喀迪爾丁·艾爾肯 郭愛(ài)民 郝翠蘭 張文潤(rùn) 容夢(mèng)婕 宋鵬慧 岳 城

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院, 烏魯木齊 830052)

斑重唇魚(yú)(Diptychus maculatesSteindachner,1866)和新疆裸重唇魚(yú)(Gymnodiptychus dybowskiiKessler, 1874), 分別隸屬于鯉形目(Cypriniformes),鯉科(Cyprinidae), 裂腹魚(yú)亞科(Schizothoracinae)[1],是伊犁河水系中具有代表性的土著種和生態(tài)敏感種[2], 二者分別為自治區(qū)I級(jí)和II級(jí)水生野生重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物[3]。

指環(huán)蟲(chóng)是一種常見(jiàn)的魚(yú)類(lèi)寄生蟲(chóng)病原, 其形態(tài)多樣, 種類(lèi)豐富, 隸屬于單殖吸蟲(chóng)綱、指環(huán)蟲(chóng)目、指環(huán)蟲(chóng)科[4], 廣泛寄生于淡水魚(yú)類(lèi), 宿主種類(lèi)達(dá)8科194屬, 而其中約95%的種類(lèi)寄生于鯉科(Cyprinidae)魚(yú)類(lèi), 表現(xiàn)出極強(qiáng)的宿主特異性[5]。指環(huán)蟲(chóng)屬為單殖吸蟲(chóng)綱中種類(lèi)最多的屬, 全世界已報(bào)道970余種, 我國(guó)記載有400余種[6], 其中裂腹魚(yú)寄生指環(huán)蟲(chóng)全球已報(bào)道約16余種, 我國(guó)現(xiàn)記錄有強(qiáng)壯指環(huán)蟲(chóng)(D. pollensZhang et Gou, 1981)、裂腹指環(huán)蟲(chóng)(D.schizothoraxiMa et Zhao)、塔里木指環(huán)蟲(chóng)(D. talimuensisLong et Ma)、塊莖指環(huán)蟲(chóng)(D. lumpycirrusMa et Zhao)、拉薩指環(huán)蟲(chóng)(D. lhasaensisYao et Wang,1997)、裸裂尻指環(huán)蟲(chóng)(D. SchizopygopsisYao et Wang, 1993)、四川指環(huán)蟲(chóng)(D. sichuanensisMa et Long)等7種指環(huán)蟲(chóng), 均寄生于裂腹魚(yú)屬的裂腹魚(yú)類(lèi),而斑重唇魚(yú)和新疆裸重唇魚(yú)所屬的兩屬裂腹魚(yú)并未有相關(guān)記載[4,7,8]。

我們?cè)谶M(jìn)行裂腹魚(yú)寄生蟲(chóng)病原區(qū)系調(diào)查時(shí), 在伊犁河流域鞏乃斯段的斑重唇魚(yú)和新疆裸重唇魚(yú)鰓絲上發(fā)現(xiàn)寄生有大量指環(huán)蟲(chóng)。結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行形態(tài)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析,并查閱了國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn), 未發(fā)現(xiàn)相關(guān)記述, 依據(jù)采集地命名重唇魚(yú)指環(huán)蟲(chóng)(Dactylogyrus diptychusn.sp.)。正模標(biāo)本GNS20181101和副模標(biāo)本GNS2018 1102-03分別保存于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院標(biāo)本館和寄生蟲(chóng)研究室。

1 材料與方法

1.1 寄生蟲(chóng)樣品采集

斑重唇魚(yú)和新疆裸重唇魚(yú)[9]采自于伊犁河上游鞏乃斯河, 兩種裂腹魚(yú)各30余尾。對(duì)魚(yú)類(lèi)標(biāo)本編號(hào),測(cè)量體高和尾叉長(zhǎng)、稱重并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。依照《魚(yú)病調(diào)查手冊(cè)》[10]的方法對(duì)魚(yú)進(jìn)行解剖, 分別將每條魚(yú)的鰓部剪下, 逐個(gè)在解剖鏡下進(jìn)行鏡檢, 發(fā)現(xiàn)寄生蟲(chóng)后將其吸取到盛有清水的小皿中, 沖洗干凈后, 將其吸取到1.5 mL的EP管中, 滴加75%和95%濃度的酒精保存, 分別用于標(biāo)本制作和DNA提取。

1.2 寄生蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)鑒定

在解剖鏡下挑取形態(tài)完整的新鮮蟲(chóng)體, 用4%聚乙烯乳酸酚[11]固定并封片, 在光學(xué)顯微鏡(Nikon E2000)下觀察其幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu), 并通過(guò)EZMET軟件測(cè)量其中央大鉤、聯(lián)結(jié)片、交接器等幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu), 最后繪制特征圖。

1.3 DNA提取、擴(kuò)增及測(cè)序

取95%無(wú)水乙醇固定的蟲(chóng)體樣本若干只, 再次沖洗后置于TE緩沖液(pH 8.0)中浸泡過(guò)夜后, 吸去TE緩沖液, 分別裝入1.5 mL的EP管中, 用Trans-Gen動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取蟲(chóng)體DNA, 在-20℃冰箱中保存。

選取18S-ITS1-5.8S rDNA序列作為目的序列,擴(kuò)增引物參照?imková等[12]。引物由上海生工生物工程服務(wù)有限公司合成, 反應(yīng)體系為50 μL, 具體反應(yīng)條件和引物序列見(jiàn)表1。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分析并切取目的條帶后, 用TransGen公司的膠回收試劑盒進(jìn)行回收和純化, 回收后的目的片段連接到pMD18-T載體進(jìn)行TA克隆, 再轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α中, LB平板培養(yǎng),PCR檢測(cè)成功后送上海生工生物工程服務(wù)有限公司測(cè)序。

表1 PCR引物及反應(yīng)條件Tab. 1 PCR primers and reaction conditions

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的已知序列進(jìn)行比對(duì)并下載相關(guān)序列(表2), 用ClustalⅩ軟件進(jìn)行序列校正后, 采用MEGA6.0軟件計(jì)算所得序列中各堿基含量及變異情況, 同時(shí)計(jì)算遺傳距離(P-distance)。系統(tǒng)發(fā)育分析采用最大似然法(Maximum Likelihood, ML)和貝葉斯法((Bayesian Inference, BI), 以Ancyrocephalus percae作為外類(lèi)群, 建樹(shù)采用Modeltest程序進(jìn)行AIC檢驗(yàn)選擇最適進(jìn)化模型, ML樹(shù)和BI樹(shù)最適模型均為GTR+G+I, 在MEGA6.0軟件中構(gòu)建ML樹(shù), 系統(tǒng)樹(shù)各分支的相對(duì)支持率采用自展檢驗(yàn)分析(Bootstrap) 進(jìn)行檢驗(yàn), 1000次重復(fù)取樣;利用MrBayes軟件構(gòu)建BI樹(shù), 設(shè)置代替模型為6(nst=6)、位點(diǎn)間變異模型為gamma(rates=gamma),運(yùn)行6000000代蒙特卡羅模擬(Markov chain Monte Crlo; MCMC), 每100代取樣1次, 各分支的置信度以后驗(yàn)概率(Posterior probability)來(lái)表示[13]。

2 結(jié)果

斑重唇魚(yú)共采集32尾, 均有指環(huán)蟲(chóng)寄生, 自然感染率約為100%, 每尾魚(yú)感染1—20枚蟲(chóng)體, 每片鰓感染0—6枚, 感染強(qiáng)度為12.62; 新疆裸重唇魚(yú)共采集34尾, 均有指環(huán)蟲(chóng)寄生, 自然感染率為100%,每尾魚(yú)感染1—24枚蟲(chóng)體, 每片鰓感染0—7枚, 感染強(qiáng)度為8.67。兩種宿主平均感染強(qiáng)度為10.58。

2.1 蟲(chóng)體的形態(tài)學(xué)特征

基于8個(gè)封片標(biāo)本, 測(cè)量單位為微米(μm)。蟲(chóng)體呈扁平長(zhǎng)條狀(圖1), 體長(zhǎng)1171(943—1385), 體最大寬100(85—120); 眼點(diǎn)兩對(duì); 咽近乎呈圓形, 大小51(36—62)×49(36—60)。后吸器長(zhǎng)86(65—114), 寬138(108—162), 包含1對(duì)中央大鉤、7對(duì)邊緣小鉤、1個(gè)背聯(lián)結(jié)片和1個(gè)腹聯(lián)結(jié)片。邊緣小鉤發(fā)育良好,可明顯區(qū)分鉤尖、鉤柄和柄軸, 第1對(duì)和第7對(duì)較大,全長(zhǎng)51(47—56); 其余5對(duì)等大, 全長(zhǎng)46 (41—51)。7對(duì)邊緣小鉤的鉤尖長(zhǎng)5.8(5—8), 鉤柄長(zhǎng)11(8—17),柄軸長(zhǎng)30(23—36)。中央大鉤全長(zhǎng)55(51—60), 基部長(zhǎng)53(51—56), 鉤尖長(zhǎng)14(13—16), 內(nèi)外突粗壯,內(nèi)突長(zhǎng)14(11—18), 外突長(zhǎng)12(10—15)。背聯(lián)結(jié)片呈粗壯“一”字型, 大小14(10—16)×78(74—83), 腹聯(lián)結(jié)片短小, 中部呈峰狀隆起, 大小12(11—16)×33(26—50)。交接器由交接管和支持器組成, 交接管基部膨大, 管細(xì)長(zhǎng), 一分為二, 末端形成圓環(huán), 管長(zhǎng)36(33—44)。支持器由兩部分組成, 上半部分形成半環(huán)繞交接管的柄狀結(jié)構(gòu), 下半部分形成“Y”狀結(jié)構(gòu), 與交接管底部相連, 支持器長(zhǎng)26(23—31)。卵呈橢圓形, 大小75(64—82)×58(54—61), 陰道口開(kāi)于蟲(chóng)體左側(cè)。

表2 用于建樹(shù)的指環(huán)蟲(chóng)種類(lèi)及ITS1序列的GenBank登錄號(hào)Tab. 2 The Dactylogyrus species used for building trees and the GenBank accession number of the 18S-ITS1-5.8S rDNA sequence

2.2 蟲(chóng)體的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

18S-ITS1-5.8S序列長(zhǎng)度為996 bp, 其中保守位點(diǎn)515個(gè), 變異位點(diǎn)459個(gè), 包括336個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。A、T、G、C堿基的平均含量為23.52%、26.62%、27.65%、22.21%, A+T的含量高于G+C的含量。Blast比對(duì)顯示與D. cryptomeres相似度為最高92%,與其他指環(huán)蟲(chóng)相似度較低, 如與D. lamellatus、D.squamous、D. tuba、D. zandti相似度為79%, 與D.varius、D.benhoussai、D.dyki相似度為73%。

基于18S-ITS1-5.8S rRNA基因序列構(gòu)建的BI系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示(圖2), 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分為三個(gè)分支,D.prespensis、D. malleus等多數(shù)指環(huán)蟲(chóng)聚為一支,D.diptychus與D. cryptomeres聚為一個(gè)單獨(dú)分支,D.anchoratus、D. formosus等四種指環(huán)蟲(chóng)聚為一支,位于進(jìn)化樹(shù)基部。ML樹(shù)(圖3)與BI樹(shù)在第一個(gè)分支上略有差異外, 其余兩個(gè)分支結(jié)果一致, 說(shuō)明D.diptychus與D. cryptomeres屬內(nèi)親緣關(guān)系最近。

3 討論

指環(huán)蟲(chóng)因其具有較強(qiáng)的宿主特異性, 通過(guò)宿主進(jìn)行初步鑒定也是較常見(jiàn)的方法之一。本研究根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征確定了本種隸屬于指環(huán)蟲(chóng)屬后, 根據(jù)宿主情況, 將本種與現(xiàn)已記載的裂腹魚(yú)指環(huán)蟲(chóng)進(jìn)行了形態(tài)學(xué)特征的比較。裂腹魚(yú)寄生指環(huán)蟲(chóng)全球現(xiàn)已報(bào)道16余種, 大部分均寄生于裂腹魚(yú)屬的裂腹魚(yú)類(lèi), 而寄生于新疆裸重唇魚(yú), 斑重唇魚(yú)和同屬宿主的指環(huán)蟲(chóng)僅有兩種, 分別為Dactylogyrus driagini(Bychowsky, 1936)和Dactylogyrus simplex(Bychowsky, 1936)[8], 故先與上述兩種指環(huán)蟲(chóng)進(jìn)行了對(duì)比。

本種與D. driagini交接器結(jié)構(gòu)較為相似, 兩者的交接器上端均伸入支持器上端, 下端均形成圓環(huán)狀。但本種支持器上端由兩個(gè)底部相連的柄狀結(jié)構(gòu)形成“V”狀, 環(huán)繞交接器的上端。而后者只形成單一的柄狀結(jié)構(gòu), 交接器上端直接穿過(guò)該部分, 同時(shí)本種支持器分為上下兩部分, 下部分形成“Y”狀與上部分支持器相連, 而后者支持器是完整的一體結(jié)構(gòu)。本種與D. driagini后吸器均由一對(duì)中央大鉤、7對(duì)邊緣小鉤和兩聯(lián)結(jié)片組成, 本種中央大鉤內(nèi)外突不太明顯, 而后者內(nèi)外突分葉很明顯; 本種邊緣小鉤可明顯區(qū)分鉤尖, 鉤柄和柄軸, 而后者區(qū)分不明顯; 同時(shí), 本種邊緣小鉤長(zhǎng)平均為46 μm, 同時(shí)第1對(duì)和第7對(duì)較大, 達(dá)51 μm, 而后者邊緣小鉤為19—26, 明顯小于前者。而將本種與D. simplex進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征的對(duì)比, 發(fā)現(xiàn)二者不僅是在交接器還是后吸器形態(tài)上都存在明顯差異。

圖1 重唇魚(yú)指環(huán)蟲(chóng)的形態(tài)特征Fig. 1 Morphological characteristics of Dactylogyrus diptychus n. sp.

圖2 基于18S-ITS1-5.8S rDNA基因序列構(gòu)建的貝葉斯法(BI)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree constructed via the Bayesian inference (BI) method based on 18S-ITS1-5.8S rDNA gene sequences

圖4 D. diptychus (A)、D. driagini (B)、D. longicopula (C)和D. simplex (D)幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)比Fig. 4 Comparison of the chitinous structures of D. diptychus (A), D. driagini (B), D. longicopula (C) and D. simplex (D)

同時(shí), 將本種與其他裂腹魚(yú)指環(huán)蟲(chóng)進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征比較時(shí)發(fā)現(xiàn), 與寄生于伊犁裂腹魚(yú)的Dactylogyrus longicopula(Bychowsky, 1936)形態(tài)類(lèi)似, 但存在以下明顯的區(qū)別: 本種中央大鉤內(nèi)外突非明顯分葉, 內(nèi)外突大小基本相同, 而D. longicopula內(nèi)外突明顯分葉, 且內(nèi)突遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于外突; 本種與D. longicopula均具兩聯(lián)結(jié)片, 前者腹聯(lián)結(jié)片粗短, 中部呈峰狀隆起, 而后者腹聯(lián)結(jié)片兩端細(xì)長(zhǎng), 中間呈三角狀隆起; 本種邊緣小鉤鉤尖與鉤柄連接處無(wú)刺狀突起, 而后者邊緣小鉤同部位均有刺狀突起, 同時(shí)度量值也存在較大差異; 本種支持器前端較扁平, 而后者形成兩個(gè)分化明顯的鉤, 同時(shí)前者支持器上下部分連接處呈“Y”狀, 后者為卷曲狀。

綜上所述, 重唇魚(yú)指環(huán)蟲(chóng)(Dactylogyrus diptychusn. sp.)與上述三種裂腹魚(yú)指環(huán)蟲(chóng)近似種在形態(tài)特征上均有明顯的差別, 結(jié)構(gòu)比較見(jiàn)圖4。

傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類(lèi)不管是在早期還是現(xiàn)在, 都為單殖吸蟲(chóng)的分類(lèi)鑒定做出了巨大貢獻(xiàn)[14,15]。然而在實(shí)際鑒定過(guò)程中受一些不可控的變量因素的影響, 傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類(lèi)顯現(xiàn)出了其不足之處[16,17],單純的依賴傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)進(jìn)行分類(lèi)顯得日益困難,尤其是對(duì)同屬的相似種而言[18]。單殖吸蟲(chóng)特異性分子標(biāo)記目前以rDNA和ITS為主, 主要包括18S、5.8S、28S、ITS1、ITS2, 其中18S rDNA、ITS1、5.8S rDNA組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元, 形成一個(gè)前體RNA。其中18S rDNA中的不同區(qū)域在進(jìn)化上比較保守, 而ITS1屬于非編碼區(qū)序列, 進(jìn)化速度快, 具有可變性并且變異的速度在不同的物種間也存在著較大的差異, 同時(shí), 該基因中保守區(qū)占18S rRNA基因總長(zhǎng)度的一半以上, 因此18S-ITS1-5.8S rDNA常用于單殖吸蟲(chóng), 特別是指環(huán)蟲(chóng)的分類(lèi)及系統(tǒng)發(fā)育研究[19,20]。本研究基于形態(tài)學(xué)結(jié)果, 選擇擴(kuò)增了該蟲(chóng)種的18S-ITS1-5.8S rDNA序列, 擴(kuò)增后其結(jié)果在GenBank中進(jìn)行比對(duì), 與寄生于屬魚(yú)的隱藏指環(huán)蟲(chóng)的相似性達(dá)92%, 且遺傳距離較其他指環(huán)蟲(chóng)相比最小。構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)中兩者聚為一支, 置信度達(dá)100/99(BI/ML)。但基于形態(tài)學(xué)特征, 本種與隱藏指環(huán)蟲(chóng)在后吸器和交接器形態(tài)上存在明顯差別, 同時(shí)隱藏指環(huán)蟲(chóng)宿主為亞科的魚(yú)類(lèi), 與本種的兩個(gè)宿主非同科。其次, 裂腹魚(yú)類(lèi)為高原冷水魚(yú)類(lèi), 分布于山區(qū)高原地帶, 而屬魚(yú)為溫水性魚(yú)類(lèi), 大多分布于平原地區(qū), 兩種宿主魚(yú)類(lèi)在生境上存在較大差別。因此結(jié)合形態(tài)學(xué)和宿主特點(diǎn)可證明, 兩種指環(huán)蟲(chóng)在系統(tǒng)發(fā)育分析中雖顯示出了較高的親緣關(guān)系和序列相似度, 但并非同一種。

通過(guò)上述形態(tài)學(xué)分類(lèi)和基于18S-ITS1-5.8S rDNA基因序列的分子生物學(xué)研究, 確定寄生于新疆裸重唇魚(yú)和斑重唇魚(yú)鰓上的待鑒定指環(huán)蟲(chóng)為未記錄種, 按照宿主特點(diǎn)命名為重唇魚(yú)指環(huán)蟲(chóng)(Dactylogyrus diptychusn. sp.)。研究結(jié)果豐富了我國(guó)單殖吸蟲(chóng)名錄, 同時(shí)為伊犁河新疆裸重唇魚(yú)和斑重唇魚(yú)的資源保護(hù)提供了相關(guān)的病原基礎(chǔ)性資料。