賈 磊， 溫欣慰， 李海洋,2

1 貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴陽 550004； 2 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科， 貴陽 550004

Effect of hepatocyte transplantation in treatment of rats with liver cirrhosis and small-for-size syndrome

JIALei,WENXinwei,LIHaiyang.

(GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

Keywords：cell transplantation； liver cirrhosis; small-for-size syndrome

小肝綜合征是指接受擴大肝切除或減體積肝移植術(shù)后，部分患者可能發(fā)生肝移植物或殘余肝臟不能滿足受者的功能需要，導(dǎo)致繼發(fā)肝功能障礙，甚至合并肺、腎衰竭，其實質(zhì)上屬于急性肝衰竭[1]。雖然評估肝臟儲備功能及預(yù)防術(shù)后肝衰竭發(fā)生風(fēng)險的方法很多，但均存在臨床應(yīng)用缺陷[2]，目前尚無有效的手段對該并發(fā)癥進(jìn)行預(yù)防和治療。因此目前臨床迫切需要一種合理、有效的方法來治療小肝綜合征。

肝細(xì)胞移植作為一種新的方法和手段，在治療嚴(yán)重肝臟疾病和急性肝功能損害方面越來越受到人們的關(guān)注。目前對于該治療的焦點主要集中在肝臟先天性代謝疾病、各種藥物、毒物、病毒引起的急(慢)性肝功能衰竭上，對于肝臟切除后引起小肝綜合征造成的急性肝衰竭鮮有報道。本研究使用合并肝硬化的大鼠進(jìn)行大部分肝臟切除，使得動物模型更接近臨床病例，觀察肝細(xì)胞移植對肝硬化合并小肝綜合征的治療效果。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，SPF級，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號：SCXK(遼)2015-0001。實驗場地：貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床研究中心，許可證號：SYXK(黔)2015-005。所有動物飼養(yǎng)在恒溫21 ℃、70%濕度環(huán)境中，消毒飼料喂養(yǎng)，飲用5%～10%乙醇，晝夜照明時間為12 h。本研究方案經(jīng)由貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會審批(批號：1901079)，符合實驗室動物管理與使用準(zhǔn)則。

1.2 試劑和儀器 四氯化碳(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)，紅星二鍋頭(乙醇濃度56%，市售)。Ⅳ型膠原酶(中國Solarbio公司，貨號：C8160)，DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司，貨號：8119081)，無鈣鎂D-Hanks液(中國Solarbio公司，批號：H1045-500)，Hanks液(中國Solarbio公司，貨號：H1015-500)。臺盼藍(lán)溶液(中國Solarbio公司，貨號：c0040)，EDTA(中國Solarbio公司，超純級，批號：524J051)。ALT測試盒( 南京建成科技有限公司，貨號：C009-2)、AST測試盒(南京建成科技有限公司，貨號:C010-2)、Alb測試盒(南京建成科技有限公司，貨號:A028-1)。蠕動泵(上海滬西分析儀器廠有限公司，型號:BT-100)，倒置顯微鏡(德國Leica公司)。

1.3 肝硬化大鼠模型的建立 雄性SD大鼠40只，按0.2 ml/100 g背部多點皮下注射分析純四氯化碳，每周2次，開始予5%乙醇(二鍋頭+滅菌蒸餾水)為唯一飲水源，2周內(nèi)逐漸增加濃度至10%，持續(xù)時間14周，建模過程中死亡4只大鼠。14周后隨機解剖2只大鼠，觀察成模情況。肝臟肉眼觀：體積縮小，質(zhì)地變硬，表面凹凸不平，可見大小不等結(jié)節(jié)(圖1a)。肝臟組織HE染色病理切片：纖維組織增生，正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失，被增生的纖維結(jié)締組織分割成大小不等的假小葉，中央靜脈偏曲、消失，肝細(xì)胞片狀壞死(圖1b、c)。認(rèn)為整批大鼠建模成功，停藥1周后開始手術(shù)。

注：a，肝臟大體標(biāo)本；b、c，肝組織病理檢查(HE染色，×100)。

圖1肝硬化大鼠肝臟大體和病理標(biāo)本

1.4 原代肝細(xì)胞的分離

1.4.1 分離前準(zhǔn)備 配制含0.01%EDTA的D-Hanks溶液及含0.05%Ⅳ型膠原酶的Hanks液預(yù)溫37 ℃。蠕動泵接7.5號輸液器，用預(yù)溫的D-Hanks液排出管內(nèi)空氣待用。

雙氣泡圖的對比運用到更高層次的思維技能。在課堂上，教師可通過雙氣泡圖設(shè)計練習(xí)題，讓學(xué)生上臺訓(xùn)練，學(xué)生也可通過雙氣泡圖來整理復(fù)習(xí)相關(guān)事物的異同點，如分子與原子的異同點。

1.4.2 肝臟灌注 參照SEGLEN兩步灌注法并略有改動，取正常SD大鼠1只，10%水合氯醛按0.2 ml/100 g腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥位固定于超凈工作臺上，消毒術(shù)區(qū)，“十”字切口入腹，門靜脈下方置線備用，以準(zhǔn)備好的輸液器穿刺入門靜脈，并用預(yù)置好的線固定，打開蠕動泵以20 ml/min速度灌注D-Hanks液，可見肝臟逐漸膨脹，剪斷下腔靜脈，繼續(xù)灌注，待下腔靜脈流出清涼液體后改換含0.05%Ⅳ型膠原酶的Hanks液繼續(xù)以20 ml/min速度灌注，待肝臟表面有滲液，彈性明顯降低時提示灌注完畢(圖2a)。

1.4.3 肝細(xì)胞的分離及純化 完整取下已灌注好的肝臟，放入盛有20 ml含膠原酶的Hanks液的無菌培養(yǎng)皿中，撕開肝臟包膜，用平鑷輕輕刮下肝臟細(xì)胞，200目的濾網(wǎng)濾去殘余結(jié)締組織，肝細(xì)胞濾液以500 r/min、4 ℃低速離心2 min，去上清液，加入適量DMEM培養(yǎng)液再次予500 r/min速度離心2 min，此過程重復(fù)3次得到純凈的肝實質(zhì)細(xì)胞(圖2b)。

1.4.4 肝細(xì)胞活率測定 反復(fù)吹打混勻純凈的肝細(xì)胞，取80 μl細(xì)胞懸液+20 μl臺盼藍(lán)溶液混合，靜置1 min后，用血細(xì)胞計數(shù)盤顯微鏡下計數(shù)，細(xì)胞藍(lán)染的為死亡的肝細(xì)胞，得到活率>95%的肝實質(zhì)細(xì)胞(圖2c、d)。

注：a，灌注好的肝臟；b，新鮮肝細(xì)胞懸液；c，鏡下肝細(xì)胞；d，臺盼藍(lán)染色的肝細(xì)胞。

圖2肝臟的灌注及肝細(xì)胞的分離

1.5 肝硬化大鼠肝細(xì)胞移植

1.5.1 大鼠分組 從肝硬化大鼠中隨機抽取30只，隨機分為A、B、C 3組，每組10只。A組：手術(shù)前3 d腹腔注入新鮮肝細(xì)胞1×108個細(xì)胞。B組：手術(shù)時腹腔注入新鮮肝細(xì)胞1×108個。C組：不進(jìn)行肝細(xì)胞移植處理。

1.5.2 小肝綜合征的建立 70%肝臟切除：10%水合氯醛按0.2 ml/100 g行腹腔麻醉，待麻醉生效后，大鼠仰臥位置于超凈工作臺中的手術(shù)臺上，碘伏酒精消毒術(shù)區(qū)，正中切口入腹，切除肝左外葉、左內(nèi)葉及右葉，術(shù)畢腹腔注射青霉素20萬單位。術(shù)后3 d飲用10%葡萄糖水，自由飲食。

1.5.3 血清學(xué)檢查及HE染色 分別于術(shù)后12、24、72、120、168、240 h斷尾取血，根據(jù)試劑盒說明書分別檢測ALT、AST、Alb水平。用多聚甲醛固定肝組織，石蠟包埋，切片，HE染色。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠生存率比較 A組大鼠術(shù)后死亡1只，生存率為90%，死亡時間節(jié)點為術(shù)后8 h。B組大鼠術(shù)后死亡5只，生存率為50%，死亡節(jié)點為術(shù)后6、7、13、20、40 h。C組死亡7只，生存率為30%，死亡時間節(jié)點為術(shù)后3、7、11、20、22、25、35 h。死亡大鼠均行尸體解剖排除出血、腸漏等引起的死亡。3組生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.440，P=0.04)。

2.2 3組大鼠肝生化比較 分別于術(shù)后12、24、72、120、168、240 h斷尾取血查ALT、AST、Alb水平。3組大鼠術(shù)前即存在輕度的肝損傷，表現(xiàn)為ALT、AST輕度上升、Alb輕度下降，但各指標(biāo)3組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)，結(jié)合肝組織病理學(xué)檢查提示各組大鼠肝硬化水平一致。術(shù)后24 h ALT、AST逐漸升至頂峰,Alb下降至最低值，其后各組指標(biāo)逐漸好轉(zhuǎn)。術(shù)后各時間節(jié)點各指標(biāo)3組之間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)，A組的恢復(fù)情況均有好于B、C兩組的趨勢，但進(jìn)一步兩組之間比較，部分時點存在無統(tǒng)計學(xué)差異的情況，考慮與術(shù)后肝功能恢復(fù)的個體差異性有關(guān)(表1，圖3)。

圖3 3組之間ALT、AST、Alb水平在不同時間點的比較

表1 3組大鼠各時間點ALT、AST、Alb水平比較

2.3 3組大鼠肝組織學(xué)情況 術(shù)后72 h每組隨機抽取1只大鼠處死行肝臟組織學(xué)檢查。A組大鼠可見肝細(xì)胞水腫，少許氣球樣變及炎細(xì)胞浸潤(圖4a)。B組見肝細(xì)胞排列紊亂，嚴(yán)重水腫，肝臟點狀壞死(圖4b)。C組見肝索消失，大片肝細(xì)胞嚴(yán)重水腫，變性壞死，呈空泡狀改變，大量炎細(xì)胞浸潤(圖4c)。

注：a，A組；b，B組；c，C組。

圖43組大鼠術(shù)后72h肝臟病理組織學(xué)檢查(HE染色，×200)

3 討論

肝細(xì)胞移植是將正常的肝細(xì)胞體外進(jìn)行分離、處理，然后植入受體體內(nèi)，重建肝臟組織結(jié)構(gòu)，恢復(fù)肝功能的一種技術(shù)。它被認(rèn)為是原位肝移植有希望的替代治療，用于包括急性肝衰竭和代謝性肝病在內(nèi)的多種疾病。與原位肝移植相比，它有較小的侵入性、并發(fā)癥和死亡風(fēng)險，并且可以重復(fù)進(jìn)行[3]。該技術(shù)目前的治療焦點主要集中于肝臟先天性代謝性疾病，如Crigler-Najjar綜合征、家族性高膽固醇血癥、尿素代謝障礙等[4]，對于此類疾病，目前認(rèn)為該治療方法可在短期內(nèi)改善肝臟代謝，改善臨床癥狀，但無法達(dá)到長期治療效果，故對于代謝性疾病，目前肝細(xì)胞移植多作為在等待原位肝移植過程中的過渡性治療[5]。對于急性肝衰竭的治療目前的共識是可以通過細(xì)胞治療，特別是肝細(xì)胞移植中受益[6]。有動物實驗[7]結(jié)果表明，少量肝細(xì)胞移植即可對肝功能的改善產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，并顯著增加急性肝衰竭動物的存活率。移植途徑的選擇優(yōu)先選擇門靜脈，但對于肝臟結(jié)構(gòu)改變的疾病如肝硬化，推薦脾臟途徑，腹腔因為其容量大、易于操作而成為異位肝細(xì)胞移植的優(yōu)選場所之一[8]。

小肝綜合征的臨床癥狀并無特異性，需要結(jié)合臨床、實驗室和組織病理學(xué)評估來診斷[9-11]，主要的特征為術(shù)后肝功能障礙，伴有膽汁淤積和凝血功能障礙、門靜脈高壓癥和腹水，生化特征包括轉(zhuǎn)氨酶和膽紅素水平升高[12]。殘肝體積較小是術(shù)后肝衰竭的獨立危險因素，當(dāng)術(shù)后標(biāo)準(zhǔn)殘肝體積<250 ml/m2時患者發(fā)生肝衰竭的概率為38%。因此應(yīng)針對不同患者具體病情采取個體化治療方案，選擇合適手術(shù)方式，對預(yù)防肝切除術(shù)后肝衰竭發(fā)生至關(guān)重要[13]。在行擴大肝切除的患者，目前的共識是肝功能良好的情況下至少保留正常肝組織的30%，合并有肝硬化的患者，至少保留原肝組織的50%，而對于肝功能受損的患者，則需保留更多甚至不適宜行肝切除[14-15]。目前對于擴大肝切除引起的小肝綜合征，多采取護肝藥物、人工肝、血液超濾等治療，但效果欠佳，而對于肝移植造成的小肝綜合征通常需再次進(jìn)行移植。

原發(fā)性肝癌是目前我國第4位的常見惡性腫瘤及第3位的致死性腫瘤，嚴(yán)重威脅我國人民的生命和健康，手術(shù)切除是肝癌治療的首選[16]，相較于歐美，我國肝癌患者多合并有肝硬化，且以大肝癌為主，進(jìn)一步造成了術(shù)后小肝綜合征肝衰竭的發(fā)生。筆者前期先制作了肝硬化的大鼠模型，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行大部分肝臟切除(70%)，造成小肝綜合征急性肝衰竭，使動物模型更接近于我國患者的臨床特點。本研究顯示，術(shù)前行肝細(xì)胞移植的大鼠生存率明顯高于其他兩組，且肝功能的恢復(fù)情況也好于其余兩組，但進(jìn)行兩組間比較時部分時間節(jié)點的組別并無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，僅有好轉(zhuǎn)趨勢，考慮與樣本量較小有關(guān)及個體恢復(fù)差異有關(guān)。由此認(rèn)為：肝細(xì)胞移植可有效促進(jìn)肝硬化術(shù)后小肝綜合征的肝功能恢復(fù)及提高生存率；細(xì)胞移植的時間也影響了肝細(xì)胞移植的治療效果。

綜上所述，肝細(xì)胞移植治療肝硬化合并小肝綜合征療效確切，該實驗不僅在適應(yīng)證上增加了肝細(xì)胞移植的范圍，也為臨床上治療肝切除術(shù)后小肝綜合征提供了一種新的方法。