張蕾，謝建平

(西南大學生命科學學院現(xiàn)代生物醫(yī)藥研究所，重慶 400715)

新發(fā)和再現(xiàn)病原導致疾病爆發(fā)是全球性的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。全球化、人口增加、生境丟失，接觸新宿主等因素疊加，動物病毒跨種傳播對公共衛(wèi)生的威脅尤其突出。其中，冠狀病毒(Coronavirus,CoV)因為導致嚴重新型冠狀病毒肺炎(Novel coronavirus pneumonia,NCP)的新型冠狀病毒2019-nCoV、導致嚴重急性呼吸綜合征相關冠狀病毒SARS-CoV(severe acute respiratory syndrome CoV)和中東呼吸綜合征相關冠狀病毒MERS-CoV(Middle East respiratory syndrome CoV)等備受關注。

冠狀病毒1937年最初從雞的感染組織中發(fā)現(xiàn)。冠狀病毒高度流行、分布廣泛，其基因組遺傳多樣性巨大(表1)、重組頻繁，加之人-動物界面接觸增加，尤其是食用野生動物，頻繁的跨物種感染和偶爾的溢出事件，新冠狀病毒有可能在人群中周期性出現(xiàn)。已知有七種冠狀病毒會引起人類疾病。除上述三種，另外四種冠狀病毒-人冠狀病毒(Human coronaviruses，HCoVs)-229E、HCoVOC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1，在免疫功能正常的個體中普遍存在，一般呈現(xiàn)普通感冒癥狀。其中HCoV-NL63、HCoV-229E和HCoV-OC43來自蝙蝠。冠狀病毒家族中鼻病毒是普通感冒的主要原因(約10%～30%)。有些冠狀病毒是家禽和家畜的重要致病菌，可引起呼吸道、腸道、肝臟和神經系統(tǒng)疾病。如鳥支氣管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus，AIBV)，豬腸胃炎病毒(Transmissible Gastro-Enteritis Virus,TGEV)，豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus)變異株，γ屬的禽傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)，豬急性腹瀉綜合征(SADS)等，這些病毒多次給世界畜牧業(yè)造成巨大損失。

表1 部分冠狀病毒及其宿主細胞受體

冠狀病毒也成為研究病毒-宿主相互作用的模式病毒。一般發(fā)生不明原因肺炎時，如果懷疑是冠狀病毒，首選需要通過測序、細胞培養(yǎng)分離等方法確定病原，為后續(xù)病毒溯源、病毒致病機理、動物模型建立、疾病發(fā)生、發(fā)展和傳播規(guī)律及臨床診治、傳播力大小、快速檢測技術和產品研發(fā)、抗病毒應急藥物和抗體類藥物、疫苗研發(fā)等相關研究奠定基礎。目前的測序技術和大數(shù)據(jù)可以快速鎖定病原。比如新冠肺炎致病菌的鎖定只用了一周左右。但是，因為缺乏動物模型，目前很難確定冠狀病毒感染致病的關鍵因子。

關于冠狀病毒的研究較多。截至2020年2月7日下午7點，本文研究利用coronavirus在NCBI genome中檢索到40個冠狀病毒基因組。其中最早的為1993年。截止2020年2月7日，用coronavirus檢索NCBI PubMed發(fā)現(xiàn)收錄文獻14673篇。用“冠狀病毒”檢索中國CNKI期刊庫發(fā)現(xiàn)4546篇，其中綜述195篇。2003年是世界上冠狀病毒研究的分水嶺。2003年以前，每年最多發(fā)表文章89篇，2003年以后，每年一般發(fā)表130篇以上。主要原因是2003年的非典型肺炎(SARS)和2012年的中東呼吸綜合征(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)，以及導致最近“新冠狀病毒肺炎”的2019新冠狀病毒(2019 novel coronavirus，2019-nCoV)疾病高度流行。研究中比較重要的進展有：以SARS-CoV作為模式，綜合系統(tǒng)生物學和反向遺傳學技術，構建動態(tài)轉錄網絡(Dynamic transcriptional network)，尋找疾病相關表型的宿主或病毒遺傳因子，以及探索人群水平的致病機理。

1 冠狀病毒基因組特征和主要宿主

冠狀病毒(圖1)屬于巢病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、正冠狀病毒亞科(Orthocoronavirinae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)，是自然界廣泛存在、物種多樣的一大類有包膜、不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，基因組全長27～32kb，螺旋狀核衣殼結構外面包裹有脂雙層，可以感染人、牛、鼠、豬、貓、犬、雪貂、駱駝、兔子、蝙蝠與禽類等宿主。目前有α、β、γ和δ四個屬。β冠狀病毒是包膜性病毒。新型肺炎病毒2019-nCoV就屬于冠狀病毒科β冠狀病毒屬，與一種來自蝙蝠的冠狀病毒的序列一致性高達96%。該病毒經飛沫、氣溶膠、接觸等途徑傳播，潛伏期感染者也具傳播性。目前數(shù)據(jù)表明：2019-nCoV比SARS-CoV毒力弱，但傳播力強。可能2019-nCoV與SARS冠狀病毒使用相同的受體-血管緊張素轉化酶2(ACE2)進入宿主細胞。病毒S蛋白結合宿主細胞受體的能力是CoV在新物種中存活的關鍵，但不是唯一因素。

圖1 冠狀病毒形態(tài)示意圖(2019-nCoV)

一般RNA病毒的基因組都盡可能小，以避免錯誤災難(Error catastrophe)。CoV作為巢病毒目中基因組最大的成員，克服錯誤災難的方法是產生一個大的復制復合體(Replication complex)。該復合體包括非結構蛋白(Nonstructural protein,nsp)nsp14的3'-5'核酸外切酶(Exoribonuclease)活性介導的校讀功能，具有RNA合成和修飾活性。這個巨大、復雜的RNA復制機器允許CoV基因組達到32kb，還能夠存活。冠狀病毒依賴RNA的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)的忠實性降低，突變更快，尤其是群體大，代時短，因此突變率高，遺傳變異大，與宿主細胞表面受體如二肽基肽酶4(Dipeptidyl peptidase 4，DPP4)相互作用的病毒S蛋白的突變、重組、高突變子位點(Mutator alleles)，突變穩(wěn)健性(Mutational robustness)等因素疊加使得冠狀病毒的宿主范圍不斷擴大。根據(jù)選擇壓力，CoV蛋白可以分為三組：刺突蛋白、保守性蛋白和可變蛋白。新CoV出現(xiàn)，這三組蛋白的功能必需協(xié)調，既維持病毒關鍵功能，也克服種障礙。

以2019-nCoV為例(圖2)，透射電子顯微鏡下，負染色的2019-nCoV粒子通常是球形，具有多形性。直徑60～140nm。人氣道上皮超薄切片可見胞外游離病毒顆粒和胞質膜結合小泡內充滿病毒顆粒的包涵體[1]。

冠狀病毒的宿主很廣泛[2]。目前發(fā)現(xiàn)與人類肺炎關系密切的宿主都涉及蝙蝠。蝙蝠是包括冠狀病毒在內的多種病毒重要宿主。人類聚居區(qū)附近攜帶病毒的蝙蝠容易將病毒傳播給人類和牲畜。這主要是蝙蝠進化歷史悠久、地理多樣性強，季節(jié)性遷徙，物種多樣性和豐度高(大約占哺乳動物多樣性的20%)、種群密度大、具有獨特免疫、生理等特征。蝙蝠攜帶多種CoV。目前，關于蝙蝠不發(fā)病的假說主要有以下幾種：(1)蝙蝠飛行產生大量活性氧(Reactive oxygen species,ROS)，活性氧調控基因表達，限制氧化脅迫，抑制病毒復制和致病。(2)蝙蝠多樣性的病毒庫可能與其獨特的先天免疫有關。蝙蝠因為缺乏炎癥體途徑的Pythin(PYRIN and HIN domain-containing)和天然殺傷免疫球蛋白樣受體KIR(natural killer immunoglobulin-like receptors)基因，或者極低的表達，病毒感染導致的疾病和損傷有限。蝙蝠組成性表達某些亞型的干擾素，既可以限制發(fā)病，也允許病毒低劑量存在。(3)病毒和蝙蝠可能是共生關系。病毒可能是蝙蝠微生物組中激發(fā)免疫的關鍵，類似人的皰疹病毒。另外，就疾病和適應性免疫而言，腸道感染和呼吸道感染還是不同。病毒嗜性因物種和組織而異，這可能也是蝙蝠不發(fā)病的原因[3]。蝙蝠具有完整的適應性免疫系統(tǒng)，腸道的病毒導致適應性免疫強度較低，病毒可以維持在類似人微生物組成員滴度的水平。(4)蝙蝠有些因素可以維持病毒的存在，也促進了CoV準種(quasispecies)庫的多樣性。蝙蝠飛行過程中，可能短期積累ROS。ROS的突變效應可以超過病毒聚合酶的校讀修復能力，改變病毒聚合酶忠實性，提高病毒物種多樣性，為跨種傳播提供基礎。蝙蝠連續(xù)產生I型干擾素可能選擇有利于突變的病毒物種，增強病毒對新宿主天然免疫的抗性，跨種傳播后復制更有優(yōu)勢。蝙蝠缺乏關鍵的炎癥介導因子，沒有降低這些免疫應答的選擇壓力。病毒感染新宿主后，新宿主產生大量病理性炎癥應答，這與在MERS-CoV和SARS-CoV感染人后觀察到的現(xiàn)象吻合。蝙蝠中大量病毒準種存在的因素，也使得病毒具有多樣性，在新物種中出現(xiàn)。

2 冠狀病毒復制、包裝和與宿主相互作用的過程與關鍵分子[4-7]

圖2 冠狀病毒基因組結構示意圖(以SARS-CoV為例)

認識病毒復制、病毒-宿主相互作用是解決冠狀病毒防控措施的關鍵。冠狀病毒比其他正鏈RNA病毒的基因組大，基因表達策略復雜，蛋白質組也大，與宿主相互作用復雜。病毒在宿主細胞中表達的蛋白質，一方面用于病毒復制或者組裝，另一方面與宿主相互作用。為病毒復制提供更佳環(huán)境、改變宿主基因表達、拮抗宿主抗病毒策略。冠狀病毒蛋白質組復雜，復制過程復雜。對于宿主因子在冠狀病毒復制中的作用、細胞中病毒RNA合成機器的組裝與功能，逃避宿主細胞先天免疫應答的相關研究較少。

2.1 核酸合成酶

冠狀病毒基因組編碼兩個具有RNA依賴的RNA合成酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)活性的蛋白，即nsp12與nsp8，前者主要是利用引物合成長鏈的基因組或者mRNA，后者利用RdRp活性合成短鏈RNA，作為引物供前者合成長的RNA鏈，nsp8是冠狀病毒基因組合成起始階段的關鍵。

nsp14，ExoN與nsp10(在冠狀病毒中相對保守)形成復合體，介導3′-5′核酸外切酶(Exoribonuclease)活性，類似DNA聚合酶的校讀活性，具有DEDD 超家族。nsp14 DEDD突變后，突變率提高15～20倍。nsp10-nsp14復合體提高復制忠實性?；蛑亟M、基因重復、旁系基因進化、利用重疊讀框從頭產生等都可以獲得基因。尚待明確基因組擴增、附屬基因是否有利于冠狀病毒擴大宿主。

RNA病毒進行基因組選擇性包裝。這是病毒侵入和破壞宿主先天免疫系統(tǒng)的關鍵。許多包裝方式都涉及基因組包裝信號。對冠狀病毒基因組包裝的認識主要來自兩個病毒：小鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus)和傳染性腸胃炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus)。冠狀病毒第一個包裝信號發(fā)現(xiàn)了30多年，但對其功能認識仍然不足。目前關于包裝信號研究的結論尚無一致意見。爭議主要體現(xiàn)在包裝信號識別過程中病毒核衣殼蛋白或膜蛋白是否發(fā)揮主要作用。

冠狀病毒具有獨特的非連續(xù)轉錄模式?；蚪MRNA 5′末端包括一個末端帽子結構，其后是65～98個核苷酸大小的前導序列以及200～400個核苷酸大小的不譯區(qū)，3′末端則包括200～500個核苷酸大小的不譯區(qū)和poly(A)尾。冠狀病毒基因組RNA具有mRNA功能，有感染性。冠狀病毒是正鏈RNA病毒(Positivestranded RNA(正鏈RNA)viruses)，特殊之處是基因組大，約30kb。其基因組結構為多順反子，利用獨特機制產生嵌套的亞基因組(Subgenomic,sg)mRNAs，用于表達位于復制酶(Replicase)ORFs 1a和1b下游的編碼結構蛋白和輔助蛋白可讀框(Open reading frames,ORFs)(圖3)。sg mRNAs結構特點是共3′末端，也含有共同的5′前導序列。sg RNAs的前導序列和結構序列在不連續(xù)的負鏈RNA合成中連接，提供每個sg mRNAs的亞基因組長度的模板。

圖3 冠狀病毒復制和感染示意圖(以SARS-CoV為例)。

冠狀病毒復制酶基因轉錄的非結構蛋白具有多種功能，如多聚蛋白加工、復制酶復合體的形成、病毒缺陷復制、RNA轉錄、翻譯和蛋白合成、加工和修飾、感染宿主、結合宿主蛋白質、調控毒力和疾病輕重等。深入研究非結構蛋白有助于了解病毒的致病機制，為開發(fā)新型抗病毒藥物和研究病毒檢測和防控方法提供靶點。SARS-CoV、IBV、HCoV229E等冠狀病毒的非結構蛋白高度保守，研究SARS-Cov或IBV非結構蛋白將有助于了解冠狀病毒。

復制與細胞膜組分密切相關，尤其是內質網(Endoplasmic reticulum，ER)。被其感染的細胞呈現(xiàn)內質網脅迫，誘導未折疊蛋白質應答(Unfolded protein response，UPR)，關閉全局性翻譯，增加內質網折疊能力，試圖恢復內質網穩(wěn)態(tài)。內質網脅迫過長，UPR會誘導細胞凋亡。冠狀病毒-宿主相互作用涉及內質網脅迫和UPR。UPR涉及三條途徑，任何一條途徑被激活，如絲裂原活化蛋白激酶(Mitogenactivated protein(MAP) kinase)、自噬或者先天免疫應答。病毒復制和致病可能得益于ER脅迫和UPR。不同凋亡途徑之間相互作用。

病毒粒子組裝和出芽：包膜病毒中，冠狀病毒特殊之處在于病毒包膜組裝發(fā)生在ERGIC。病毒粒子自此出芽進入腔，再進入宿主分泌途徑，最后出胞。M蛋白協(xié)調病毒組裝，病毒樣顆粒(svirus-like particle,VLP)的產生和釋放需要M和E。缺乏E蛋白編碼基因(ΔE)的重組冠狀病毒(Recombinant CoVs，rCoVs)形態(tài)異常。MHV E蛋白C-端殘基變?yōu)楸彼岷?，病毒粒子變得對溫度敏感，更長，而不是典型的球狀。病毒斑形態(tài)異常，小且不規(guī)則，邊緣鋸齒狀。重組SARS-CoV-ΔE(Recombinant SARS-CoVΔE，rSARS-CoVΔE)成熟病毒粒子減少，含致密顆粒物質的小泡增多。這可能是病毒組裝失敗，病毒粒子不成熟。CoV E viroporin具有陽離子選擇性，優(yōu)先通過單價的Na+和K+。合成SARS-CoV E類似viroporin，能夠運輸Na+、K+和Cl-，對此顯示對Na+比K+選擇性強，對Cl-選擇性很弱。

核酸內切酶(Endoribonuclease，EndoU)[8-10]：由非結構蛋白(Nonstructural protein，nsp)nsp15編碼，nsp15具有尿苷酸特異性核酸內切酶(U-specific endoribonuclease，NendoU)活性，327～375個氨基酸，38～42kDa，其N端參與蛋白之間的工作，C端包含酶活性區(qū)域，其活性區(qū)域在所有冠狀病毒中均保守。nsp15發(fā)揮活性依賴與Mn2+結合。它可作用于單鏈和雙鏈RNA，切除3'端GUU或GU序列的尿苷酸， 形成2'-3'三磷酸二酯環(huán)末端。Mn2+可激發(fā)酶活性，nsp15-Mn2+結合作用較弱，但這種結合可使蛋白構象發(fā)生顯著變化。最早認為是巢病毒目病毒復制復合體的組分。后來發(fā)現(xiàn)，nsp15缺陷的冠狀病毒在成纖維細胞中，也可以復制和存活，滴度甚至與野生型無異。EndoU介導病毒雙聯(lián)RNA逃避宿主巨噬細胞中傳感器的識別。病毒nsp15/EndoU在致病中的作用，以及作為藥物和疫苗設計的靶標。

CoV E蛋白(Envelope，E)：76～109個氨基酸，分子量8.4～12kDa，膜整合蛋白，參與冠狀病毒生活史如病毒組裝、出芽、包膜形成和致病。對其結構模體、拓撲結構、離子通道(viroporin)，與病毒及宿主細胞蛋白質的研究較多。冠狀病毒E蛋白經歷多種蛋白質翻譯后修飾。其中IBV、SARS-CoV、MHV和CoV E蛋白被棕櫚?；?。而棕櫚酰基化的靶標是TMDs附近的半胱氨酸殘基。即MHVA59 E蛋白半胱氨酸雙突變或者三突變?yōu)楸彼岷螅纬蒝LP的能力降低。驗證MHVE蛋白三突變后不穩(wěn)定，容易降解，突變菌株的產量降低，說明E蛋白在MHV病毒組裝中必不可少。提示IBV E蛋白棕櫚?；挥绊懚ㄎ坏礁郀柣w，因為半胱氨酸突變的E蛋白與野生型蛋白，在定位方面無差異。證明SARS-CoV E可以被泛素化，但是功能未知。SARS-CoV nsp3與E共定位，nsp3 N-端泛素樣功能域-1介導其相互作用。E蛋白可以被泛素化，而且泛素化狀態(tài)與穩(wěn)定性和半衰期負相關。SARS-CoV輔助蛋白8b表達較晚，可能下調E蛋白產生，調控病毒的產生，維持病毒滴度。IBV E蛋白腔N-端有一個糖基化位點，SARSCoV E預測有兩個糖基化位點。寡糖與保守序列Asn-X-Ser/Thr上的天冬酰胺殘基連接(N-連接糖基化)。糖基化修飾有利于招募宿主分子伴侶如鈣連蛋白和鈣網蛋白，幫助病毒或者宿主細胞蛋白質正確折疊和運輸。S蛋白和E蛋白具有三半胱氨酸模體[11]。即E蛋白氨基末端后(NH2- … L-Cys-A-Y-Cys-Cys-N …-COOH)以及S蛋白C-端(NH2- … S-CysG-S-Cys-Cys-K … -COOH)。這些模體可能是E和S相互作用的基礎，形成二硫鍵。CoV結構蛋白中，M和E蛋白相互作用的研究比較透徹。共表達M和E足以形成和釋放VLP。介導相互作用的是兩者的C-端，相互作用位于ERGIC細胞漿一側。如果耗盡這些功能域，VLPs產量迅速降低。

CoV E蛋白可以相互作用，寡聚化，形成病毒離子通道-病毒孔蛋白。這與TMD有關。合成對應SARS-CoV E TMD的肽段，可以形成二聚體、三聚體、五聚體。與此相關的殘基為天冬酰胺15(N15)、纈氨酸25(V25)。缺乏E的CoV可望作為疫苗。

有些CoVs形成完整、有感染性的病毒粒子，不需要全部結構蛋白。這也提示有些結構蛋白的功能可能冗余，或者具有結構蛋白之外的功能，比如參與病毒復制。S蛋白介導病毒與宿主細胞表面受體黏附、病毒和宿主細胞膜融合，有利于病毒進入宿主細胞。同時，也可能介導與鄰近未感染細胞融合。病毒在細胞之間擴散可能與形成巨大的多核合胞體(syncytia)有關，破壞中和病毒的抗體。N蛋白主要結合CoV RNA基因組，形成核衣殼。N定位到內質網-高爾基體(Endoplasmic reticulum (ER)-Golgi region)與其組裝和出芽有關。瞬間表達N蛋白可以大量增加有些CoVs產生病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLPs)，提示N蛋白在包膜形成中的功能，但與完整病毒粒子形成的相關性不大。SARS-CoV核衣殼蛋白N干擾宿主RIG-I泛素化。MERS-CoV和SARS-CoV蛋白N特異性表位誘導呼吸道記憶CD4+T細胞，具有免疫保護功能。M蛋白豐度最高，但是負責確定病毒包膜的形狀，是CoV組裝的核心組織者，與冠狀病毒的其他結構蛋白相互作用。S蛋白與M蛋白相互作用，是將S蛋白滯留在內質網-高爾基體過渡空間/高爾基復合體(ER-Golgi intermediate compartment，ERGIC)/Golgi complex，以及摻入病毒粒子所需，但S蛋白不是病毒粒子組裝所必需。M與N結合，穩(wěn)定病毒粒子核衣殼，以及病毒粒子內部核心，最后完成病毒組裝。病毒的多數(shù)蛋白位于胞內運輸途徑即內質網、高爾基體和ERGIC，參與CoV組裝和出芽。E在病毒繁殖和組裝中發(fā)揮作用。缺乏E的重組CoVs病毒滴度明顯減少，病毒成熟受損，子代不完全。

冠狀病毒可以利用宿主的泛素化與去泛素化修飾系統(tǒng)，甚至編碼自己的泛素/去泛素酶，調控蛋白質翻譯后修飾，驅動病毒生活史。MERS-CoV nsp3去泛素酶抑制宿主免疫應答。nsp3本來防止ADP核糖基化的大功能域突變后，病毒的毒性降低。S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methioline,SAM)與nsp16(2-O-甲基轉移酶)結合，促進MERS-CoV復制，招募來更多別構激活因子在冠狀病毒中相對保守的nsp10。

2.2 與冠狀病毒基因組復制或者基因表達相互作用的宿主因子

相對于其他正鏈RNA病毒，參與冠狀病毒復制的宿主因子的研究甚少。與冠狀病毒進入細胞有關的宿主受體研究提示冠狀病毒復制循環(huán)的第一步是進入靶細胞，如氣管上皮細胞，特別是纖毛上皮細胞和肺泡II型肺細胞。其他與致病有關的包括浸潤免疫細胞如巨噬細胞、嗜中性粒細胞、樹突狀細胞(Dendritic cell,DC)。其中DC還可以進一步分為髓型DC(Myeloid-type DC，mDC)和漿型DC(pDC)。兩種DC都是清除病毒的關鍵。激活的pDC產生大量I型IFN，提示附近細胞有感染。mDC產生I型IFN量不如pDC，可以分泌激活B細胞和T細胞需要的趨化因子，在適應性免疫中非常關鍵。感染冠狀病毒S糖蛋白與宿主細胞表面的蛋白質受體識別并結合。其中冠狀病毒S蛋白是1型糖蛋白，1160～1400個氨基酸，由S1和S2亞基組成，在病毒粒子表面是三聚體，furlin蛋白負責在裂解位點RRXRR處切開S1和S2。S1區(qū)參與受體結合，含有可以作為受體結合功能域(Receptor-binding domain，RBD)的N-和C-端功能域(S1-NTD和S1-CTD)，提示決定細胞嗜性(Cell tropism)的主要功能在S1-CTD。S2區(qū)形成刺突三聚體的莖，激發(fā)病毒包膜和靶細胞膜融合。S1-NTD與宿主細胞表面聚糖(Glycan)相互作用，有利于病毒結合和進入。基于betacoronavirus S1-NTD晶體結構，以及其他冠狀病毒S1-NTDs的序列保守性，所有冠狀病毒S1-NTDs具有半乳糖凝集素折疊，介導結合唾液酸如N-糖基神經氨酸(N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc)，N-乙酰神經氨酸(N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac)和/或5-N-乙酰-9-O-乙酰神經氨酸 (5-N-acetyl-9-Oacetylneuraminic acid、Neu5、9Ac2) 。例外是小鼠肝炎病毒(Murine hepatitis virus，MHV)S1-NTD，結合癌胚抗原相關細胞黏附分子1(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1，CEACAM1)的N-端D1功能域，免疫球蛋白超家族的I型膜蛋白。進入細胞，大多數(shù)alphacoronavirus的S1-CTDu氨肽酶N(Aminopeptidase N，APN，也稱為CD13)相互作用。但alphacoronavirus HCoV-NL63利用另一個I型糖蛋白血管緊張素轉化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)。ACE2是金屬蛋白酶，屬于I型跨膜糖蛋白，具有羧肽酶活性，在調節(jié)心、腎功能以及控制血壓中起關鍵作用。人類ACE2的細胞外區(qū)域由2個亞基組成，其中鋅金屬肽酶區(qū)域可以進一步分成2個亞域(I和II)，形成一個長而深的裂縫，ACE2的N-端細胞外功能域有兩個alpha-helical。ACE2也是動物betacoronavirus SARS-CoV的受體。人、哺乳動物與鳥類ACE2分子僅少數(shù)位置氨基酸有差異，研究這些細微差別是冠狀病毒宿主特異性以及種間跳躍突變的重要線索。SARS-CoV RBD中Asn479、Thr487位的氨基酸對RBD-ACE2的親和力至關重要，其突變能夠調控RBD與不同宿主ACE2的結合力。betacoronaviruses MERS-CoV和蝙蝠HKU4利用另外一個二肽基肽酶4(屬于絲氨酸蛋白酶家族，Dipeptidyl peptidase 4，DPP4，也稱CD26)作為受體。DPP4廣泛分布于上皮組織和內皮組織內部，通常通過裂解激素和趨化因子的N末端肽鍵而改變其活性，改變機體或細胞的葡萄糖代謝、免疫應答、黏附和凋亡等過程。MERS-CoV S蛋白對人DPP4親和力高，HKU4 S蛋白結合DPP4親和力更高。肽酶抑制劑不影響病毒進入，提示SARS-CoV和MERSCoV受體和進入不依賴受體的肽酶活性，只依賴結合特定宿主受體。DC-SIGN(Dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin)是巨噬細胞和樹突狀細胞表達的C型凝集素，也稱CD209，可以識別常見的病毒及細菌的高度甘露糖糖基化分子。冠狀病毒的S蛋白高度糖基化，可以結合DC-SIGN。貓傳染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus，F(xiàn)IPV)也屬于冠狀病毒，感染單核細胞和巨噬細胞后導致全身擴散。表達外源性DCSIGN的非易感細胞可能變得易感。I型和II型FIPV都能以DC-SIGN為共受體或替代受體，且不依賴唾液酸。

胞外細胞表面結合和/或溶酶體蛋白酶在冠狀病毒進入宿主細胞中發(fā)揮作用，因為其激活S蛋白的融合活性。細胞表面結合的跨膜絲氨酸蛋白酶2(Cell surface-associated transmembrane protease,serine 2，TMPRSS2)切割S蛋白，激發(fā)SARS-CoV與細胞膜融合。TMPRSS2也是切割和激活HCoV-229E和MERSCoV S蛋白所需條件。內吞過程，早期內吞體(Early endosome)中的SARS-CoV S蛋白被溶酶體組織蛋白酶L和P切割，病毒包膜與內吞體膜融合，病毒RNA釋放到被感染細胞的細胞漿。過程與MERS-CoV進入細胞的機理類似。抑制細胞蛋白酶furin后，MERS-CoV不能進入細胞，但是SARS-CoV能夠進入，提示furin介導的切割是MERS-CoV有效進入的關鍵。MHV A59與晚期溶酶體融合，切割S蛋白依賴晚期溶酶體中較低的pH。不同冠狀病毒為何分別與早期或者晚期溶酶體融合，以及宿主嗜性和致病性的關系，目前尚不清楚。S蛋白切割機理也比較復雜。MERS-CoV進入依賴產病毒細胞中furin介導的切割，切割后的MERS-CoV S蛋白被受體細胞的蛋白酶加工，病毒粒子經內吞體進入細胞，或者與細胞漿膜融合。含有未切割S蛋白的MERS-CoV病毒粒子則與晚期溶酶體融合。

宿主蛋白酶是多種B型病毒進入宿主細胞的重要屏障。繞過該屏障可使B型病毒通過未知受體進入人類細胞。冠狀病毒S蛋白與宿主細胞表面受體的結合是宿主嗜性的關鍵決定因素。SARS-CoV S蛋白的RBD的少數(shù)突變(N479L和T487S)足以影響與人ACE2的親和力。MERS-CoV S蛋白較蝙蝠HKU4 S有兩個突變，則可以結合人DPP4受體，但不能介導進入，因為不能被人蛋白酶激活。MERS-CoV S蛋白的兩個突變(S746R和N762A)可以被人蛋白酶切割，病毒可以進入人細胞，這可能與動物轉移MERS-CoV有關。

幾個株系的乙型冠狀病毒表面攜帶血凝素-酯酶(Hemagglutinin-esterase，HE)。HE蛋白含有凝集素結合功能域，介導與O-乙?；僖核峤Y合，也具有唾液酸-O-乙酰酯酶受體破壞酶活性，防止黏附到非許可細胞，HE也有利于結合主要受體后進入靶標細胞。

2.3 冠狀病毒復制需要修飾宿主細胞膜

正鏈RNA病毒的RNA合成發(fā)生在細胞漿，結合病毒誘導的細胞內膜派生結構。已知正鏈RNA病毒誘導的膜復制相關結構有兩種。一種是單層膜結構，在細胞器如內質網、過氧化物酶體、內吞體的膜上形成一個向內彎曲的小球，具體是哪種細胞器，視病毒類型不同而異。病毒復制機器位于這些小球內，RNA產物通過連通小球內側和細胞漿的通道向外輸送，參與翻譯或者組裝病毒顆粒組裝。黃病毒和甲病毒誘導形成這種單層膜的復制細胞器。另一種是雙層膜小泡(Double-membrane vesicles，DMVs)，一般伴隨其他結構如小管、折疊的內質網或者卷曲的膜，一起在細胞漿形成網狀管系統(tǒng)。小RNA病毒、動脈炎病毒和黃病毒樣丙肝病毒誘導類似結構。病毒nsps具有跨膜區(qū)，或者以其他方式錨定到膜上，驅動形成這些結構。冠狀病毒的nsp3、nsp4和nsp6參與形成這些結構。

關于參與冠狀病毒復制細胞器形成的宿主因子和途徑的假說和數(shù)據(jù)很多，但尚無定論。內質網膜參與是目前普遍接受的。病毒誘導的雙層膜結構表面或者內部具有核糖體和內質網標記分子如sec61α和蛋白質二硫鍵異構酶(Protein disulphide isomerase，PDI)也支持這個觀點，冠狀病毒誘導的DMV外膜與內質網池(ER cisternae)是一個連續(xù)體。鑒于與ER的聯(lián)系，有人提出包括依賴外被體蛋白(Coatomer protein，COP)及相關因子如GBF-1途徑的分泌途徑在復制中發(fā)揮重要作用。目前尚未找到冠狀病毒誘導的膜結構的標記分子nsp4和分泌途徑標記分子的共定位證據(jù)。siRNA沉默篩選發(fā)現(xiàn)COPB2(β′-COP)抑制SARS-CoV復制。同一機器的組分COPB1和GBF1也嚴重影響SARS-CoV復制，證實分泌途徑的完整性對于病毒復制非常關鍵。磷脂酰肌醇4-激酶(Phosphatidylinositol 4-kinases，PI4K)對于正鏈RNA病毒復制非常重要。PI4K等激酶被招募到膜修飾位點，刺激產生PI4P脂類，支持形成病毒復制結構和功能發(fā)揮。PI4K異構體PI4KIIIbeta對SARS-CoV復制非常重要。其發(fā)揮功能主要是在病毒入侵細胞，而不是復制的后期。病毒的脂類囊膜可能與宿主細胞膜通過相溶性進行擴散。自噬體(Autophagosome)為雙層結構。冠狀病毒誘導形成雙層結構，提示自噬可能被冠狀病毒劫持來進行復制。但是，有實驗表明自噬因子Atg5并非冠狀病毒在原代細胞中復制所需。ERED，膜運輸和自噬等可能都參與冠狀病毒復制。

2.4 冠狀病毒調控被感染細胞的翻譯和未折疊蛋白質應答[12]

真核細胞翻譯起始源于形成異三聚體eIF2復合體。該復合體包括α-亞基，結合tRNA的β-亞基和結合GTP的γ-亞基。eIF2復合體負責在40S亞基上裝載Met-tRNAi。結合mRNA后，43S復合體作為骨架，招募其他幾個蛋白質，包括eIF3，到5′加帽的mRNA。隨后，結合了帽子的真核翻譯起始因子4F(eukaryotic translation initiation factor 4F，eIF4F)也添加到48S起始前復合體(pre-initiation complex)，從5′到3′到掃描mRNA，定位翻譯起始密碼子(Translation initiation codon)。此后，60S核糖體亞基加入，蛋白質合成起始。結合到mRNA poly(A)尾部的多聚腺苷結合蛋白(Polyadenine-binding protein，PABP)也參與激發(fā)蛋白質合成。外界不同刺激可以分別激發(fā)哺乳動物4個激酶，磷酸化alpha亞基(eIF2α)，失活eIF2復合體。這四個激酶是：eIF2α激酶4(eIF2α kinase 4，也稱GCN2)，血紅素調控的抑制分子(Heme-regulated inhibitor，HRI)，ER脅迫時被激活的PKR樣內質網激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)和雙鏈RNA激活的蛋白激酶(Double-stranded (ds) RNAactivated protein kinase，PKR)。

宿主細胞的蛋白質翻譯機器既是病毒復制所需，也是宿主抗病毒應答的關鍵。正鏈RNA病毒需要限制宿主合成mRNAs，有利于病毒蛋白質合成。冠狀病毒復制周期的多個階段都與內質網結合。因此，冠狀病毒感染時，可能導致內質網脅迫。表達冠狀病毒的幾個蛋白質如S蛋白，可以誘導內質網脅迫，與冠狀病毒感染的細胞的表型一樣。隨后誘導未折疊蛋白質應答(Unfolded protein response，UPR)，減輕PERK誘導的eIF2α磷酸化造成的翻譯抑制，刺激蛋白質折疊，激發(fā)凋亡。冠狀病毒控制UPR的機理遠沒HCV的研究透徹。冠狀病毒感染可能以控制PERK活性為主來調控翻譯水平。PKR是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Serine/threonine protein kinase)，被RNA病毒感染的標志物dsRNA激活，是針對RNA病毒感染的先天免疫的重要分子，上調抗病毒基因表達，包括產生干擾素(Interferons，IFNs)。冠狀病毒以各種方式抵消PKR介導的信號傳導，防止因為eIF2α磷酸化而關閉翻譯。雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)通過激活PKR，以及誘導生長阻斷和DNA損傷誘導的34蛋白(Growth arrest and DNA-damage-inducible 34 protein，GADD34)弱拮抗PKR，降低IBV-感染細胞中eIF2α磷酸化。MHV感染時，持續(xù)eIF2α磷酸化和阻遏GADD34表達導致抑制細胞mRNA的翻譯，有利于MHV感染。MERS-CoV ORF4a可能與病毒dsRNA結合，防止被PKR檢測到，拮抗PKR-誘導的形成脅迫顆粒(Stress granule)，防止翻譯抑制。傳染性腸胃炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)調控宿主細胞翻譯。其蛋白7與蛋白磷酸酶1相互作用，促進eIF2α去磷酸化。PP1是宿主抗病毒應答的關鍵調節(jié)因子。SARS-CoV和IBV的S蛋白與eIF3F相互作用，調控宿主翻譯，包括后期促炎癥細胞因子白細胞介素6和8的表達。這種相互作用可能在冠狀病毒致病機理中發(fā)揮重要調控功能。

除調控eIF2α磷酸化，冠狀病毒也通過其他方式調控宿主的翻譯機器。alpha-和betacoronaviruses病毒的nsp1蛋白抑制翻譯起始的多個步驟。SARSCoV nsp1抑制48S起始復合體形成，干擾其轉變?yōu)?0S起始復合體。SARS-CoV nsp1多功能，可以直接結合40S核糖體亞基并抑制其在翻譯中的功能。nsp1-40S亞基復合體誘導切割宿主細胞mRNA如IFN-β mRNA，更大范圍地阻遏細胞翻譯，但是也有報道誘導大量IFN-β。MERS-CoV nsp1選擇性抑制細胞核產生的mRNAs的翻譯，但是不影響細胞漿中產生的病毒mRNAs的翻譯。MERS-CoV nsp1不與40S核糖體亞基結合。病毒的翻譯調節(jié)因子(translation modulator)與致病有關。

宿主環(huán)孢親和素(Cyclophilin)：環(huán)孢菌素A(Cyclosporin A，CsA)是免疫抑制劑，結合細胞環(huán)孢親和素(cyclophilins，Cyps)，形成Cyp-CsA復合體，抑制鈣調磷酸酶活性。其阻止細胞核因子活化的T細胞(nuclear factor of activated T cells，NF-AT)去磷酸化，從細胞漿轉位到細胞核，阻止免疫基因如IL-2的轉錄。已經鑒定的17個Cyps中，9個是CsA靶標。Cyps也是肽?；滨；悩嬅?peptidylprolyl isomerases，PPIases)，許多還具有分子伴侶和折疊酶活性，有利于蛋白質折疊。Cyps參與各種信號途徑，凋亡、RNA剪切。環(huán)孢親和素，尤其是細胞漿CypA和結合內質網的CypB，是許多RNA病毒復制周期組分，也是必需的宿主組分。(1) Cyps是重塑細胞膜為HCV復制細胞器必需；(2) CypA幫助HCV多聚蛋白加工；(3) 低水平CypA穩(wěn)定HIV-1衣殼，確保進入細胞核，以免病毒粒子在細胞漿中變得不穩(wěn)定。Alisporivir(DEB-025;Debio-025) 是環(huán)孢親和素CsA類似物，具有高效的抗丙型肝炎病毒(HCV)活性，但沒有母核的免疫抑制活性。這說明環(huán)孢親和素在HCV復制中的作用，以及成靶性。微摩爾濃度CsA或Alisporivir可以抑制很多冠狀病毒如SARS-CoV、HCoV-229E、MHV、HCoVNL63和FCoV。線粒體CypD是線粒體通透性孔(permeabilization transition pore)的一部分，參與豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)和HCoV-NL63誘導的半胱天冬酰胺酶非依賴性凋亡，CsA可以抑制該過程。質譜和酵母雙雜交都證實CypA與SARS-CoV N 蛋白相互作用。酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)多個Cyps(CypA、CypB、CypH和CypG)及相關PPIases(FK506-binding protein 1A和1B)可能結合SARS-CoV nsp1。Caco-2或Huh7細胞中，shRNA-介導敲除CypA，表達降低到正常水平的3%，幾乎可以完全阻斷HCoV-NL63復制，降低HCoV-229E 復制＞1log。影響CypA穩(wěn)定性和功能的單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphisms)可以降低不同HCoV-229E復制。Cyps主要作用在NF-AT信號途徑。Cyp抑制劑可以作為工具藥物，探索宿主因子在冠狀病毒復制中的作用，但是作為宿主靶向治療(host-directed therapeutics)冠狀病毒感染尚缺乏證據(jù)。

冠狀病毒RNAs 5′-和3′-近端區(qū)域含有其RNA合成的關鍵調控元件。RNA-結合蛋白常可以作為冠狀病毒基因組復制的增強子。冠狀病毒基因組兩端折疊為高階RNA結構，穩(wěn)定該分子，參與分子內部和分子間相互作用，有利于病毒復制。病毒和宿主的蛋白質結合這些結構，驅動或者調控翻譯、復制和亞基因組RNA合成(表2)。

宿主細胞蛋白polypyrimidine tract-binding protein(PTB;or heterogeneous ribonucleoprotein protein(hnRNP) I)結合TGEV和MHV基因組的5′前導序列(leader sequence)。PTB結合MHV 5′-五核苷酸UCUAA重復序列UCUAA，是RNA合成的關鍵。HnRNP Q或SYNCRIP也結合MHV基因組的5′-端，如果敲除，MHV RNA合成和病毒復制減少。鋅指 CCHC-型和RNA-結合模體(zinc finger CCHCtype and RNA- binding motif 1，MADP1)結合SARSCoV和IBV基因組的5′端。MAPD1沉默也干擾病毒RNA合成，減少IBV復制。除了結合冠狀病毒RNA 5′- UTR(5′-untranslated region)的蛋白質。5′-UTR約310 nucleotides(nts)，含前導序列(leader sequence)和轉錄調控序列(transcription regulatory sequence，TRS)，具有巢病毒目都保守的核心TRS模體(core-TRS motif)5′-CUAAAC-3′。也有蛋白質結合3′UTR和/或poly(A)-尾。比如線粒體順烏頭酸酶(mitochondrial aconitase)，被heat-shock protein (hsp)40、hsp60和mitochondrial hsp70復合體所穩(wěn)定，結合MHV 3′ UTR 位于poly(A)尾上游3′-端42核苷酸。P100輔助激活因子(p100 coactivator)結合TGEV′UTR和/或poly(A) 尾。PABPs與TGEV、BCoV和IBV基因組相互作用，促進其有效復制。PABPs結合病毒RNA確保有效翻譯和mRNA穩(wěn)定。RNA-親和純化和質譜發(fā)現(xiàn)幾個hnRNPs結合TGEV基因組3′-端約500核苷酸。RNA結合蛋白可能在復制酶基因翻譯時，調控冠狀病毒ORF1a/1b移碼。annexin A2結合IBV滑動序列(slippery sequence)。該滑動序列是核糖體停滯和參與ORF1b表達所需。宿主蛋白也可能間接影響病毒RTC活性。

2.5 冠狀病毒復制需要的宿主因子的系統(tǒng)生物學研究[13]

包括轉錄組學、代謝組學、蛋白質組學和功能基因組學等在內的系統(tǒng)生物學方法將感染系統(tǒng)作為整體考慮，優(yōu)點是無偏好，可以鑒定冠狀病毒復制需要的蛋白質、細胞途徑。芯片研究SARS-CoV-感染的外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell)，上調的細胞因子有IL-8、IL-17，激活巨噬細胞和凝血途徑。肺部組織尸檢也提供了SARS-CoV感染的病理，尤其是炎癥和細胞因子應答。MHV-JHM感染培養(yǎng)的中樞神經系統(tǒng)細胞中，126個基因差異表達。其中大多數(shù)是調控胞內先天免疫如NF-κB信號通路和IFN信號傳導。MHV-A59-感染的L細胞中，趨化因子、RNA和蛋白質代謝、凋亡等途徑差異表達。芯片分析發(fā)現(xiàn)MHV感染的LR7細胞下調包括蛋白質翻譯相關許多基因的轉錄，提示感染時，因為脅迫應答和mRNA降解(mRNA decay)，宿主關閉了蛋白質翻譯系統(tǒng)。mRNA水平和蛋白質豐度未必直接相關。轉錄水平的結果還需要用其他實驗，如細胞蛋白質水平進行驗證。

相互作用組酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)冠狀病毒RNA聚合酶復合體的亞基BTF3和ATF5、細胞色素氧化酶II(NADH 4L)與SARS-CoV nsp10相互作用。當然，這個結果還需要在SARS-CoV-感染細胞中進行驗證。SARS-CoV helicase (nsp13)與DDX5相互作用，DDX1與SARS-CoV和IBV nsp14相互作用，促進IBV復制。DDX1調控sg mRNA合成。該過程受GSK-3-介導的N 蛋白磷酸化調控。分析14 個SARS-CoV ORFs 及片段與宿主相互作用發(fā)現(xiàn)：nsp1與包括CypA在內的免疫親和素家族相互作用。細胞E3泛素連接酶RCHY1與SARS-CoV nsp3 SUD(SARS unique domain)功能域相互作用，可能參與下調抗病毒因子p53。SUD蛋白能夠特異結合宿主mRNA 3′-不譯區(qū)廣泛具有的GGGG序列，提示SUD可能參與調控宿主mRNA代謝[14-18]。

表2 與不同冠狀病毒RNA相互作用的RNA結合蛋白

穩(wěn)定同位素標記的氨基酸細胞培養(yǎng)(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)是一種基于質譜的蛋白質組學技術，可以確定兩種實驗條件下樣品中蛋白質豐度，比如感染和未感染細胞。SILAC研究發(fā)現(xiàn)IBV感染上調NF-κB和AP-1依賴性途徑。SILAC結合pull-down和質譜技術，研究表達IBV N蛋白的293T相互作用組，得到142個細胞蛋白質。其中許多蛋白質與RNA相互作用，如核糖體和核仁蛋白質，螺旋酶，以及hnRNP。

基于SILAC的定量蛋白質組學(SILAC-based quantitative proteomics)比較表達SARS-CoV復制子的BHK-21細胞，找到宿主蛋白質43個上調，31個下調。許多細胞過程的多功能調控因子BAG3也被上調。敲除實驗證明，SARS-CoV和其他病毒有效復制需要BAG3。下調的有參與蛋白質翻譯和信號傳遞的蛋白質Cdc42和RhoA。基于SILAC的定量蛋白質組學研究高爾基體富集的亞細胞組分發(fā)現(xiàn)MHV感染耗盡幾個分泌途徑的蛋白質，富集核糖體蛋白質。SiRNA-介導敲降其中3個蛋白質：C11orf59、GLG1和sec22b后，感染性子代病毒的復制或釋放增加，過量表達這些蛋白質則具有相反效應。宿主細胞分泌途徑對于冠狀病毒復制很關鍵。蛋白質組分析純化的SARS-CoV病毒粒子發(fā)現(xiàn)，除nsp2(各冠狀病毒中變異較大)，nsp3(各冠狀病毒中變異較大)和nsp5等病毒蛋白外，病毒粒子還結合有172個宿主蛋白質。其中有幾個是COPI途徑的蛋白質，與病毒粒子形成途徑(ERGIC)吻合。SARS-CoV nsp2可與宿主蛋白抑制素1(prohibitin 1，PHB1)和抑制素2(prohibitin 2，PHB2)相互作用。在病毒感染過程中，可能破壞宿主細胞信號通路。

系統(tǒng)遺傳學方法：利用一組雜交小鼠，篩選影響SARS-CoV感染結局的宿主位點發(fā)現(xiàn)E3泛素連接酶Trim55是重要決定因子。Trim55在血管套和炎癥中發(fā)揮重要作用。MERS患者免疫和炎癥應答相關的遺傳背景與病毒毒株共同決定了感染結局。比較不同MERS-CoV分離株對宿主細胞的轉錄組影響發(fā)現(xiàn)，病毒PLpro和ORF4a參與免疫逃避，影響宿主STAT3途徑，對肺部炎癥和細胞修復有影響。這些效應主要出現(xiàn)在感染后期。

蛋白激酶是信號傳導的關鍵調控因子，控制許多細胞過程，在許多正鏈RNA病毒的復制周期中發(fā)揮作用。激酶組siRNA(kinome-wide siRNA)篩選發(fā)現(xiàn)許多宿主細胞激酶影響SARS-CoV復制，其中包括40個有效促進病毒復制的"proviral"蛋白質。如復雜脂類代謝和早期分泌途徑(COPI-coated vesicles)?？共《拘牡鞍踪|包括PKR和CDK6。相比其他病毒，更多蛋白質參與SARS-CoV復制，這也說明宿主細胞對SARS-CoV復制的影響大。p38 MAPK途徑調控IL-6，IL-8和IL-10介導的促炎癥細胞因子信號傳遞。網格蛋白介導的內吞和運輸?shù)饺苊阁w對于MHV融合、進入很關鍵，溶酶體蛋白酶是該過程所需條件。綜合利用CRISPR/Cas9-介導的基因組編輯(genome editing)或單倍體遺傳篩選(haploid genetic screen)等技術，與系統(tǒng)生物學技術結合，可以鑒定更多冠狀病毒復制所需的宿主細胞因子。

2.6 冠狀病毒誘導宿主細胞周期失控

負責細胞分裂的細胞周期被嚴格調控，分為G1，S，G2和M。細胞存活、防止不受控制的細胞分裂都需要調控細胞周期。周期蛋白依賴的蛋白激酶(cyclin-dependent protein kinases，CDKs)有序控制細胞周期。細胞周期進行需要周期蛋白調控亞基激活不同CDK。進入DNA復制，CDK/cyclin復合體磷酸化，激活或失活其靶蛋白，協(xié)調進入下一輪周期。類似其他病毒，冠狀病毒大量調控、阻遏細胞周期進行，受益于被阻斷的生理狀態(tài)。IBV-感染細胞阻遏在S期，激活細胞DNA損傷應答，對病毒復制有利。因為S期上調DNA復制所需蛋白質，病毒可以招募到細胞漿。例如與冠狀病毒nsp14相互作用的細胞DExD/H家族的RNA螺旋酶(RNA helicase)DDX1被冠狀病毒劫持，用來增強其復制。SARS-CoV nsp14近C端區(qū)域有鳥嘌呤-N7-甲基轉移酶活性，在RNA加帽過程中起重要作用，其活性依賴nsp14近N端核酸外切酶活性區(qū)域。DDX1也與IBV N蛋白相互作用，與MHV-JHM N蛋白的磷酸化形成復合體，有利于平衡合成sg mRNA和基因組RNA。冠狀病毒nsp15相互作用并抑制抑癌蛋白視網膜母細胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，pRb)，平時被pRb阻遏的蛋白質的表達增加，進入S期的細胞增多。類似效應在MHV感染細胞中也存在，G1期進入S期所需要的的pRb低度磷酸化被降低。過量表達SARS-CoV 3a蛋白導致G1阻斷，抑制細胞增殖。

MHV感染下調cyclin-dependent kinase 6(CDK6) ，在病毒誘導的促進病毒復制的細胞周期阻遏在G0/G1期發(fā)揮作用。SARS-CoV類似效應，過量表達N 蛋白，降低CDK4CDK6激酶活性，限制細胞周期推進。CDK6激酶參與細胞周期從G1推進到S期，耗盡CDK6導致細胞周期阻斷在G1期。

部分冠狀病毒誘導p53，將細胞周期阻斷在S或G2/M期。TGEV N 蛋白激活p53，積累細胞周期相關激酶如cdc-2和cyclin B1。同步在S或G2/M期的細胞有利于TGEV RNA和病毒產生，以及IBV復制。MHV nsp1也具有類似機制。nsp1激活p53，提高p21水平，降低CDK2-cyclin E水平。pRb滴度磷酸化和G1細胞周期阻斷。SARS-CoV感染導致減少p53表達水平。為了抵消p53的抑制效應，SARS-CoV nsp3(分子量＞200kDa，具有poly(ADP-ribose)結合功能域，蛋白酶、去泛素酶和de-ISGylase功能域)穩(wěn)定E3連接酶RCHY1，降低其表達。RCHY1介導p53泛素化并降解。但是，調控細胞周期、病毒復制和/或致病的具體機理仍然不清楚。缺乏p53表達的細胞，SARS-CoV復制被明顯增強。SARS-CoV或HCoV-NL63 PL2pro降解p53，抵消p53的作用。PL2pro去泛素化，促進降解p53，降低p53-介導的抗病毒免疫應答。

2.7 宿主對冠狀病毒的先天免疫應答以及病毒的對抗策略

宿主先天免疫試圖遏制病毒復制。病毒采用多種策略逃避宿主免疫應答。宿主細胞漿中正鏈RNA病毒復制中間體dsRNA 和5′-三磷酸RNA分子可以激發(fā)免疫。幾乎所有細胞的細胞漿中都存在Rig-Ilike receptor(RLR)家族感受器如retinoic acid-inducible gene 1(RIG-I)、病毒感染時合成2′,5′-寡腺苷酸的2′,5′-寡腺苷酸合成酶(2′,5′-oligoadenylate(2～5A) synthetases，OAS)和黑色素瘤分化相關蛋白質5 (melanoma differentiation-associated protein 5，MDA-5)負責識別dsRNA和5′-三磷酸RNA分子。2～5A結合和激活RNase L。RNase L是宿主核糖核酸酶，負責全局降解宿主和病毒的RNA。細胞表面的TLR或者免疫細胞內吞體中的TLR如TLR3、TLR4也可以識別病毒核酸或者蛋白質。SARS-CoV M 蛋白被TLRlike途徑識別，與標準的TRAF3-介導的信號途徑獨立，隨后激活轉錄因子IRF3，IRF7(IFN-regulatory factor 3 and 7)和NF-κB，表達并分泌I型IFN和促炎癥細胞因子，后者反饋激活JAK-STAT信號通路，誘導表達諸多具有抗病毒功能的干擾素刺激基因(interferon-stimulated genes，ISGs)，被感染細胞進入抗病毒狀態(tài)。ISGs靶向病毒復制周期的幾乎所有步驟，限制病毒復制。p38絲裂原活化的蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，MAPKs)參與誘導炎癥細胞因子IL-6和IL-8，參與抗病毒感染。IBV誘導p38 MAPK的負調控因子-雙特異性磷酸酶1(dualspecificity phosphatase 1，DUSP1)，拮抗IL-6和IL-8表達。尚不知曉IBV病毒具體哪個(些)分子導致上述效應。整個信號通路的多個節(jié)點如RIG-I、TANK結合激酶(TANK-binding kinase 1，TBK1)和TNF受體相關因子(TNF receptor-associated factor 3，TRAF3)都可能受到磷酸化、泛素化等翻譯后修飾的調控，如Lys63-泛素化。

先天免疫涉及包括細胞因子、趨化因子、補體、巨噬細胞、樹突狀細胞等組成的復雜網絡，旨在阻止病毒進入和繁殖。但病毒也共進化出逃避/阻斷宿主先天免疫的組分。這些組分用來避開宿主免疫監(jiān)視，操縱宿主先天免疫應答。

冠狀病毒感染中，先天免疫的作用體現(xiàn)在至少3個方面：重癥SARS患者伴隨先天免疫信號傳遞異?；蛘哌^度活化，肺部產生更多干擾素和促炎癥細胞因子如L-1、IL-6、IL-8、CXCL-10和TNF-α。不同MERS-CoV 分離株(MERS-CoV Eng 1 vs.SA 1) 感染人培養(yǎng)細胞的轉錄組發(fā)現(xiàn)，病毒序列差異和先天免疫逃避有關，導致的免疫應答不同。隨后，STAT3差異激活導致IFN、NF-κB和IRF的活化或者抑制。冠狀病毒利用復雜機制使病毒復制機器(viral replication machinery)避開宿主細胞漿中先天免疫感受器的監(jiān)視。除復制細胞器對病毒PAMPs的保護外，冠狀病毒也主動進攻或者躲避宿主的先天免疫應答。

病毒采用多種因子、多種途徑壓制宿主的先天免疫應答。除抑制細胞mRNA翻譯外，SARS-CoV nsp1降低被感染細胞中磷酸化STAT1(phosphorylated STAT1，p-STAT1)的量，以及IRF3二聚化，阻斷產生IFN相關的信號傳遞，影響細胞周期，但不誘導凋亡。其他alpha-和betacoronaviruses的nsp1蛋白(相對變化大)也抑制I型IFN信號傳遞，大多數(shù)冠狀病毒復制酶多聚蛋白N端亞基具有關閉宿主免疫應答的活性。Nsp1缺陷病毒對IFN更敏感，這也提示nsp1是IFN拮抗劑。但Nsp1拮抗先天免疫、選擇性降解宿主mRNA則還需要證據(jù)。生化證據(jù)表明，pp1a多聚蛋白更下游，許多冠狀病毒的papain-like protease 2 domain(PL2pro)和TGEV nsp3的PL1pro功能域，具有去泛素化酶(deubiquitination，DUB)活性。DUB活性可以除去先天免疫信號傳遞因子的泛素，阻止抗病毒狀態(tài)的產生，生化實驗證明SARS-CoV和MERSCoV PL2pro過量表達可以降低干擾素信號傳遞。MHV PL2pro去泛素化并結合TBK1，以及IRF3。

除了保守的復制酶，冠狀病毒其他輔助蛋白也可以壓制宿主先天免疫。這些蛋白質可能是不同病毒株系為此而從不同來源獲得的。細胞培養(yǎng)中，這些輔助蛋白并非必需。MHV ORF2a編碼的磷酸二酯酶(phosphodiesterase)ns2拮抗宿主RNAse L激活。這對于在天然宿主中復制非常重要。SARSCoV ORF3b和ORF6阻斷干擾素產生和信號傳遞。MERS-CoV ORFs 4a,4b和5也阻斷干擾素信號傳遞。SARS-CoV E蛋白是病毒編碼的離子通道-病毒孔蛋白(viroporin)，具有促進NLRP3炎癥體活性，影響炎癥進程，導致大量產生IL-1β，導致宿主免疫病理性變化。

ORF6是病毒-宿主相互作用的關鍵，調控胞內環(huán)境。調控感染過程中的進入細胞核的動力學(圖4)，病毒可以控制先天免疫、適應性免疫、凋亡和細胞脅迫應答網絡。ORF6是63aa的ER/Golgi膜蛋白，C-端尾部面向細胞漿，N-端位于ER腔或者ER膜。用IFN-β或IFN-γ處理，ORF6能夠阻斷STAT1/STAT2/IRF9和STAT1/STAT1復合體進入細胞核。ORF6減少可以抑制STAT1依賴的基因表達，這需要C-端10aa。ORF6招募細胞核進入因子到ER/Golgi膜。KPNA2特異性結合ORF6的C-端，將KPNA2滯留在ER/Golgi膜上，隨后，招募KPNB1到膜復合體，限制STAT1復合體進入細胞核必需的KPNB1的可利用度，結果是ORF6阻止STAT1復合體進入細胞核。KPNB1是經典的進入細胞核途徑的共同組分。ORF6因此可以影響其他信號途徑。ORF6阻斷含有經典入核信號的蛋白，但是對于不含這些經典入核信號的蛋白則無效。ORF6可以使一般無毒的MHV-A59毒性增加。MHV/ORF6病毒數(shù)量比野生型病毒多。MHV的輔助蛋白可能與逃避免疫監(jiān)視有關。細胞核轉運蛋白的水平隨細胞類型、年齡而不同，其可利用度與感染密切程度相關。

免疫應答是保護還是致??？宿主免疫系統(tǒng)涉及多個組織、細胞和分子，通過有效識別和去除致病菌，保護宿主應對感染。SARS-CoV感染嚴重程度與病毒特異性免疫應答相關，抑制肺泡巨噬細胞和不能有效激活樹突狀細胞，可以延緩病毒特異性免疫應答，加劇疾病。如果I型干擾素應答和炎癥性單核細胞-巨噬細胞應答失控，SARS-CoV感染小鼠產生致死性肺炎。如果抑制NF-κB介導的炎癥，SARS-CoV感染小鼠存活率則提高。IAV破壞宿主組織與過度激活NLRP3(NACHT,LRR and PYD domains-containing protein 3)，HMGB-1(highmobility group box 1 protein)，IL-1β有關。TNFSF10,HDAC4(histone deacetylase 4)，HDAC5表達與TNFα，NF-κB，cox-2(cyclooxygenase 2)水平負相關，其表達增加與預后良好相關。

2.8 細胞因子風暴和免疫病理的關系

圖4 產干擾素細胞(左)和含干擾素受體細胞(右)的信號通路。

如細胞因子和趨化因子應答迅速且協(xié)調，則可以作為先天免疫一線防御病毒感染。如果失控或者過量產生，則導致病理變化，稱為細胞因子風暴(cytokine storm)[19]。目前尚無SARS和MERS感染過程中，促炎癥細胞因子和趨化因子參與肺部病理的直接證據(jù)?；颊叩南嚓P性證據(jù)提示炎癥應答增加，與冠狀病毒致病有關。

SARS-CoV感染過程中的細胞因子和趨化因子應答，SARS-CoV主要大量感染呼吸道和肺泡上皮細胞，一般不易成功感染血液細胞如樹突狀細胞、單核細胞-巨噬細胞和其他PBMC衍生的細胞。SARSCoV感染后DCs產生低水平的抗病毒細胞因子IFNαβ，中等程度上調促炎癥細胞因子TNF和IL-6，明顯上調炎癥趨化因子CCL3、CCL5、CCL2和CXCL10。SARS-CoV-感染的巨噬細胞IFN和其他促炎癥細胞因子的產生延遲但增加。SARS-CoV-感染的呼吸道上皮細胞(airway epithelial cells，AECs)也大量產生CCL3、CCL5、CCL2和CXCL10。延遲但大量產生這些細胞因子和趨化因子導致針對SARS-CoV的先天免疫失控。與無并發(fā)癥的SARS患者比較，SARS重癥患者血清促炎癥細胞因子(IFN-γ、IL-1、IL-6、IL-12和TGFβ)和趨化因子(CCL2、CXCL10、CXCL9和IL-8)水平高。重癥SARS患者的抗炎癥細胞因子如IL-10水平很低。與健康人和中等程度患者比較，除了促炎癥細胞因子和趨化因子，致死性SARS患者水平增加的有IFN(IFN-α和IFN-γ)和IFN刺激基因(IFN-stimulated genes，ISGs)(CXCL10和CCL-2)。IFNs和ISGs可能參與SARS免疫病理。SARSCoV-感染的AECs，DCs和巨噬細胞的細胞因子、趨化因子應答失控或者增加，可能具有病理作用。SARS感染者血清中促炎細胞因子(IL-1β、IL-6、IL-12、IFN-γ、IP-10和MCP-1)的增加與SARS感染者肺部炎癥和廣泛的肺損傷有關。年齡影響感染結局，適應性免疫隨著年齡增加而降低。但是，先天免疫還需要研究，尤其是年輕人和老年人的病毒易感性相關SNP。SARS-CoV康復者才增加IFN-γ、IL-4、IL-10。SARS-CoV患者大幅上調IL-6。IL-6，IL-8和MCP-1(monocyte chemoattractant protein 1)和IP-10與疾病嚴重程度和死亡相關。芯片定量研究外周血單核細胞的細胞因子表達發(fā)現(xiàn)：所有感染者都提高促炎癥細胞因子表達，但是幾乎未見IFN-α或β表達增加。這可能是后兩者在被感染細胞中穩(wěn)定，或者IFN拮抗差異(SARS-CoV編碼大量誘導IFN的dsRNA，但是未見IFN產生)。SARS-CoV感染如何誘導細胞因子？與病毒致病機理有何相關？與疾病嚴重程度相關的標記分子目前包括人白細胞抗原I(human leukocyte antigen class I，HLA-I) (B*0703),HLA- II (DRB1*0301)，甘露糖結合蛋白(mannose binding protein)，OAS1，MxA。但是，樣本小且不容易獲得，所以較難重復。IL-12RB1，IFN-γ，rantes等多態(tài)性與SARS疾病嚴重程度相關。這些現(xiàn)象的機理，目前尚不清楚?？赡苡幸韵聨讉€方面：病毒編碼的蛋白直接拮抗IFN產生途徑，而且，病毒可能編碼多個干擾素拮抗分子。病毒可能在某個隱秘的部位復制，宿主無法檢測其RNA存在，比如雙層膜結構中。MHV或者SARS-CoV干擾的細胞，確實不產生IFN-β。但是在病毒感染后，加入Sendai病毒或者poly(I:C)，細胞產生大量IFN-β。MHV感染的DC細胞產生很低水平I型IFN。SARS-CoV感染的Caco-2和HEK293細胞，幾乎不產IFN-α，IFN-β，IFN-λ。Caco-2細胞而不是HEK293細胞誘導IP-10和IL-8。但是，產生差異的原因未知。這可能對解釋人和小鼠差異有關。冠狀病毒抑制的途徑可以被其他誘導因素激活，細胞培養(yǎng)模型中，IFN信號傳遞途徑未被完全抑制。連續(xù)研究病毒RNA的定位、復制動力學和翻譯，有助于理解該現(xiàn)象。

MERS-CoV感染中的細胞因子和趨化因子，類似SARS，MERS-CoV也感染人呼吸道上皮細胞，誘導大量但延遲的IFN和促炎癥細胞因子(IL-1β,IL-6和IL-8)。MERS-CoV可以在未激活和激活的人單核細胞-巨噬細胞、DCs中存活，但MERS-CoV只在激活的T細胞中復制。這點不同于SARS-CoV。SARSCoV不能有效感染單核細胞-巨噬細胞、DCs和T細胞。MERS-CoV感染單核細胞來源的細胞株THP-1，人外周血單核細胞衍生的巨噬細胞(peripheral blood monocyte-derived macrophages)和DC，誘導遲緩但高水平的促炎癥細胞因子和趨化因子如CCL-2、CCL-3、CCL-5、IL-2和IL-8。但是，除了漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cells，pDC)在感染時產生大量IFN，單核細胞-巨噬細胞和DC都不大量產生IFN-α/β。與輕癥比較，重癥MERS患者的血清促炎癥細胞因子(IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-15和IFN-α)和趨化因子(IL-8，CXCL10和CCL5)高。與其正相關的是肺部和外周血中嗜中性粒細胞和單核細胞數(shù)量增加。這提示這些細胞可能參與肺部病理。

2019-nCov和MERS，SARS都屬于冠狀病毒，但是其細胞因子風暴特點不同。初期：IL1B、IL1RA、IL7、IL8、IL9、IL10、堿性FGF、GCSF、 GMCSF、IFNγ、IP10、MCP-1、MIP1A、MIP1B、PDGF、TNFα和VEGF均升高。IL5、IL12p70、IL15、Eotaxin和RANTES無改變。ICU(重癥)和非-ICU病人(輕癥)比較：IL2、IL7、IL10、GCSF、IP10、MCP-1、MIP1A和TNFα升高。猜測的機制為：IL1B、IFNγ、IP10、MCP-1激活Th1。GCSF、IP10、MCP-1、MIP1A和TNFα與疾病嚴重程度相關。與SARS-Cov不同，抑制免疫的Th2細胞因子IL-4，IL-10在2019-nCov也升高。

細胞因子風暴與冠狀病毒感染大量炎癥的原因，以及驅動肺部病理損傷的宿主因素總體不清楚。但是，在炎癥起始和進展過程中發(fā)揮作用的因素正被逐步闡明。(1)病毒快速、大量復制：體內外感染的情形都是SARS-CoV和MERS-CoV很快大量復制，細胞毒性效應增強，被感染的上皮細胞產生大量促炎癥細胞因子和趨化因子。后者反饋協(xié)調大量炎癥細胞浸潤肺部。SARS-CoV和MERSCoV病毒數(shù)量與疾病嚴重程度相關。(2)hCoV感染呼吸道和/或肺泡上皮細胞：來自小鼠等動物模型的研究都提示病毒主要感染呼吸道上皮細胞，以及肺泡上皮細胞(I型和II型肺細胞pneumocyte)。(3)IFN應答延遲： SARS-CoV和MERS-CoV編碼大量結構蛋白和非結構蛋白，拮抗IFN應答。感染不久，hCoV就大量復制，產生大量抑制IFN應答的蛋白質，提示IFN應答早期拮抗可能滯后或者逃避先天免疫應答。延遲的IFN 信號傳遞進一步協(xié)調IMM應答，致敏T細胞凋亡，炎癥應答失控。(4)單核細胞-巨噬細胞和嗜中性粒細胞積累：冠狀病毒感染后，人體肺部積累這些炎癥細胞。與疾病致死性相關的細胞因子和趨化因子主要來自這些細胞。病毒復制迅速、大量炎癥細胞浸潤、促炎癥細胞因子/趨化因子增多，導致急性肺損傷(acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫癥(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。免疫應答失控導致肺部免疫病理，有害臨床癥狀。

3 冠狀病毒防控措施研發(fā)

抗冠狀病毒藥物研發(fā)面臨的挑戰(zhàn)既有RNA病毒共性問題，也有冠狀病毒特有問題?？共《景袠擞械鞍酌?、解旋酶和聚合酶抑制劑。主要靶標是病毒感染必需的宿主細胞機器，或者干擾病毒致病必需的宿主先天免疫應答。新藥研發(fā)比較漫長，為了提高治愈率，降低死亡率，老藥新用是省時、成本效益好的開發(fā)高效抗病毒藥物方法。冠狀病毒感染的治療方法包括康復者血清(convalescent sera)、皮質激素(corticosteroids)，抗病毒藥物(antiviral therapeutics)如干擾素(interferons)、廣譜抗病毒的核苷類似物如利巴韋林(ribavirin)、蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)，見表3、圖5。

3.1 治療方法

康復者血清：將MERS-CoV免疫過的駱駝的血清輸給感染小鼠，小鼠肺部病理減輕、體重降低也變緩。康復者的MERS-CoV-特異性抗體滴度變化幅度大，不容易獲得大量血漿供體，相關的臨床研究后來撤銷(NCT02190799)。因此，目前缺乏安全性和有效性的證據(jù)。

疫苗：針對冠狀病毒的疫苗研發(fā)目標是誘導廣譜抗體。這需要精準界定病毒保守的保護性抗原表位。宿主差異的T細胞應答特征，以及可能基于DC的疫苗設計。目前研究發(fā)現(xiàn)靶向嗜中性粒細胞和Th1，幫助建立組織駐留記憶(tissue-resident memory,TRM)和對不同亞型病毒具有交叉保護作用的免疫(heterosubtypic immunity)對于疫苗研發(fā)非常重要。通過單細胞轉錄組等確定外周的組織駐留細胞亞群及其功能非常關鍵。綜合利用測序、晶體結構，分子進化，預測病毒演化，選擇動力學，宿主內動態(tài)，基于測序的流行病學、基因組分化與適應，建立預測模型，現(xiàn)場實驗數(shù)據(jù)操作流程標準化，數(shù)據(jù)歸一化，全面分析免疫各方面很必要。

訂書肽(Stapled Peptide)：蛋白-蛋白相互作用(PPI)在許多生物過程中發(fā)揮重要作用，例如病毒的自組裝。訂書肽可能抑制病毒與宿主相互作用，或者病毒不同蛋白之間相互作用。具有α螺旋結構和富含正電荷的多肽可以穿過細胞膜。2000年，Verdine等發(fā)展了一種用碳碳鍵作為支架來穩(wěn)定多肽α螺旋結構的方法。由該方法得到的多肽稱為訂書肽( stapled peptides) 。訂書肽有更高的α螺旋程度，與靶標的結合能力增加5～5000倍。此外，訂書肽能透過細胞膜，難被蛋白酶水解，在生物體內的半衰期較長。Aileron Therapeutics的兩種訂書肽ALRN-5281和ATSP-7041有一定功能。

氯喹(Chloroquine)具有直接的抗病毒作用，抑制包括黃病毒(flaviviruses)，逆轉錄病毒(retroviruses)和冠狀病毒(coronaviruses)在內的幾種病毒的依賴pH的復制步驟。氯喹抗病毒作用的主要機制可能是抑制糖基化。氯喹可能與人細胞內糖修飾酶或糖基轉移酶特異性相互作用。氯喹從1944年開始用來治療瘧疾，以后用途逐漸擴大。1951年，用于治療類風濕關節(jié)炎。磷酸氯喹及其他4-氨基喹啉類抗瘧藥(如哌喹，氨酚喹等)可能干擾了瘧原蟲裂殖體DNA的復制與轉錄過程或阻礙了其內吞作用，從而使蟲體由于缺乏氨基酸而死亡，主要對瘧原蟲的紅內期起作用。

核苷(酸)類似物抑制劑(nucleotide and nucleoside analogue inhibitor，NI)是雜環(huán)或者糖成分被修飾的嘌呤或者嘧啶的類似物，是病毒聚合酶(Polymerase)的競爭性抑制劑(Competitive Inhibitor)，也是最大、最重要的一類抗病毒藥物。攜帶一個磷酸基團，代謝后就是核苷酸的NI前體藥物稱為核苷酸類似物(Nucleotide Analogue)。不含磷酸的NI藥物稱為核苷類似物(Nucleoside Analogue)。核酸合成沿著核酸的5'-3'進行。作為原料的核苷酸，首先被三磷酸化(Triphosphorylation)，變成三磷酸核苷(NTP)。除了ATP，其它的NTP都是細胞中的激酶(kinase)合成的。進入細胞后，宿主或者病毒的激酶將這些前體或者前藥代謝為活性三磷酸。RNA病毒復制所需的RNA復制過程在人體細胞中不會發(fā)生。病毒復制必須用自己的聚合酶，如RNA病毒的RNA復制酶(RdRp)。RNA病毒維持需要不間斷地復制，因為RNA在宿主細胞中會被不斷分解。而核苷(酸)類似物通過選擇性的抑制病毒的聚合酶、錯配或者替代，破壞RNA合成、結構、RNA-蛋白質相互作用或者蛋白質功能，阻止RNA病毒的復制。突變積累，病毒不能存活，造成致死性突變(lethal mutagenesis)或者錯誤災難(error catastrophe)。添加NI后，病毒每復制一次，適合度都降低，最后，NI會耗盡核苷酸庫[20]。

正鏈RNA病毒基因組復制的代時短，同源和非同源重組多，錯誤率高，病毒產量高，子代是一堆適合度各異的突變病毒。適合度高的耐藥病毒株容易出現(xiàn)，抗病毒藥物容易失效。因為Nsp14-exoN依賴RNA的RNA 3'-5'外切核酸酶校讀活性，冠狀病毒的復制忠實性比其他RNA病毒高20倍。

利巴韋林(也稱病毒唑，結構式1-β-DRibofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide)是鳥苷類似物，抑制冠狀病毒mRNA合成，具有廣譜抗病毒活性。單磷酸形式的利巴韋林與宿主合成核苷酸的關鍵酶-次黃苷酸脫氫酶(inosine monophosphate dehydrogenase,IMPDH)相互作用，減少核苷酸產生，耗盡細胞GTP庫，抑制病毒RNA合成。病毒聚合酶摻入利巴韋林的三磷酸形式則導致致死性突變。體外，高劑量利巴韋林可以部分抑制MERSCoV和SARS-CoV復制。體內，利巴韋林則提高了病毒載量，加劇了SARS-CoV感染小鼠的病情。但是，對于SARS-CoV患者，利巴韋林沒有效果，反而毒性很大。冠狀病毒天然耐受5-氟尿苷和利巴韋林與nsp14有關。ExoN的校讀活性可以使對其他病毒有效的利巴韋林失效。如何使得NI逃避Nsp14-exoN識別或者RNA延伸速度超過Nsp14-exoN外切速度，都是克服Nsp14-exoN挑戰(zhàn)的有利方法。

低劑量利巴韋林和IFN-α2b具有協(xié)同效果，體外和在恒河猴中的效果都較好，但是對危重MERSCoV感染者的臨床結局無改善。MERS-CoV感染14d使用利巴韋林和IFN-α2a可以提高生存率，但28d時施用則沒有效果。但是也有研究發(fā)現(xiàn)利巴韋林和IFN-α2a或者IFN-β1聯(lián)用未提高MERS患者生存率。IFN-α2b和IFN-β1b也用于MERS-CoV確診患者治療。IFN-β1a和利巴韋林聯(lián)用對確診者生存率無改善。并發(fā)癥和治療起始時間，可能影響個體療效。有利的治療時間窗口一般是感染后48h。HIV天冬氨酸蛋白酶抑制劑lopinavir/ritonavir和利巴韋林可以降低醫(yī)療人員MERS-CoV感染率約40%。lopinavir/ritonavir和IFN-β1b聯(lián)合治療，可以改善感染MERSCoV的小長尾猴的癥狀和病理。2016年啟動了lopinavir/ritonavir和IFN-β1b聯(lián)合治療MERS-CoV感染患者的2/3期 臨床試驗(NCT02845843)，評估其安全性、有效性和可能性。但結果未知。

Beta-D-N4-hydroxycytidine(NHC)是胞嘧啶類似物。其機理主要是導致病毒突變，但是對冠狀病毒抑制機理尚不清楚。腺苷酸類似物(Adenosine analogue)BCX4430，gemcitabine hydrochloride是脫氧胞嘧啶類似物，抑制MERS-CoV和SARS-CoV。尿苷類似物(Uridine analogue)6-azauridine抑制HCoVNL63。鳥苷類似物阿昔洛韋抑制HCoV-NL63和MERS-CoV。

免疫抑制劑咪唑核苷類抗代謝藥咪唑立賓(Mizoribine)可抑制嘌呤合成途徑中的次黃苷酸脫氫酶(IMPDH)和單磷酸鳥嘌呤核苷合成酶(cMP)，使鳥苷酸合成減少，細胞內RNA和DNA合成減少，抑制SARS-CoV，但是也阻止增殖的淋巴細胞由G0期進展為S期，抑制抗體的產生及記憶性B淋巴細胞和記憶輔助性T淋巴細胞的產生。

抗體：單克隆抗體(monoclonal antibodies，mAbs)領域正在飛速前進。單克隆抗體亞型包括IgG1，IgG1κ mAb等。目前主要開發(fā)靶向病毒保守結構或者膜蛋白的廣譜中和單克隆抗體。但是，單克隆抗體的逃逸突變體也很常見。單克隆抗體需要考慮的方面包括：抗體亞型、半衰期、活性、組織滯留時間、不同部位的藥代動力學、劑量、給藥途徑(口服、注射等)、與其他藥物的聯(lián)合使用、患者耐受性、抗原性等。單價、三價或多價納米抗體也需要考慮。

轉基因牛生產人多克隆IgG抗體：靶標是MERSCoV刺突蛋白(spike protein)(SAB-301)。體外，該多克隆抗體可以有效中和病毒，降低被感染小鼠肺部的病毒滴度。I期臨床(NCT02788188)結果發(fā)現(xiàn)SAB-301安全性和耐受性較好。針對這個靶標的單克隆抗體，也在進行單藥劑量增加的靜脈注射的安全性、耐受性、藥代動力學和免疫原性評估(NCT03301090)。

3.2 其他藥物

IFN-αβ抑制劑和IFN-λIFN-αβ誘導ISGs，限制病毒復制。IFN-αβ招募更多IMM和其他免疫細胞發(fā)揮功能，也會加劇病情。SARS-CoV-感染小鼠中，早期干擾素應答有保護作用，滯后IFN-αβ信號傳遞使得抗SARS-CoV免疫應答失控。IFN治療的時機很重要。治療時機正確才可能有效。IFN-αβ受體阻斷劑或者拮抗劑可防止晚期重癥患者的過度炎癥。IFNαβ主要通過單核細胞-巨噬細胞介導促炎癥活性。與IFN-αβ不同，IFN-λ主要激活上皮細胞的抗病毒基因，又不過分刺激免疫系統(tǒng)，阻止招募嗜中性粒細胞到炎癥部位。 SARS-CoV和MERS-CoV主要感染肺泡上皮細胞，因此IFN-λ可能用作治療。

抑制氧化磷脂(oxidized phospholipid，OxPL)[21]：甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)感染的小鼠中，氧化磷脂經TLR4-TRIF信號通路，增加肺部巨噬細胞的細胞因子/趨化因子產生，促進急性肺損傷(acute lung injury，ALI)。TLR4拮抗劑Eritoran(分子式C66H126N2O19P2)降低OxPL、炎癥性細胞因子和趨化因子水平，保護小鼠免受IAV致死性感染。Eritoran免疫調控活性強，但無直接抗病毒活性，可以降低炎癥應答。Eritoran或其他類似化合物抑制OxPL，抑制hCoV誘導的炎癥。

表3 冠狀病毒感染防控措施

圖5 部分化合物結構

鞘氨醇-1-磷酸受體1(Sphingosine-1-phosphate receptor 1，S1P1)拮抗劑：感染IAV的小鼠，內皮細胞鞘氨醇-1-磷酸受體1信號傳遞可以協(xié)調病理性炎癥應答。靶向S1P1激活可以限制過度招募炎癥細胞，抑制促炎癥細胞因子和趨化因子，降低IAV誘導的發(fā)病率和死亡率。SARS-CoV感染人和非人靈長類的肺部上皮細胞和內皮細胞，驅動S1P1-介導的炎癥性細胞因子/趨化因子應答，積累嗜中性粒細胞和巨噬細胞。激活S1P1可能治療hCoV患者，降低病理性細胞因子/趨化因子應答。

3.2.1 抑制單核細胞招募和功能的分子

IMMs在致死性hCoV感染中發(fā)揮功能。小鼠心肌炎癥模型中，脂類納米顆粒遞送含有干擾CCR2的RNA(short interfering RNA，siRNA)可以降低CCR2 mRNA，破壞招募IMM到炎癥部位的功能，改善預后。hCoVs是單鏈RNA(single-stranded RNA，ssRNA)病毒，TLR7激活劑R837 (合成的ssRNA模擬分子)刺激IMMs，誘導很強的炎癥應答。這提示hCoV感染時，可能是IMM特異性TLR-7信號傳遞促進過度炎癥。TLR7拮抗劑可能減輕炎癥，改善治療。

3.2.2 其他免疫調節(jié)分子

hCoV感染后，可能減輕炎癥應答的免疫調節(jié)分子包括細胞因子/趨化因子抑制劑，危險相關分子模式(danger-associated molecular pattern，DAMP)拮抗劑。SARS-CoV感染小鼠中，TNFα是急性肺損傷的重要因素，破壞T細胞應答。體外中和TNFα活性或者感染缺乏TNFR的小鼠，都可以預防SARS-CoV-誘導的發(fā)病和死亡。但是，TNFα只在SARS感染者后期血清中檢測到。

炎癥是有效免疫應答必不可少的，否則很難清除致病菌。首先是識別致病菌，然后招募免疫細胞，清除致病菌，最后修復組織，恢復穩(wěn)態(tài)。但是，高致病性冠狀病毒等誘導大量持久的細胞因子/趨化因子，稱為細胞因子風暴，導致免疫病變和高死亡率。尸檢提示來自IMM和嗜中性粒細胞的細胞因子/趨化因子具有重要作用。干預細胞因子/趨化因子可能減輕病理性炎癥應答。感染早期、晚期的高病毒載量與人疾病嚴重程度相關，控制病毒載量、降低其炎癥應答可能也有利于治療。這需要找出冠狀病毒感染患者或者動物中，介導炎癥應答的特異性信號途徑。

4 有待研究的問題

病毒顆粒相關的附屬蛋白在冠狀病毒生活周期中的作用？附屬蛋白抑制干擾素信號傳遞的機制？附屬蛋白與病毒結構蛋白之間的相互作用？不同冠狀病毒入侵方式及主要功能受體差異？不同冠狀病毒S蛋白的裂解特點及誘導膜融合規(guī)律？病毒組織嗜性與致病性改變同S蛋白結構的關系？CoV nsp15 EndoU的天然靶標？EndoU活性對dsRNA命運的影響？如何調控EndoU活性，避免誤切？EndoU如何逃避宿主dsRNA感受器的免疫識別？與nsp15相互作用的宿主細胞/病毒的分子如何調控EndoU活性？冠狀病毒等RNA病毒基因組復制的場所是所有地方還是局限在雙層膜復制體？與其復制有關的各種膜結構的蛋白質成分與構象，是否有差異？形成復制細胞器時，病毒和宿主的蛋白質如何相互作用？雙層膜(DMV)中積累的RNA，有何變化？宿主控制免疫應答網絡的SNP及其在控制冠狀病毒感染中的作用。從表觀遺傳角度如甲基化、泛素化、磷酸化、糖基化、乙酰化、染色質重塑和非編碼RNA等研究人體應對CoV感染的調控，以及CoV逃避宿主的免疫反應的表觀遺傳調控，從SARS-CoV等冠狀病毒感染細胞的轉錄組可否揭示病毒復制的信號通路和網絡？動物模型與人體之間的差異，探索病毒侵入、感染機制、免疫機制、需要病毒免疫學、預防醫(yī)學、藥學和臨床治療學等領域協(xié)作。