RO+百分比在HBV DNA低載量組明顯高于HBV DNA高載量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表3)。

2.4 不同T淋巴細(xì)胞表型的百分比與肝纖維化血液學(xué)診斷指標(biāo)的相關(guān)性 分析結(jié)果顯示，不同T淋巴細(xì)胞表型百分比中僅有Treg與APRI有相關(guān)性，且呈負(fù)相關(guān)(P=0.013)；而與FIB-4相關(guān)性分析顯示，CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RO+這四種T淋巴細(xì)胞百分比與FIB-4呈負(fù)相關(guān)(P值均<0.05)，隨著上述四種T淋巴細(xì)胞百分比的降低肝纖維化程度逐漸加重(表4)。

表1 不同HBeAg狀態(tài)的慢性HBV感染初治患者指標(biāo)比較

表3 不同HBV DNA載量組各T淋巴細(xì)胞表型的比較(%)

表4 不同T淋巴細(xì)胞表型百分比與肝纖維化血液學(xué)診斷指標(biāo)的相關(guān)性

2.5 Treg、CD8+PD-1+及CD8+CD45RO+百分比對(duì)于免疫狀態(tài)的評(píng)估效能 T淋巴細(xì)胞表型百分比評(píng)估免疫狀態(tài)的ROC曲線分析結(jié)果顯示，Treg、CD8+PD-1+及CD8+CD45RO+的AUC值均>0.7(表5)。

表5 3種T淋巴細(xì)胞百分比對(duì)于免疫狀態(tài)的評(píng)估效能

3 討論

人體感染HBV后，體內(nèi)抵御病毒的免疫反應(yīng)主要是細(xì)胞免疫，如T淋巴細(xì)胞通過細(xì)胞溶解途徑和非細(xì)胞溶解途徑清除病毒，感染即可得到控制，反之，病毒將長(zhǎng)期存在[7]。近年來，關(guān)于慢性HBV感染的免疫功能研究越來越多，其中大部分是基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，而對(duì)于檢測(cè)患者外周血中不同T淋巴細(xì)胞表型的研究尚處于初始階段。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同T淋巴細(xì)胞表型的表達(dá)水平并首次將其用于評(píng)估慢性HBV感染患者的免疫狀態(tài)，為進(jìn)一步調(diào)節(jié)慢性HBV感染患者免疫功能進(jìn)而達(dá)到功能性治愈提供依據(jù)。本研究顯示，Treg、CD8+PD-1+及CD8+CD45RO+T淋巴細(xì)胞百分比與免疫狀態(tài)及HBV DNA載量有關(guān)，可以推測(cè)這三種表型T淋巴細(xì)胞百分比的下降與免疫功能的衰竭及HBV的清除能力低下有關(guān)，這與既往的研究中慢性HBV感染患者Treg對(duì)HBV清除的抑制作用及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞衰竭時(shí)表現(xiàn)的免疫抑制相對(duì)應(yīng)。

本研究顯示，HBV DNA水平低者，Treg百分比低，HBV DNA水平高者Treg百分比高。Treg是一類具有免疫抑制功能的T淋巴細(xì)胞亞群，是細(xì)胞免疫中重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞，在維持機(jī)體免疫耐受方面起著關(guān)鍵作用。既往研究[8]顯示相比未感染的動(dòng)物，土撥鼠肝炎病毒感染的土撥鼠肝臟中Treg的百分比明顯升高，肝臟Treg的增加伴有抗炎細(xì)胞因子(如TGFβ1和IL-10)和免疫抑制分子如程序性死亡受體1(PD-1)及其配體(PD-L1)的表達(dá)顯著增加。此外，研究[9]顯示，HBV感染的小鼠中，濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞是清除HBV所必需的，并且能被Treg所抑制；進(jìn)一步的研究顯示，去除Treg或抑制Treg功能(用CTLA-4封閉抗體)可恢復(fù)濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞對(duì)HBV DNA的清除。另外，Treg百分比與APRI呈負(fù)相關(guān)也可以推斷，Treg在HBV的清除過程中起抑制作用，抑制肝臟炎癥反應(yīng)進(jìn)而減慢肝纖維化進(jìn)展。因此，阻斷Treg功能可能有助于控制HBV感染,本研究也證實(shí)了既往研究結(jié)果。

已有大量的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HBV特異性T淋巴細(xì)胞是HBV感染的免疫控制所必需的。因此，對(duì)于慢性HBV感染患者免疫功能衰竭的大多數(shù)研究集中于恢復(fù)T淋巴細(xì)胞的活性，特別是CD8+T淋巴細(xì)胞。CD8+T淋巴細(xì)胞是清除HBV感染細(xì)胞的主要效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，通過細(xì)胞溶解和非細(xì)胞溶解機(jī)制兩種途徑清除HBV感染細(xì)胞[10-11]。而PD-1分子是表達(dá)于CD8+T淋巴細(xì)胞衰竭時(shí)最突出的標(biāo)志物，是CD8+T淋巴細(xì)胞抑制性受體，負(fù)性調(diào)節(jié)其活化、增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制對(duì)HBV的清除。此前已有研究[12-13]顯示，慢性HBV感染者PD-1、PD-L1表達(dá)較健康對(duì)照組明顯升高，提示PD-1表達(dá)上調(diào)與HBV感染慢性化相關(guān)。更進(jìn)一步在慢性HBV感染的研究[14]中，檢測(cè)到了與病毒逃逸相容的序列，最常見的是以表達(dá)高水平PD-1的T淋巴細(xì)胞為靶向的核心表位。同樣的基于PD-1阻斷的免疫療法將恢復(fù)CD8+T淋巴細(xì)胞的抗病毒功能。在本研究中，PD-1的表達(dá)在免疫耐受期明顯高于非免疫耐受期，且HBV DNA高載量者明顯高于HBV DNA低載量者，其與Treg一樣抑制清除病毒的免疫反應(yīng)。

此外，本文評(píng)估了不同免疫狀態(tài)下慢性HBV感染者的T淋巴細(xì)胞表型百分比。關(guān)于恢復(fù)慢性HBV感染者免疫功能的研究中，主要是根據(jù)不同免疫狀態(tài)下T淋巴細(xì)胞表型百分比的變化情況進(jìn)一步調(diào)整慢性HBV感染者的免疫功能，從而達(dá)到治療的目的。大多數(shù)免疫治療的目的是加強(qiáng)機(jī)體對(duì)HBV功能失調(diào)的特異性免疫應(yīng)答，其中T淋巴細(xì)胞工程就是要人工替代HBV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞[15]。淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒小鼠模型的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[16]顯示，T淋巴細(xì)胞衰竭的不同階段具有不同的恢復(fù)能力，提示慢性HBV感染的免疫治療可能必須根據(jù)感染不同階段CD8+T淋巴細(xì)胞表型進(jìn)行調(diào)整。本研究表明隨著免疫狀態(tài)的活化，Treg與CD8+PD-1+細(xì)胞百分比呈下降趨勢(shì)而CD8+CD45RO+T淋巴細(xì)胞百分比呈上升趨勢(shì)，且三種T淋巴細(xì)胞表型百分比對(duì)慢性HBV感染者的免疫狀態(tài)的診斷效能均較高。因此，根據(jù)Treg、CD8+PD-1+和CD8+CD45RO+T淋巴細(xì)胞百分比在慢性HBV感染者的不同免疫狀態(tài)的變化情況，及時(shí)調(diào)整慢性HBV感染者體內(nèi)紊亂的免疫功能，可望恢復(fù)患者清除HBV的主動(dòng)免疫，從而達(dá)到功能性治愈。

綜上所述，通過對(duì)不同HBV特異性T淋巴細(xì)胞表型與免疫狀態(tài)及HBV DNA載量的研究，可以推測(cè)Treg、CD8+PD-1+及CD8+CD45RO+T淋巴細(xì)胞在慢性HBV感染者不同免疫狀態(tài)下的變化情況，及時(shí)調(diào)整免疫功能，恢復(fù)HBV特異性免疫細(xì)胞的主動(dòng)免疫，從而恢復(fù)對(duì)HBV的清除功能。同時(shí)，本研究仍有難以避免的不足之處，所選樣本量較少，且由于臨床數(shù)據(jù)不足未能根據(jù)患者肝硬化Child-Pugh評(píng)分進(jìn)一步分組，此外，由于回顧性研究本身特性的缺陷，大量患者缺乏后續(xù)隨訪數(shù)據(jù)，未能評(píng)估其預(yù)后情況。因此，將來的研究有待進(jìn)一步的優(yōu)化。