劉亞琦 劉雙元, 高 娜, 戴景程, 邱東茹,

(1. 大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 大連 116023; 2. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072;3. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

收稿日期:2019-10-22;修訂日期:2020-03-14

基金項目:中國科學(xué)院先導(dǎo)項目“美麗中國”子課題(XDA23040401); 中國科學(xué)院重點部署項目(KFZD-SW-219-3-2)資助 [Supported by Strategic Priority Research Program of CAS (XDA23040401); Key Research Program of the Chinese Academy of Sciences Grant(KFZD-SW-219-3-2)]

作者簡介:劉亞琦(1995—), 女, 碩士研究生; 主要從事分子微生物學(xué)與生物技術(shù)研究。E-mail: liuyaqi@ihb.ac.cn

通信作者:邱東茹(1968—), 男, 研究員; 博士生導(dǎo)師; 主要從事分子微生物學(xué)與生物技術(shù)研究。E-mail: qiu@ihb.ac.cn

doi:10.7541/2020.080

活性污泥技術(shù)距今約有百年歷史, 廣泛應(yīng)用于市政污水和工業(yè)廢水處理?；钚晕勰喾ㄖ饕峭ㄟ^曝氣促進微生物的代謝及生長, 活性污泥可通過重力作用實現(xiàn)泥水分離, 加之污泥回流以維持曝氣池中微生物的濃度, 即所謂的活性污泥法三要素[1]?；钚晕勰辔⑸锞z團的形成有利于污泥的沉降和回用, 是該技術(shù)成敗的關(guān)鍵, 微生物所分泌的膠質(zhì)狀由胞外多糖、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子物質(zhì)組成的胞外多聚物(簡稱EPS)是菌膠團形成的基礎(chǔ)[1,2]。

在活性污泥微生物菌群中, 動膠菌屬(Zoogloea)是活性污泥中的優(yōu)勢菌群, 是菌膠團形成的代表性微生物, 本實驗室已對其菌膠團形成機制進行了相關(guān)的研究報道[3—7]。本次從云南省瀘西縣污水處理廠水樣中分離到一株偽杜搟氏菌, 編號YN12, 發(fā)現(xiàn)該菌株能夠形成穩(wěn)定的菌膠團。

迄今為止, 偽杜搟氏菌屬僅有3個已知物種且均從不同生境中分離。李文均等[8]從森林土壤中分離的紫黑偽杜搟氏菌(Pseudoduganella violaceinigra)YIM 31327T是該屬的模式種, 因該菌與杜搟氏菌(Duganella zoogloeoides)IAM 12670T具有較近的親緣關(guān)系, 故發(fā)現(xiàn)之初被分類定名為紫黑杜搟氏菌(D. violaceinigra)。2012年, 該菌被重新分類、定義為新屬偽杜搟氏菌屬(Pseudoduganella)[9]。隨后,從斑馬魚體內(nèi)和瀉湖沉積物中分別分離到呈米黃色的斑馬魚偽杜搟氏菌(P. danionis)E3/2T[10]和象牙白偽杜搟氏菌(P. eburnean)10R5-21T[11]。本次分離的偽杜搟氏菌YN12株經(jīng)16S rDNA序列分析鑒定與P. eburnean10R5-21T具有較高的同源性, 通過基因組測序、組裝和注釋, 發(fā)現(xiàn)該菌具有與喜樹脂動膠菌(Z. ramigera)MMB株、解叔丁醇水居菌(Aquincola tertiaricarbonis)RN12株以及解殼聚糖松江菌(Mitsuaria chitosanitabida)XHY-A6株相似的菌膠團形成相關(guān)基因及基因簇[2,6,7,12]。我們還從中國科學(xué)院水生生物研究所石首養(yǎng)殖池塘中和安徽阜陽六里河中分離到同種菌株, 也能形成穩(wěn)定的生物絮團, 說明該菌分布廣泛, 加之所能利用的碳源比較多且基因組中含有氮代謝相關(guān)基因, 這種細菌可能適合用于以色列學(xué)者Avnimelech提出的生物絮團技術(shù)(Biofloc Technology)中, 用來調(diào)控生物絮團的微生物群落組成, 降低養(yǎng)殖水體中的氨氮含量,以凈化養(yǎng)殖水質(zhì)、達到養(yǎng)殖動物最佳健康狀態(tài)[13—15]。

1 材料與方法

1.1 菌膠團/生物絮團形成菌的分離純化

將從云南省瀘西縣污水處理廠采集的污泥樣品和水樣充分混勻, 用R2A液體培養(yǎng)基進行10-3—10-6倍梯度稀釋(每個梯度3個重復(fù)), 將稀釋液均勻涂布到R2A固體培養(yǎng)基上, 放入28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24—36h。從平板上挑取不同顏色、形態(tài)的菌落接種至R2A液體培養(yǎng)基中, 振蕩培養(yǎng)(28℃, 220 r/min),篩選菌膠團形成穩(wěn)定的菌株并進行多次分離純化,以獲得純培養(yǎng)物。挑取純培養(yǎng)物的單克隆搖菌, 用40%甘油按體積比1∶1保存菌種, 于-80℃冷凍保藏備用。

1.2 菌株的分子鑒定

以細菌基因組為模板, 利用16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增16S rDNA片段。PCR反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性5min;95℃變性30s, 55℃退火45s, 72℃延伸1min, 30個循環(huán); 72℃延伸10min; 16℃保溫。

擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后與pMD18-T載體連接, 并通過熱激轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α感受態(tài)細胞中, 經(jīng)37℃復(fù)蘇后涂布到含氨芐青霉素的LB固體板上置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。用引物M13(-47) 5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGT CACG-AC-3′, M13(-48) 5′-GAGCGGATAACAATTT CACACAGG-3′對陽性克隆進行菌落PCR擴增檢測, 選取擴增片段大小正確的克隆送至測序公司完成測序。測序結(jié)果在GenBank上進行BLAST比對,獲得親緣關(guān)系相近菌株的16S rDNA序列, 利用MEGA X軟件, 通過鄰接法(Neighbor-Joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 菌株YN12基于BioLog GEN III微孔板鑒定的碳源利用

將篩選獲得的菌膠團形成穩(wěn)定的菌株YN12在R2A固體板上劃線, 28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1—2d, 用無菌棉簽挑取少量菌落接種于BioLog GEN III專用接種液IF-A中, 制備為均一菌懸液。先將菌懸液濃度調(diào)整至90%—98%T, 然后倒入V型加樣水槽中, 再用8道移液器按每孔100 μL的量將菌懸液按順序加入GEN III微孔板的所有孔中, 放入28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h, 用Omni Log讀數(shù)儀讀取數(shù)據(jù)。

1.4 基因組測序拼接及注釋

用苯酚抽提法提取基因組, 經(jīng)NanoDrop8000超微量紫外分光光度計及1%瓊脂糖凝膠電泳進行濃度及質(zhì)量測定, 待檢測合格后, 送至公司進行二代全基因組測序, 測序結(jié)果利用本實驗室已有的SPAdes基因組拼接工具對測序結(jié)果進行組裝, 并通過RAST (Rapid Annotation using Subsystems Technology)基因組自動注釋服務(wù)器進行注釋。

2 結(jié)果

2.1 菌膠團形成菌表型的篩選

我們從云南省瀘西縣污水處理廠采集的活性污泥樣品及水樣中分離并純化到一株菌膠團形成菌YN12(圖1)。經(jīng)16S rDNA序列分析鑒定為偽杜搟氏菌屬細菌。與從云南森林土壤中分離的紫黑偽杜搟氏菌不同的是, YN12并不產(chǎn)色素, 液體培養(yǎng)基中形成的菌膠團和固體培養(yǎng)基上形成的菌落都呈白色, 與從瀉湖沉積物中分離的象牙白偽杜搟氏菌在顏色及16S rDNA序列同源性上都更為接近,故將菌株YN12鑒定為Pseudoduganella eburnea。

2.2 菌株YN12基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析

將16S rDNA序列的測序結(jié)果在BLAST上進行比對發(fā)現(xiàn), 菌株YN12與P. eburnean10R5-21T和P.violaceinigraYIM 31327T的相似度分別為98.8%和98.5%。將親緣關(guān)系相近菌株的16S rDNA序列在MEGA X軟件中通過鄰接法(NJ法)進行比對時發(fā)現(xiàn)(圖2), 在同屬菌株中, 菌株YN12與偽杜搟氏菌YIM 31327T株和10R5-21T株親緣關(guān)系更近, 與P.danionisE3/2T在序列及顏色上都有差異, 親緣關(guān)系相對較遠。偽杜搟氏菌屬與杜搟氏菌屬(Duganella)和馬賽氏菌屬(Massilia)同屬于伯克霍德氏菌目(Burkholderiales)草酸桿菌科(Oxalobacteraceae), 三者之間存在較近的親緣關(guān)系, 與紅環(huán)菌目(Rhodocyclales)的動膠菌屬親緣關(guān)系相對較遠。

2.3 象牙白偽杜搟氏菌YN12基因組的組裝與注釋

圖1 Pseudoduganella eburnea YN12菌膠團形成表型及顯微鏡圖Fig. 1 Floc-forming phenotype and microscopical observation of P. eburnea YN12 strain

圖2 Pseudoduganella eburnea YN12及近緣細菌基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of Pseudoduganella eburnea YN12 and closely related strains

采用苯酚氯仿抽提法提取P. eburneaYN12基因組, 送至公司進行全基因組測序。利用RAST自動注釋服務(wù)器注釋后顯示(表1), 菌株YN12基因組的大小約為5933582 bp, G+C含量為63.9%, 與P.eburnea10R5-21T株相接近, 含有104個RNA, 包含5313個蛋白質(zhì)編碼序列, 其編碼的蛋白按照功能可分為以下幾類(圖3): 輔因子、維生素、輔基和色素相關(guān)(278個基因, 占5.23%), 細胞壁和莢膜形成相關(guān)(126, 2.37%), 毒素、感染和防護相關(guān)(122, 2.30%),鉀離子代謝相關(guān)(16, 0.30%), 多種功能相關(guān)(43, 0.81%),噬菌體、前噬菌體、轉(zhuǎn)座因子和質(zhì)粒相關(guān)(1,0.02%), 膜轉(zhuǎn)運相關(guān)(296, 5.57%), 鐵離子攝取與代謝類相關(guān)(59, 1.11%), RNA代謝相關(guān)(184, 3.46%),核苷與核苷酸相關(guān)(116, 2.18%), 蛋白質(zhì)代謝相關(guān)(300, 5.65%), 細胞分裂周期相關(guān)(37, 0.70%), 運動性和趨化性相關(guān)(227, 4.27%), 細胞調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)(49, 0.92%), 次級代謝相關(guān)(8, 0.15%), DNA代謝相關(guān)(113, 2.13%), 脂肪酸、脂肪和類異戊二烯相關(guān)(135, 2.54%), 氮代謝相關(guān)(49, 0.92%), 休眠和孢子形成相關(guān)(4, 0.08%), 呼吸作用相關(guān)(131, 2.47%),應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)(194, 3.65%), 芳香化合物代謝相關(guān)(24, 0.45%), 氨基酸及其衍生物相關(guān)(436, 8.21%),硫代謝相關(guān)(33, 0.62%), 磷代謝相關(guān)(48, 0.90%), 碳水化合物相關(guān)(323, 6.08%), 功能未知(1961,36.91%)。

表1 基因組信息統(tǒng)計Tab. 1 Genomic information statistics

2.4 菌株YN12基于基因組分析的胞外多聚物合成相關(guān)基因簇及相關(guān)基因編碼產(chǎn)物間的比對

象牙白偽杜搟氏菌YN12基因組中存在與喜樹脂動膠菌MMB[6,7]、解叔丁醇水居菌RN12[12]及解殼聚糖松江菌XHY-A6[2]相似的胞外多糖生物合成途徑、PrsK-PrsR雙組分系統(tǒng)和PEP-CTERM胞外蛋白家族, 共同介導(dǎo)和調(diào)控了菌膠團的形成。與后者相比, 菌株YN12的胞外多糖與蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因分布更為集中, 主要分布在大小約為72 kb的大型基因簇上, 包含已報道的天冬酰胺合成酶基因asnB和asnH、多個糖基轉(zhuǎn)移酶基因、葡萄糖醛酸表型異構(gòu)基因uge, 雙組分系統(tǒng)相關(guān)基因prsR-prsK, 糖基轉(zhuǎn)移酶基因epsB2等與菌膠團形成相關(guān)的基因。

圖3 Pseudoduganella eburnea YN12胞外多聚物形成相關(guān)基因簇Fig. 3 The extracellular polymeric substances biosynthesis gene cluster of P. eburnea YN12

與菌株MMB胞外多聚物相關(guān)基因簇相比,YN12中含有兩個prsT相關(guān)基因, 且兩個相關(guān)基因與MMB中同源基因編碼產(chǎn)物的相似度均為33%(表2)。多糖脫乙酰酶(Polysaccharide deacetylase)、莢膜合成蛋白CapK、天冬酰胺合成酶AsnH、多糖輸出蛋白Wza、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子PrsR以及尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶Ugd等直系同源基因表達產(chǎn)物的相似度均在50%左右, 序列相對較保守。這些結(jié)果說明雖然這兩個菌株分屬Beta變形菌綱的兩個不同的目, 但是胞外多糖、胞外多聚物和菌膠團/生物絮團形成的分子機制非常相似。

2.5 菌株YN12與其他菌膠團形成菌的碳源利用比較及比較基因組學(xué)分析

細菌通?？梢岳枚喾N碳源, 包括有機污染物,是細菌凈化水質(zhì)的重要基礎(chǔ)。BioLog自動微生物鑒定系統(tǒng)可以從側(cè)面提供細菌代謝生理比較分析和親緣關(guān)系鑒定的依據(jù)。將P. eburneaYN12微孔板的鑒定結(jié)果與已知的杜搟氏菌進行比對, 在碳源利用方面(表1), 菌株YN12與P. violaceinigraYIM 31327T和P. eburnean10R5-21T都可以利用葡萄糖、麥芽糖、纖維二糖、蔗糖、N-乙?；咸烟前返茸鳛槲ㄒ惶荚? 也可以利用組氨酸、絲氨酸等氨基酸,但都不能利用巖藻糖、鼠李糖、山梨醇及檸檬酸。

通過對P. eburneaYN12基因組分析發(fā)現(xiàn), 該菌擁有完整的三羧酸循環(huán)和乙醛酸支路、磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway)和微生物特有的Entner-Doudoroff途徑。還擁有乳糖、果糖、甘露糖和蔗糖的吸收和降解相關(guān)基因, 與BioLog分析結(jié)果相吻合。

將P. eburneaYN12的基因組與用同種方法注釋的P. violaceinigraYIM 31327T基因組進行比對后發(fā)現(xiàn), 菌株YN12基因組中含有N-乙酰D-氨基葡萄糖運輸系統(tǒng), 半乳糖、N-乙酰D-氨基半乳糖、甘露糖、D-半乳糖酸、D-葡萄糖酸、D-甘油、聚羥基丁酸酯、甘油脂和甘油磷脂等分解代謝相關(guān)基因,具有谷氨酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)滲透酶蛋白GltI、GltK、GltJ和脯氨酸代謝相關(guān)蛋白的編碼序列。在碳源利用方面, 菌株YN12能利用的碳源更為豐富。

與菌株MMB相比, YN12基因組中含有脯氨酸、4-羥脯氨酸、組氨酸、賴氨酸降解相關(guān)基因,甲殼素、N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、D-半乳糖酸、D-葡萄糖酸、甘油、半乳糖、蔗糖等分解代謝相關(guān)基因, 擁有谷胱甘肽的生物合成和谷氨酰胺循環(huán)相關(guān)基因。而MMB基因組中含有的乳酸、尿素、苯甲酸分解基因, 輔酶B12、氰鈷胺素合成相關(guān)基因, 鉻酸鹽抗性蛋白ChrB、多重耐藥蛋白MarC、汞轉(zhuǎn)運蛋白MerT、蛋白質(zhì)加工修飾的G3E蛋白家族、CRISPR相關(guān)蛋白的編碼序列, 具有維生素B6降解途徑, 4-羥基苯乙酸分解代謝途徑, 酮己二酸途徑的兒茶酚分支等。相對而言, 菌株YN12在多糖利用方面較菌株MMB更為豐富, 可以利用淀粉(糊精)、幾丁質(zhì)及果膠等植物來源的大分子物質(zhì)。而后者對脂肪酸和酯的利用能力較強, 與BioLog分析結(jié)果相符合。

表2 Pseudoduganella eburnea YN12與喜樹脂動膠菌MMB中EPS合成相關(guān)基因簇表達產(chǎn)物的序列相似性Tab. 2 The gene products of the extracellular polymeric substances (EPS) biosynthesis gene cluster of Pseudoduganella eburnea YN12 strain and the predicted orthologues in the closely related proteobacterial genomes (the polypeptide sequence identity was shown)

2.6 不同水體中偽杜搟氏菌屬細菌的篩選

我們從安徽省阜陽市六里河和中國科學(xué)院水生生物研究所石首養(yǎng)殖基地水樣中分離到偽杜搟氏菌屬菌株F1和SS14, 16S rDNA序列鑒定分析結(jié)果顯示, 與P. eburnean10R5-21T相似度分別為99.4%和99.6%。平板培養(yǎng)的菌落及液體培養(yǎng)中形成的菌膠團均為白色(圖4)。與菌株YN12相同, 三者在R2A液體培養(yǎng)基中均能形成穩(wěn)定的菌膠團(生物絮團)。

生物絮團技術(shù)是近年來水產(chǎn)養(yǎng)殖中用以調(diào)控水質(zhì)的新型養(yǎng)殖模式, 但難以控制生物絮團中群落組成是目前存在的問題[16]。喜樹脂動膠菌MMB株分離于活性污泥中, 不能利用葡萄糖及多種單糖、淀粉和纖維素。與之相比, 象牙白偽杜搟氏菌不僅分布范圍更為廣泛, 我們從云南瀘西、湖北石首和安徽阜陽均分離到該種生物絮團形成菌, 且利用的碳水化合物種類較前者更為豐富(表3), 在養(yǎng)殖水體中, 可以更好的吸收利用生物絮團技術(shù)中常用的淀粉等碳源, 更有利于其存活和促進生物絮團的形成。

圖4 從不同水體中分離純化的象牙白偽杜搟氏菌菌膠團形成表型及顯微鏡圖Fig. 4 Floc-forming phenotype and microscopic observation of the Pseudoduganella eburnean strains isolated from different water bodies

3 討論

我們從云南省瀘西縣污水處理廠的活性污泥水樣中分離到一株菌膠團形成菌YN12, 經(jīng)16S rDNA序列分析鑒定與P. eburnean10R5-21T株親緣關(guān)系最近。通過全基因組測序發(fā)現(xiàn), 菌株YN12的基因組大小約為5934 kb, G+C含量為63.9%, 包含5313個編碼序列, 含有與喜樹脂動膠菌MMB株、解叔丁醇水居菌RN12株及解殼聚糖松江菌XHYA6株等菌膠團(生物絮團)形成菌相似的胞外聚合物合成相關(guān)基因簇。

近年來, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖中用以調(diào)控水質(zhì)的新型養(yǎng)殖模式生物絮團技術(shù)主要通過添加不同碳源調(diào)控水體中的碳氮比, 而施用生物絮團形成菌或絲狀菌直接調(diào)控生物絮團的微生物組成和結(jié)構(gòu)相關(guān)研究鮮少報道。該技術(shù)目前存在著難以控制生物絮團中菌群組成的問題[16]。為解決這一問題, 中國科學(xué)院水生生物研究所研究人員將我們所分離的活性污泥菌膠團形成菌喜樹脂動膠菌MMB株接種到魚類養(yǎng)殖試驗池中, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌未能在養(yǎng)殖池中大量繁殖[17]。我們認為很可能是所添加的碳源不能被該菌吸收利用進行生長的緣故。

菌株YN12相比于喜樹脂動膠菌MMB和解叔丁醇水居菌RN12, 所能吸收利用碳源特別是單糖、二糖和多糖更為豐富多樣(表1), 除了淀粉(糊精)以外, 該菌可以利用纖維二糖、龍膽二糖、蔗糖、甘露糖、半乳糖、幾丁質(zhì)(殼聚糖)單體N-乙酰-D-葡萄糖胺、N-乙酰-D-半乳糖胺等作為唯一碳源, 還可以利用果膠等植物來源的大分子多糖。此外, 從菌株YN12基因組注釋結(jié)果中發(fā)現(xiàn), 該菌擁有銨轉(zhuǎn)運體(Ammonium transporter)和谷氨酸和谷酰胺合成酶(Glutamate synthetase and glutamine synthetase)基因, 說明該菌可以吸收利用養(yǎng)殖水體中高濃度的銨離子并用來合成氨基酸和蛋白質(zhì), 進而形成生物絮團被魚類濾食、消化和吸收利用。同時, 我們從石首水產(chǎn)養(yǎng)殖水體和阜陽河流中也分離到象牙白偽杜搟氏菌SS14和F1菌株。因此菌株YN12及其同種近緣菌株可能更適合應(yīng)用于改善養(yǎng)殖水質(zhì)的生物絮團技術(shù)中, 可以加以利用來直接調(diào)控、促進生物絮團中菌群的組成, 提高資源循環(huán)利用和水質(zhì)凈化功能, 促進綠色養(yǎng)殖。

表3 Pseudoduganella eburnea YN12基于BioLog結(jié)果的碳源利用Tab. 3 Utilization of carbon source based on BioLog results of Pseudoduganella eburnea YN12