安勝欣， 李雨晴， 薛鳳洋， 馮承濤， 李文志*

(1.安徽理工大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，安徽 淮南 232001；2.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 工程科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230026)

化石能源潛在短缺及使用對(duì)環(huán)境造成的壓力，迫使人們尋求環(huán)保型可替代資源[1]。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)主要由碳水化合物(纖維素、半纖維素)和木質(zhì)素等組成，因存儲(chǔ)量大、可再生等特點(diǎn)引起了人們廣泛關(guān)注[2-4]。與風(fēng)能、太陽(yáng)能等可再生能源相比，生物質(zhì)資源具有無(wú)可比擬的優(yōu)越性，如既能轉(zhuǎn)化為燃料又可用于生產(chǎn)化學(xué)品，因此成為化石資源理想替代品。農(nóng)作物秸稈是一類(lèi)典型的木質(zhì)纖維素，我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，秸稈資源非常豐富。而我國(guó)秸稈的利用率較低，大部分直接焚燒容易污染環(huán)境。積極開(kāi)發(fā)秸稈的利用途徑，對(duì)降低環(huán)境污染和加強(qiáng)秸稈資源的有效利用具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

酶水解纖維素類(lèi)生物質(zhì)建立糖分子平臺(tái)，以此平臺(tái)為基礎(chǔ)進(jìn)一步生產(chǎn)生物基燃料和化學(xué)品是生物質(zhì)轉(zhuǎn)化利用的主要途徑之一[5-7]。但生物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜致密，尤其是木質(zhì)素的存在，使得秸稈直接酶解效率低，需經(jīng)過(guò)一定預(yù)處理才有效獲取糖分子建立糖分子平臺(tái)[8-9]。常用預(yù)處理方法有化學(xué)法、物理法、物理——化學(xué)法、生物法[10-12]。由于生物質(zhì)組分化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)差異，常規(guī)的一步預(yù)處理很難實(shí)現(xiàn)在大量脫除木質(zhì)素的同時(shí)而不引起糖的過(guò)度降解[13]。本文擬以玉米秸稈為原料，采用稀酸-堿濕法氧化兩步預(yù)處理，先用稀酸預(yù)處理回收半纖維素，再用堿濕法氧化脫除木質(zhì)素釋放纖維素，以纖維素酶水解纖維素獲取C6分子。通過(guò)兩步預(yù)處理，可實(shí)現(xiàn)C5和C6糖分子分步回收，兩步預(yù)處理后的廢液可相互中和，降低環(huán)境污染。本文考察堿濕氧化法中不同預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)酶解葡萄糖收率的影響，通過(guò)SEM、BET對(duì)預(yù)處理前后的樣品進(jìn)行表征，考察預(yù)處理對(duì)秸稈結(jié)構(gòu)的影響，為玉米秸稈的高效轉(zhuǎn)化利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

玉米秸稈來(lái)自安徽省蒙城縣；氨水、過(guò)氧化氫、鹽酸、硫酸、葡萄糖、木糖等試劑由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司提供，所用試劑均為分析純；纖維素酶由諾維信中國(guó)投資有限公司捐贈(zèng)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

機(jī)械攪拌釜(安徽科冪機(jī)械科技有限公司)；YC-068高速粉碎機(jī)(廣州市賽豪機(jī)械有限公司)；Waters液相色譜儀(沃特世科技(上海)有限公司)，Tristar II 2030M 全自動(dòng)比表面積及孔隙度分析儀(美國(guó)麥克儀器公司)，Genimi SEM 500場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(卡爾蔡司上海管理有限公司)等。

1.3 方法

1.3.1 原材料預(yù)處理 將收割的玉米秸稈自然風(fēng)干后，用粉碎機(jī)粉碎成小片段。將小片段玉米秸稈用自來(lái)水清洗去除灰塵及非秸稈類(lèi)雜質(zhì)，85 ℃烘箱烘干。烘干后樣品用高速粉碎機(jī)粉碎后過(guò)40目篩，置于干燥環(huán)境中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 稀酸-堿濕法氧化兩步預(yù)處理 以稀鹽酸預(yù)處理作為第一步用于脫除半纖維素回收木糖[14]。第二步采用堿濕法氧化法預(yù)處理，將第一步預(yù)處理后的殘?jiān)萌ルx子水沖洗至中性，放入機(jī)械攪拌釜中，加入一定量氨水過(guò)氧化氫溶液，在一定溫度下預(yù)處理一定時(shí)間。當(dāng)溫度達(dá)到設(shè)定溫度時(shí)開(kāi)始記時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)釜用自來(lái)水冷卻至室溫，抽濾回收固體殘?jiān)⒂萌ルx子水沖洗至中性用作下一步酶解反應(yīng)的原料?？疾祛A(yù)處理溫度、氨水濃度、預(yù)處理時(shí)間、過(guò)氧化氫用量對(duì)秸稈組分含量及殘?jiān)w維素酶解葡萄糖收率的影響。

秸稈纖維素酶解方法

1.3.3 酶水解 取5 mL EP管，加入干重為0.2 g的兩步預(yù)處理后的殘?jiān)?、一定量纖維素酶，補(bǔ)充含有抑菌劑的醋酸鈉-醋酸緩沖液使整個(gè)反應(yīng)體系總體積為4 mL。將離心管放入培養(yǎng)箱，50 ℃，120 rmp/min震蕩培養(yǎng)72 h。酶解反應(yīng)結(jié)束后，將固體和液體高速離心分離，濾液用0.22 μm微膜過(guò)濾后HPLC測(cè)定酶解葡萄收率。

1.3.4 分析方法樣品組分的測(cè)定 采用美國(guó)可再生能源實(shí)驗(yàn)室提供的方法進(jìn)行[15]。纖維素酶活力的測(cè)定采用濾紙酶活方法。

纖維素含量=C2/C1×100%

其中,C1為原料中纖維素的質(zhì)量；C2為預(yù)處理殘?jiān)w維素的質(zhì)量。

木質(zhì)素含量=M1/M2×100%

其中M1為原料中木質(zhì)素的含量；M2為預(yù)處理殘?jiān)举|(zhì)素的質(zhì)量。

酶解葡萄糖收率=E1/E2×100%

其中,E1為原料中葡萄糖的含量；E2為酶解得到的葡萄糖的含量。

1.3.5 表征方法 對(duì)預(yù)處理前后的樣品通過(guò)掃描電子顯微鏡(SEM)觀察預(yù)處理對(duì)樣品表觀形貌的影響，采用全自動(dòng)比表面積及孔徑分析儀分析樣品比表面積及孔隙率的變化，其中N2脫附條件為90 ℃脫氣30 min；孔體積測(cè)定采用單點(diǎn)測(cè)試法，即在P/P0=0.973時(shí)總孔體積。

2 結(jié)果與分析

2.1 秸稈組分

采用美國(guó)可再生能源實(shí)驗(yàn)室的方法進(jìn)行測(cè)定，玉米秸稈各組分的含量分別為：纖維素33.9%、半纖維素22.5%、阿拉伯聚糖2.9%、半乳糖1.3%、木質(zhì)素20.5%、抽提物9.8%、灰分4.1%及其他5.0%。結(jié)構(gòu)組成表明，玉米秸稈含有的主要組分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。纖維素為葡萄糖聚合物，半纖維素主要由木糖構(gòu)成，在研究中以葡聚糖和木聚糖的收率來(lái)代表組分中纖維素和半纖維素含量的變化以及酶解效果。

2.2 稀酸預(yù)處理對(duì)組分及酶解葡萄糖收率的影響

稀酸預(yù)處理是水解半纖維素常用方法，可在較溫和條件下實(shí)現(xiàn)半纖維素有效水解。根據(jù)本課題組研究，相比于硫酸，鹽酸更適合用于木質(zhì)素脫除[16]。研究采用1 wt%HCl、120 ℃預(yù)處理玉米秸稈40 min，考察預(yù)處理前后玉米三大組分的變化，以及對(duì)酶解收率的影響(圖1)。

圖1 稀酸預(yù)處理對(duì)組分a及酶解葡萄糖收率的影響

從圖1可知，在設(shè)定的預(yù)處理?xiàng)l件下殘?jiān)邪肜w維素保留率變化最大，83.1%木聚糖可回收；纖維素和半纖維素保留率變化不大，符合預(yù)處理的要求。對(duì)酸預(yù)處理前后的樣品酶解，酶用量為3 FPU/g，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，與原料相比，預(yù)處理后的樣品葡萄糖收率從23.1%增加到37.2%。這歸因于，秸稈基質(zhì)結(jié)構(gòu)致密直接酶解效率較低，酸預(yù)處理后隨著半纖維素脫除，秸稈的基質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，酶解效率提高，糖收率增加。

2.3 H2O2用量對(duì)酶解葡萄糖收率的影響

將稀酸預(yù)處理后殘?jiān)?，先用去離子水沖洗至中性，抽濾后用于下一步氨水過(guò)氧化氫預(yù)處理。在110 ℃、40 mL 25～28%氨水過(guò)氧化氫溶液、預(yù)處理時(shí)間為30 min條件下，考察不同過(guò)氧化氫用量對(duì)隨后酶解葡萄糖收率的影響(H2O2用量是以所用H2O2占整個(gè)反應(yīng)體系的體積來(lái)計(jì)算)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可以看出，隨著氨水中過(guò)氧化氫用量增加，殘?jiān)欣w維素的含量大于86%，說(shuō)明在設(shè)定實(shí)驗(yàn)條件下，氨水過(guò)氧化氫濕法預(yù)處理對(duì)纖維素的影響較小，這符合預(yù)處理的要求，預(yù)處理后可以盡可能多的保留纖維素為后續(xù)酶解提供充足原料。隨著H2O2用量增加，木質(zhì)素脫除率從86.4%增加到89.5%，酶解葡萄糖收率從44.3%增大到80.6%。這說(shuō)明過(guò)氧化氫用量的增加雖對(duì)木質(zhì)素的脫除影響不大，但對(duì)后續(xù)酶解性能影響較大。這可能歸因于木質(zhì)素脫除及半纖維素的脫除對(duì)殘?jiān)|(zhì)結(jié)構(gòu)的影響也會(huì)影響纖維素酶的酶解效率，而這種影響有利于酶解效率的提高。由圖可知隨著過(guò)氧化氫用量提高，殘?jiān)衅暇厶潜Ａ袈食氏陆第厔?shì)，綜合考慮將6.0%H2O2作為后續(xù)反應(yīng)過(guò)氧化氫的用量。

圖2 H2O2用量對(duì)酶解糖收率的影響

2.4 氨水濃度對(duì)酶解葡萄糖收率的影響

在110 ℃、6.0%H2O2、30 min、氨水過(guò)氧化氫體系體積為40 mL條件下，考察不同氨水質(zhì)量分?jǐn)?shù)(1.0%、7.3%、10.9%、18.3%)對(duì)后續(xù)酶解葡萄糖收率的影響(氨水用量是以所用氨水量占整個(gè)反應(yīng)體系的體積來(lái)計(jì)算)，結(jié)果見(jiàn)圖3。隨著氨水用量增加，殘?jiān)衅暇厶呛坑行》冉档?，但依然保持?3%以上，說(shuō)明在本研究采用條件下，纖維素結(jié)構(gòu)穩(wěn)定并未出現(xiàn)大量的降解。由圖3看出，隨著氨水用量增加，木質(zhì)素脫除率從57.8%提高到86.4%有明顯上升趨勢(shì)，同時(shí)酶解葡萄糖收率有顯著增加，由44.5%上升到58.5%。這可以從氨水濕法氧化作用機(jī)理來(lái)解釋?zhuān)涸趬A性環(huán)境中(pH>11.5)，過(guò)氧化氫會(huì)分解成高活性離子(HO·、O2-·、HOO-)，這些高活性離子通過(guò)進(jìn)攻木質(zhì)素側(cè)鏈基團(tuán)將大片段木質(zhì)素氧化降解成小片段，加速木質(zhì)素脫除。本文所選氨水用量所對(duì)應(yīng)pH分別為10.8、11.8、12.8和12.8，隨著反應(yīng)體系中pH增大，過(guò)氧化氫分解產(chǎn)生的活性離子量增大，堿氧脫木質(zhì)素作用增強(qiáng)，木質(zhì)素脫除率增加。隨著木質(zhì)素脫除量增加，再加上第一步半纖維素的脫除，秸稈的基質(zhì)組分被破壞，阻擋纖維素酶屏障作用消除或者減弱，纖維素酶的作用位點(diǎn)增加，纖維素的水解效率增強(qiáng)。由圖3還可看出，隨著氨水用量增加，纖維素的剝皮反應(yīng)作用增強(qiáng)，殘?jiān)欣w維素保留率呈下降趨勢(shì)，綜合考慮將18.3%作為后續(xù)反應(yīng)氨水用量。

圖3 氨水濃度對(duì)酶解糖收率的影響

2.5 預(yù)處理溫度對(duì)酶解葡萄糖收率的影響

在18.3% 氨水用量、6.0%的H2O2、30 min，氨水過(guò)氧化氫體系體積為40 mL，考察不同預(yù)處理溫度對(duì)隨后酶解葡萄糖收率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。提高預(yù)處理溫度，木質(zhì)素脫除量從59.4%增加到88.5%，酶解葡萄糖收率從49.4%增加大64.7%。這主要是因?yàn)殡S著預(yù)處理溫度升高，過(guò)氧化氫分解的高活性離子反應(yīng)性增強(qiáng)，堿氧脫木質(zhì)素反應(yīng)速率加快，致使更多木質(zhì)素脫離基質(zhì)，殘?jiān)心举|(zhì)素含量逐漸變小。隨著木質(zhì)素和半纖維素脫離秸稈機(jī)體，秸稈的基質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，阻止纖維素酶物理屏障消失或減弱，更多纖維素暴露出來(lái)，纖維素酶的可及性增加，酶解葡萄糖收率增加。由圖4可知，隨著溫度升高，纖維素含量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這是由兩個(gè)方面引起的，一是隨著預(yù)處理溫度升高，堿性條件下纖維素剝皮反應(yīng)速率增加，部分纖維素降解；二是由于溫度升高，堿過(guò)氧化氫產(chǎn)生的高活性離子量增加，這些高活性離子攻擊纖維素官能團(tuán)引起纖維素氧化降解。綜合考慮選用130 ℃作為后續(xù)預(yù)處理溫度。

圖4 預(yù)處理溫度對(duì)酶解糖收率的影響

2.6 預(yù)處理時(shí)間對(duì)酶解葡萄糖收率的影響

在130 ℃、 6%過(guò)氧化氫用量、18.3% 氨水用量，氨水過(guò)氧化氫體系體積為40 mL，考察不同預(yù)處理時(shí)間對(duì)隨后酶解葡萄糖收率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5看出，延長(zhǎng)預(yù)處理時(shí)間，木質(zhì)素脫除量明顯增大，從75.4%增加到88.5%；當(dāng)從20 min延長(zhǎng)到30 min，纖維素殘?jiān)附馄咸烟鞘章曙@著增加，從55.8%增加到65.7%，再延長(zhǎng)時(shí)間，變化不明顯。這歸因于隨預(yù)處理時(shí)間延長(zhǎng)，堿氧脫木質(zhì)素反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，更多木質(zhì)素脫離基質(zhì)，殘?jiān)心举|(zhì)素含量降低，生物質(zhì)基質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，殘?jiān)懈嗬w維素暴露出來(lái)，纖維素酶作用位點(diǎn)增加，酶解效率增加，葡萄糖收率增加。再延長(zhǎng)時(shí)間，木質(zhì)素脫除率雖在增加，但木質(zhì)素脫除到一定程度后木質(zhì)素脫除對(duì)酶解性能影響減弱[17]，所以預(yù)處理時(shí)間從30 min延長(zhǎng)至60 min，酶解葡萄糖收率變化趨于緩和。由圖5可知，隨著預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，殘?jiān)欣w維素的含量逐漸下降，這是因?yàn)檠娱L(zhǎng)預(yù)處理時(shí)間，在堿氧環(huán)境中，纖維素氧化降解和剝皮反應(yīng)的時(shí)間延長(zhǎng)，致使纖維素發(fā)生部分降解。綜合考慮，30 min作為合適預(yù)處理時(shí)間。

圖5 時(shí)間對(duì)酶解葡萄糖收率的影響

2.7 表征分析

采用SEM考察預(yù)處理對(duì)玉米秸稈表觀形貌的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可以看出，原料表面光滑、致密，纖維素酶不容易進(jìn)入基質(zhì)內(nèi)部，導(dǎo)致直接酶解葡萄糖收率低。預(yù)處理后樣品表面粗糙、孔隙增多，并且有碎片從表面脫落，這是由于秸稈組分半纖維素、木質(zhì)素的脫除引起的，表觀形貌的改變可以增大纖維素與纖維素酶接觸的機(jī)會(huì)，使得酶解效率增加。

圖6 預(yù)處理前后樣品的SEM圖像(a 未處理；b 預(yù)處理后)

通過(guò)全自動(dòng)比表面積及孔徑分析儀分析預(yù)處理前后樣品的比表面積及孔隙變化，考察預(yù)處理對(duì)樣品結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，與原料相比，預(yù)處理后的樣品比表面積增大到1.567 5 m2/g，孔體積增加到0.003 1 cm3/g，表明預(yù)處理后由于半纖維素和木質(zhì)素脫除，秸稈基質(zhì)的致密的結(jié)構(gòu)被破壞，預(yù)處理樣品的比表面積及孔體積增加。殘?jiān)缺砻娣e和孔體積的增加會(huì)為后續(xù)水解的纖維素酶創(chuàng)造更多的活性位點(diǎn)，纖維素酶的可及性增大，酶解效率增強(qiáng)。

表1 預(yù)處理前后樣品的比表面積及孔體積

注：a.兩步預(yù)處理?xiàng)l件：HCl預(yù)處理120 ℃、40 min、1%HCl、料液比1∶10 g/mL；氨水過(guò)氧化氫預(yù)處理?xiàng)l件為：6%過(guò)氧化氫用量、18.3% 氨水用量、130 ℃、40 min；b.用N2吸附法測(cè)定比表面積。

3 結(jié)論與討論

采用稀酸-氨水過(guò)氧化氫兩步預(yù)處理玉米秸稈，先通過(guò)稀鹽酸預(yù)處理回收半纖維素，再通過(guò)堿氧預(yù)處理脫除木質(zhì)素，使得后續(xù)殘?jiān)附庑试鰪?qiáng)?？疾炝祟A(yù)處理時(shí)間、溫度、氨水用量、過(guò)氧化氫用量對(duì)酶解性能的影響。研究發(fā)現(xiàn)，隨著預(yù)處理?xiàng)l件增強(qiáng)，木質(zhì)素脫除率增加，纖維素酶解葡萄糖收率增大，但是過(guò)于苛刻的條件會(huì)引起纖維素的降解。通過(guò)SEM、BET表征發(fā)現(xiàn)，酶解性能的提高歸因于預(yù)處理引起玉米秸稈基質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，表面變的粗糙、孔隙增多、且有小片段脫落，秸稈的比表面積和孔體積增大，纖維素酶的可及性及作用位點(diǎn)增多。在本研究設(shè)定條件下，1 wt% HCl預(yù)處理、120 ℃預(yù)處理40 min、料液比1∶10 g/mL可回收83.1%木糖；氨水過(guò)氧化氫預(yù)處理?xiàng)l件為：130 ℃、6%過(guò)氧化氫用量、30 min、18.3wt%氨水、3 FPU/g酶用量下得到65.7%葡萄糖，實(shí)現(xiàn)了低酶用量下較高的糖收率。